Name: Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer FISH-visualisatie van individuele mRNA-moleculen in Saccharomyces cerevisiae voor transcriptieregulatieonderzoek. Deze methode kwantificeert transcriptlokalisatie en halfwaardetijden in enkele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies GM046406 (DB) en door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen Centrum voor Quantitative Biology (GM071508). RSM erkent financiering van de NSF Graduate Research Fellowship. MNM wordt ondersteund door een Lewis-Sigler Fellowship. We willen graag de leden van de Botstein lab erkennen voor behulpzaam discussies en de voormalige leden Allegra Petti en Nikolai Slavov voor hun bijdragen aan het metabole cyclus project. Wij danken Daniel Zenklusen en Robert Singer voor het krijgen van ons begonnen met de FISH-methode.

Figuren 1 en 2 zijn schema&#39;s van de FISH experimentele procedures en beeldanalyse pijpleiding voor FISH kwantificering afbeeldingen. 1. Oplossingen voor te bereiden * Onderstaande oplossingen zijn voor gebruik met Singer sondes. Bij gebruik Stellaris sondes, vervang &quot;40% formamide&quot; met &quot;10% formamide&quot; in zowel Hybridisatiebuffer en Wash Buffer. Aanvullende wijzigingen aan Hybridisatiebuffer bij het gebruik Stellaris sondes zijn (1) voeg 1 g dextransulfaat en (2) zijn exclusief 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffer 890 ul buffer B 100 gl VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 pl β-mercaptoethanol &lt;strong&gt; hybridisatiebuffer (10 ml, eindvolume) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC voorraad 40 ui van 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 10 ml eindvolume) 1 g Dextran Sulfate * * Hybridization Buffer kan in 0,5 ml aliquots gemakshalve worden bewaard bij -20 ° C. Wash Buffer (50 ml, eindvolume) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 50 ml eindvolume) Labeling Buffer 1.06 g Natrium Carbonaat 100 ml DEPC Water pH 9 2. Probe-labeling (Singer Probes Only) We krijgen deze probes door in-house-synthese met behulp van een ABI oligonucleotidesynthese apparaat. Typically worden 4-5 ~ 50 bp gesynthetiseerde oligonucleotiden die homoloog zijn aan het gen van belang, vervangende amino-allyl thymidine meerdere thymidinen afstand ten minste 8, bij voorkeur 10 bp + elkaar. Vanwege hun gevoeligheid voor ozon, werken we in een ozon-free voorziening bij het gebruik van CY kleurstoffen. <ol><li> Verkrijgen ~ 5 sondes en resuspendeer in 100 pl water - check concentraties op Nanodrop. </li><li> Afhankelijk van het aantal probes / gen gecombineerd totaal van 10 ug oligonucleotiden / gen (bijvoorbeeld als probes zijn 5 / gen, dan wil 2 ug / probe). </li><li> Gebruik QIAquick kolommen probes zuiveren volgens QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. </li><li> Voeg 10 volumes buffer PN het volume van gecombineerde probes en meng totaal. </li><li> Toepassing monster te QIAquick column - als totale volume groter is dan 750 ul, spin down tweemaal met de helft van het volume in elke spin </li><li> Laat staan ​​voor 1 min. </li><li> Centrifugeer 1 min bij 6000 rpm. </li><li> Wassen met 750 ul buffer PE. </li><li> Centrifuge1 min bij 6000 rpm. </li><li> Gooi doorstroming en opnieuw spinkolom gedurende 1 min bij 13.000 rpm te drogen. </li><li> Column plaats QIAquick in nieuwe microcentrifugebuis en elueer DNA met 50 ul H 2 O - Zorg dat H 2 O pH is binnen 7.0 en 8.5 en is direct geplaatst op membraan. </li><li> Laat staan ​​voor 1 min. </li><li> Centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 rpm om DNA te elueren. </li><li> Lyofiliseren DNA bij 45 ° C. </li><li> Resuspendeer pellet in 10 ul etikettering buffer en voeg aan buis van kleurstof zonder het aanraken van de kleurstof. </li><li> Herhalen met een andere 10 pl labeling buffer. </li><li> Vortex en spin down tube kleurstof en DNA. </li><li> Bedek buizen met aluminiumfolie en in het donker bewaren bij RT O / N te labelen. </li><li> Herhaal QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Voeren met twee verschillen: - Voeg 200 ul PN buffer om sondes en zet gelabelde probes door kolommen 2x. - Voer 3 wassingen met buffer PE om weg te wassen alle losse kleurstof voor elutie. </li><li> After elutie verkrijgen concentratie via nanodrop. De etikettering efficiëntie is meestal ~ 0.25 pmol / ng enkelstrengs DNA. </li></ol> 3. Dekglaasje Voorbereiding <ol><li> Plaats dekglaasjes op dia&#39;s in plasma-preen vacuümkamer ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (hoe dichter bij het ​​centrum hoe beter). </li><li> Zet vacuümkamer magnetron en zorg ervoor dat het is verzegeld. </li><li> Schakel de pomp eerst zet vacuüm slechts eenmaal pomp wordt gestart. </li><li> Zet magnetron en stop 5 seconden na plasma zichtbaar. </li><li> Schakel vacuüm dan pomp. </li><li> Trek vacuümkamer en dekglaasjes te verwijderen met een pincet (degenen die zijn gevallen opnieuw moeten worden gereinigd). </li><li> Plaats dekglaasjes schoongemaakt kant op in 12-well platen. </li></ol> 4. Fixatie Procedure <ol><li> Groeien gist om een OD 600 van ongeveer 0,1-0,2 in minimale media. 10 ml cellen levert voldoende for ~ 10 aparte kruisingen. </li><li> Voeg 1/10 volume 37% formaldehyde rechtstreeks aan de groei media (10 ml van de cultuur + 1 ml 37% formaldehyde) en laat zitten voor 45 minuten. </li><li> 2x wassen met 1 ml ijskoude buffer B in een microcentrifugebuis (kan draaien bij 13.000 rpm gedurende 1 minuut). </li><li> Voeg 1 ml van spheroplasting buffer. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Controleer cellen elke paar minuten onder de microscoop tot de meeste cellen zijn zwart (dus niet fase-fel). </li><li> Wassen 2x met ijskoude buffer B, spinnen bij een lage snelheid (~ 3500 rpm). </li><li> Voeg 1 ml 70% EtOH, resuspendeer zacht en laat overnacht bij 4 ° C (kan oneindig bewaard bij -20 ° C). </li></ol> 5. Hybridisatie Procedure <ol><li> Bereid de hybridisatieoplossing: 100 gl hybridisatiebuffer, voeg 1-3 ui sonde, dan vortex en centrifuge. Zanger sondes gebruiken 8-10 ng totaal per probe set (dwz per gen). We hebben gelijktijdig belicht tot 3 genen met 3 diflende gemerkte probe sets. </li></ol> Zorg ervoor dat de hybridisatie-oplossing op kamertemperatuur komen alvorens het te openen. Voor Stellaris sondes wordt aanbevolen om 4 aparte hybridisatiereacties beginnen met het toevoegen van 1 pl elk van 1:10, 1:20, 1:50 en 1:100 werkverdunningen van probes om te zien welke optimaal is. Werkverdunningen van Stellaris probes worden bereid in hybridisatie buffer. <ol start="2"><li> Centrifuge (voor alle volgende stappen, 3500 rpm, 5 min) van de vaste cellen (bv. 200 pl) en zuig weg van de ethanol. </li><li> Voorzichtig hersuspenderen in 1 ml wasbuffer die hetzelfde percentage formamide de hybridisatie buffer bevat. Laat staan ​​voor 2-5 minuten. </li><li> Centrifugeer monster en aspireren wasbuffer, voeg dan hybridisatie-oplossing. Incubeer in het donker met zacht schudden, O / N bij 37 ° C. </li></ol> Opmerking: de volgende procedure is voor het aanbrengen / beeldvorming cellen op dekglaasjes. Voor wverassen / beeldvorming cellen in 96-well platen, waaronder alternatieve reactieve zuurstofradicalen scavenger oplossing zien <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> De volgende dag, of vooraf schoon (zie werkwijze) en behandel dekglaasjes met 150 ul 0.01% Poly-L-Lysine gedurende 5 minuten. Aspireren, laten drogen, wassen 3x met dH 2 O en laat drogen. </li><li> In de ochtend, voeg 1 ml wasbuffer aan het monster voorzichtig resuspenderen, centrifuge en zuig vervolgens hersuspenderen in een 1 ml wasbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Wassen met 2X SSC + 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur 15 min te shaker. </li><li> Neem montage medium uit vriezer om deze te komen tot kamertemperatuur voor de montage. </li><li> Wassen met 1X SSC bij RT 15 min. op shaker. </li><li> Verdun DAPI in PBS (0,1 ug / ml eind) en resuspendeer cellen in 150 pi. </li><li> Plaats oplossing op gereinigd / poly-lys-Treated dekglaasjes in 12-well plaat; minstens 30 minuten ongestoord. </li><li> Verwijder oplossing (u kunt het op een reserve dekglas als back-up) en was 3x met 1 ml 1X PBS. </li><li> Plaats 3 pi Verleng Gold montage medium op een dia (Invitrogen P36934). Doe dit een voor een als u meerdere dekglaasjes te voorkomen dat ze uitdrogen van montage medium. </li><li> Voeg ~ 0,5 ml ethanol te dekglaasje in 12-well plaat, verwijder het deksel slip en lucht drogen terwijl het houden met een pincet. </li><li> Plaats dekken slip cel-kant naar beneden op montage medium en laat uitharden enkele uren of O / N in het donker. </li><li> Dicht de randen met nagellak en ga verder met beeldvorming. </li></ol> 6. Beeldvorming van Cellen met Olympus IX-81 Omgekeerde Microscoop Overzicht <ol><li> Voor het verwerven benutten we Slidebook (intelligent-imaging.com) software en een 100X, 1,45 NA, TIRFM olie doelstelling. Voor seriële GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 en Cy5 beeldvorming: Chroma filter sets (zie reagentia). </li><li> Gebruik DAPI filterte vinden en te concentreren cellen. </li><li> Stel deze als referentiepunt. </li><li> Neem een ​​z-stack van beelden rond het referentiepunt wanneer de totale afstand is 5 uM met 0,2 uM grootte (25 vliegtuigen). Herhaal dit voor elke kleurstof kanaal (dwz elke probe set). </li><li> Exporteren als een 16-bits TIFF voor beeldanalyse. </li></ol> 7. Image Analysis Overzicht (Singer Probes) Hieronder geven we een overzicht van computationele methoden die we gebruiken voor het analyseren van FISH afbeeldingen in MATLAB. De desbetreffende MATLAB functies gebruikt worden tussen haakjes aan de rechterkant. De algoritmes en drempels worden momenteel afgestemd op gegevens van Singer stijl sondes. Met behulp Stellaris stijl sondes zal enige aanpassing, met name voor de laatste filtering stap (7.8) nodig. Cell 15 Identificatie <ol><li> Afzonderlijke cellen van achtergrond met behulp van een algemene drempel op DAPI beelden 16 [graythresh]. </li><li> Identificeer kernen met behulp van uitgebreide maxima functie [imextendedmax]. </li><li> Segment cellen met kernen als zaden voor een waterscheiding algoritme [waterscheiding]. </li></ol> Vindplaatsen in elke fluorescentiekanaal <ol start="4"><li> Voeren tophat transformatie naar achtergrond normaliseren en signaal te verbeteren ruisverhouding [bwmorph]. </li><li> Zoek maxima aan de in-focus laag (in de z-vlak) te identificeren voor elke spot [imregionalmax]. </li><li> Filteren potentiële plekken met een lineaire fit model om een ​​radiaal verloop. </li></ol> Maatregel spot intensiteit en filter enkelvoudige versus meervoudige sonde signalen <ol start="7"><li> Monteer een 2D Gaussiaans profiel naar de plek in de eerder geconstateerde in-focus laag en raming intensiteit 17. </li><li> Filteren op zwakke plekken met een drempel (op basis van histogram). Voor Singer soort probes is dit belangrijk, maar is minder voor Stellaris sondes. </li><li> Telling spots in elke cel. </li></ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378(1969).</li>
<li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912(1970).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li>
<li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li>
<li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li>
<li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li>
<li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li>
<li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Cell segmentation | Steve on Image Processing [Internet]. , The MathWorks, Inc.. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://blogs.mathworks.com/steve/2006/06/02/cell-segmentation/">http://blogs.mathworks.com/steve/2006/06/02/cell-segmentation/</a> (2006).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li>
<li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li>
<li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Tot op heden heeft FISH primair is een low-throughput-methode. Het gebruik van Cy3, Cy3.5, Cy5 kleurstoffen en beperkt het aantal genen kan onderzoeken enkelvoudige cellen tot drie tegelijk. Sommige extra probes ontwikkeld (Stellaris) maar het aantal onderscheiden probes nog maximaal zeven. Om deze beperking te omzeilen, hebben combinatorische etikettering strategieën door middel van meerdere fluoroforen gebruikt om barcodes voor verschillende mRNA moleculen 19,20 creëren. Meest recent, Lübeck en Cai gebruikte optische en spectrale barcoding om 32 verschillende soorten tegelijk te kwantificeren met FISH in enkele gistcellen 19. Een beperking van deze recente combinatoriële benadering vereist het gebruik van superresolutietechnieken. De analyse nodig barcode probes onderscheiden is vrij complex. Wij hebben gevonden dat Cy3 en Cy3.5 de voorkeur om Cy5 voor FISH experimenten. Een van de beperkingen van de Cy5 kleurstof de gevoeligheidaan fotobleken. Echter, heeft Stellaris recent ontwikkelde Cy5 varianten die worden aangeboden als beter bestand tegen photobleaching, en kan deze technische kwestie te verlichten. Ook vermeldenswaard dat FISH is een dure methode te implementeren en dat zowel Singer en Stellaris sondes meestal kost $ 700 - $ 1.000 per probe set, hoewel de prijzen voor commercieel beschikbare sondes moeten afnemen in de toekomst. Sparen van reagentia en efficiënte etikettering brengt Singer sondes naar de lagere variëren in prijs. Een van de grote technische uitdagingen is de scheiding van enkelvoudige versus meervoudige sondespots, die de uitvoering van geavanceerde algoritmes spot-bepaling vereist. Dit kan uitgebreide handmatige nemen om beeldanalyse parameters afstemmen voor specifieke experimentele opstellingen. Een overzicht van onze computationele pijplijn met relevante MATLAB functies is te vinden in hoofdstuk 7 van het protocol. Dit probleem wordt enigszins verlicht door de Stellaris sondes die slechts<html> een label per sonde. Het vereist dan ook de colocalization van meerdere sondes om een ​​signaal te zien. Omdat FISH noodzakelijk vaststelling cellen, maakt het niet gemakkelijker bijhouden van individuele cellen in de tijd. Voorheen FISH snapshot data gebruikten we om de dynamiek van genexpressie te reconstrueren in individuele metabolisch fietsen gist bevolking 6. Metabole fietsen wordt waargenomen in pre-uitgehongerd continue culturen, en wordt gekenmerkt door de gehele bevolking collectieve oscillaties in zuurstofconsumptie. Deze trillingen worden geassocieerd met genoom-brede oscillaties van transcripten die liggen voor de helft van gist genen in verschillende fasen van zuurstofverbruik. We zochten om te bepalen of metabole fietsen aanwezig in niet-gesynchroniseerde continue gistculturen was. Indien aanwezig moet transcripten die anti-gecorreleerd synchrone populaties ook anti-gecorreleerde in gesynchroniseerde afzonderlijke cellen en vice versa voor gecorreleerde transcripten. ent &quot;&gt; Naar dynamiek van mRNA productie tijd reconstrueren moeten de geobserveerde momentopname gegevens worden vergeleken met wat wordt verwacht van een model van het onderliggende gedrag. zijn theoretische beperkingen wanneer dergelijke&quot; snapshots &quot;van genexpressie gegevens worden bepaald de onderliggende genexpressiedynamica en welke soorten modellen onderscheiden 21. Voor de metabole cyclusgegevens, in plaats van direct met de aanwezigheid van tijdelijke schommelingen, werden statistische metingen uitgevoerd onderbouwen dat er inderdaad een cel autonoom oscillerende programma in overeenstemming met bulk microarray metingen.

Met behulp bulk meettechnieken, is het niet mogelijk om het assay aantal transcripten of transcriptionele activiteit in afzonderlijke cellen 1. Gebruik van fluorescente proteïnen gedreven door promoters plaats als reporters van genexpressie kan dit probleem tot op zekere hoogte, maar de tijd die fluorescerende eiwitten vouwen verduistert vroeg dynamiek. Langlevende fluorescente proteïnen kunnen evenmin mRNA levens melden. De FISH werkwijze kan worden gebruikt om mRNA assay gedurende de volledige levenscyclus van transcriptie-initiatie in de kern van latere rijping en bederf in enkele cellen, met enkele molecule resolutie. Het origineel in situ experimenten visualiseren gebruikte nucleïnezuren radioactief gemerkt RNA probes DNA elementen sonde. Deze omvatten het visualiseren van ribosomaal DNA in de eierstokken van de kikker Xenopus laevis 2 en satelliet-DNA in de muis weefsel 3. De eerste fluorescente in situ expertiserimentele gebruikt een RNA-molecuul gemerkt met een fluorofoor bepaalde DNA-sequenties sonde 4. De eerste toepassing van fluorescerende probes voor het visualiseren RNA in situ werd de visualisatie van actine genexpressie in kip spierweefsel cultuur 5. Meer recent, in gist, FISH is gebruikt om oscillaties te onderzoeken transcriptie tijdens de gist metabolische cyclus 6, het verval van mRNA in celcyclusprogressie 7 en ruimtelijke lokalisatie van mRNA transcripten tijdens mitose 8. FISH is gebruikt in gist te laten zien dat niet-gecorreleerde fluctuaties in constitutief getranscribeerd genen, die vormen meer dan de helft van alle gist genen, ontstaan ​​uit niet-gecorreleerde transcriptie initiatie 9. In niet-gistsoorten, is FISH gebruikt om stamcellen markers in de muis darm 10 is en te bepalen dat onvolkomen van celtypes kunnen voortvloeien uit stochastische genexpressie fluctuaties in C.elegans embryo 11. De FISH werkwijze beschreven werkt door het hybridiseren kleurstof gemerkte enkelstrengs DNA probes om berichten mRNA. Cellen worden afgebeeld en mRNA&#39;s worden geteld met behulp van een spot-detectie algoritme. Enkelstrengs probes kunnen worden gegenereerd met een DNA synthesizer en vervolgens gemerkt (hier aangeduid als Singer probes) of bestelde commercieel als pre-gelabelde probes (Stellaris probes) 12,13. Een belangrijk verschil tussen de Singer Stellaris probes is dat de Singer probes langer (-50 bp) en zijn multi-gemerkte terwijl de Stellaris probes zijn kort (-20 bp) met slechts een label per probe, zoals beschreven door Raj et al. 14. Bovendien, de Stellaris benadering gebruikt veel meer probes per gen dan Singer (~ 30 versus 5 probes per gen respectievelijk). Hieronder geven we een protocol dat het gebruik van elk soort probe beschreven. In hoofdstuk 2 geven we een protocol voor het labelen van amino-allyl thymidine-bevattende probes wet een gekozen Cy kleurstof. Een overzicht van de computationele stappen die nodig zijn om enkel mRNA plekken te identificeren is voorzien in paragraaf 7.

<table><tbody><tr><td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Roche</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA (RNase free)</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto–thanol</td><td>Fisher</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, dilactate</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X (RNase free)</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Shelton Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td>Of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>Formamide (de-ionized)</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>158968</td><td>Voor GLOX oplossing</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>Voor GLOX oplossing</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3155</td><td>Voor GLOX oplossing</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine (0.01%)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Warner Instruments</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>FISH Probes</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Aangepaste bestelling voor uw gewenste mRNA sequentie</td></tr><tr><td>Glasbodem 96-wells platen</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>Alternatief voor dekglasjes</td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Cy3, Cy3.5, Cy5 kleurstoffen</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>monofunctionele NHS-ester</td></tr><tr><td colspan="4">APPARATUUR</td></tr><tr><td>Plasma-Preen I Cleaner</td><td>Terra Universal</td><td>9505-00</td><td>Controller (Cat #9505-17 optioneel)</td></tr><tr><td>Vacuumpomp</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td><td>Voor het bedienen van Plasma-Preen</td></tr><tr><td>Widefield Fluorescerende Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>100X objectief</td><td>Olympus</td><td>1-UB617R</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>X-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>Of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Filter Sets</td><td>Chroma</td><td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde CCD of EMCCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie en analyse van mrna moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

De fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze kan men nucleïnezuren te detecteren in de natieve cellulaire omgeving. Hier geven we een protocol voor het gebruik van FISH met het aantal van mRNA te kwantificeren in enkele gistcellen. Cellen kunnen worden gekweekt in een toestand van rente en daarna gefixeerd en maakte doorlaatbaar. Vervolgens worden meerdere enkelstrengs deoxyoligonucleotiden geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen gebruikt voor het merken en zichtbaar mRNAs. Buigingsbegrensde fluorescentie uit een mRNA-moleculen wordt gekwantificeerd met behulp van een spot-algoritme het aantal mRNA per cel te identificeren en te tellen. Terwijl de meer standaard kwantificering van Northern blots, RT-PCR en genexpressie microarrays informatie gemiddeld mRNA in de massapopulatie, FISH maakt zowel het tellen en lokalisatie van deze mRNAs in enkelvoudige cellen bij single-molecule resolutie.

Figuur 3 toont typische histogrammen berekend uit FISH beeld en gebruikt om het aantal mRNAs aanwezig in enkele cellen te bepalen. Een belangrijk voordeel van microscopie-gebaseerde RNA kwantificering is dat informatie over de lokalisatie van de transcripten kan vinden. Zo gebruikten we FISH om mRNAs in enkelvoudige cellen te identificeren met een induceerbare CBF1 allel (Figuur 4). Omdat veel mRNA moleculen op de plaats van transcriptie zijn wij in staat om de aanwezigheid en locatie van transcriptie locaties binnen de kern te identificeren. Door gebruik van verschillende kleurstoffen label mRNAs van verschillende genen, kan men meerdere mRNA species kwantificeren in dezelfde cellen. Om dit te demonstreren, werden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van α-factor en sorbitol. FUS1 transcriptie (Quasar670 kleurstof rood) wordt geïnduceerd door α-factor. STL1 transcriptie (Quasar 570 kleurstof, groen) wordt veroorzaakt door een toename in extracellulaire osmolariteit ( <strong&gt; Figuur 5). Figuur 4 is een voorbeeld van FISH met probes Singer. Figuur 5 is een voorbeeld van FISH met Stellaris probes. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van FISH experimentele procedure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische voorstelling van beeldanalyse pijplijn. De laatste plekken zijn bepaald in de meest rechtse figuur. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figuur 3. Histogram van spot intensiteiten voor een bepaald gen met behulp van Singer sondes </strong&gt;. Probe intensiteiten worden berekend zowel binnen (rood) en buiten (blauwe) cellen. Lage intensiteit plekken zijn ofwel ruis of enkele sondes. Real mRNA berichten worden gelabeld met meerdere sondes. Bij het gebruik van Stellaris sondes, enkele sondes zijn minder detecteerbaar en dus de drempels en filtering moeten dienovereenkomstig worden aangepast. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve resultaten van Singer FISH procedure. In dit experiment wordt CBF1 transcriptie geactiveerd met een induceerbare promoter 18. Kernen zijn blauw gekleurd met DAPI. CBF1 mRNA&#39;s zijn voorzien van tag met Cy3-gelabelde probes. Witte pijlen wijzen op de aanwezigheid van CBF1 transcriptie locaties in de kern. Enkel mRNA transcripten zichtbaar in het cytoplasma. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figuur 5. Representatieve resultaten van Stellaris FISH procedure. MATa gistcellen werden tegelijkertijd blootgesteld aan 30 ng / ml α-factor en 0,75 M sorbitol gedurende 10 min en werden gelijktijdig onderzocht voor FUS1 (Quasar 670, rood) en STL1 (Quasar 570, groen) transcripten. In het gemarkeerde vak, kunnen we zien een cel alleen reageert op de feromonen (FUS1 startsite, rood) en andere voornamelijk reageren op sorbitol (STL1 startsite, groen).

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) voor het tellen van mRNA&#39;s in enkele cellen in single-molecule resolutie.

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van mRNA-moleculen in individuele gistcellen aan te tonen met single-molecule specificiteit. Fixeer eerst de gistcellen met formaldehyde met behulp van een buffer die lyase bevat. Permeabiliseer de cellen totdat de meeste cellen niet langer fase-helder zijn.Incubeer vervolgens de permeabiliseerde cellen met fluorescentie-gelabelde enkelstrengs DNA-moleculen en monteer de cellen daarna op een plasma-gereinigde dekglasplaat. Uiteindelijk kunnen de resultaten die met fluorescentiemicroscopie zijn verkregen, details geven over de aanwezigheid en lokalisatie van mRNA-moleculen in individuele cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals genexpressie-microarrays en northern blots, is dat individuele mRNA's in individuele cellen gevisualiseerd kunnen worden.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de transcriptie. Dit omvat het kwantificeren van het aantal arm-RNA's per cel in een populatie, wat informatie kan verschaffen voor modellen van regulatie op promotorniveau. Het kan daarnaast worden gebruikt om de lokalisatie en halfwaardetijden van transcripten tijdens de celcyclus te bepalen.Plaats in een plasmabestreken vacuümkamer dekglasplaatjes op de objectglazen. Plaats vervolgens de vacuümkamer in een magnetron en zorg dat deze luchtdicht is afgesloten. Schakel de pomp in zodra de pomp is opgestart.Zet het vacuüm aan, schakel vervolgens de magnetron in en stop vijf seconden nadat het plasma zichtbaar is. Zet daarna het vacuüm uit, gevolgd door de pomp. Trek de vacuümkamer eruit.Breng vervolgens de dekglasjes met de gereinigde zijde naar boven over in 12-wells platen; kweek de gist tot een A 600 van ongeveer 0,1 tot 0,2. In minimaal medium leveren 10 ml cellen voldoende materiaal voor ongeveer 10 hybridisaties.Voeg één tiende volume 37% formaldehyde direct toe aan het groeimedium en incubeer dit gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen 5 minuten bij 3000 Gs. Resuspendeer de pellet in één milliliter buffer B en breng deze over naar een microcentrifugebuisje.Was tweemaal met 1 mL ijskoude buffer B in een microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende één minuut bij 13.000 RPM. Voeg vervolgens 1 mL sphero platingbuffer toe en incubeer 15 minuten bij 37 °C.Monitor de cellen microscopisch elke paar minuten totdat de meeste cellen zwart zijn. Was ze vervolgens twee keer met ijskoud buffer. Centrifugeer bij een lage snelheid van 3.500 RPM.Voeg 1 mL 70% ethanol toe. Resuspendeer het pellet voorzichtig en bewaar dit gedurende de nacht bij 4 °C of onbepaalde tijd bij -20 °C. Om de hybridisatieloplossing te bereiden, voegt u 1 tot 3 µL probe toe aan 100 µL hybridisatiebuffer.Vortex vervolgens en centrifugeer. We hebben drie verschillende genen gelijktijdig afgebeeld met behulp van drie verschillende probesets. Centrifugeer nu het gefixeerde gistmonster en aspireer de wasbuffer af.Voeg de hybridisatieluiding toe en incubeer in het donker onder zachte schudding gedurende de nacht bij 37 °C tot de volgende dag. Behandel schone dekglasplaatjes met 150 µL 0,01% polylysine gedurende vijf minuten. Aspireer vervolgens en laat aan de lucht drogen.Was de objectglazen drie keer met gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen na één wasbeurt met 1X SSC. Resuspendeer de cellen in 150 µL van 0,1 µg/mL vers bereide DAPI-kleuring. Breng een aliquot van de cel-suspensie aan op de met polylysine behandelde dekglasjes en incubeer gedurende 30 minuten. Ontdooi vervolgens het Prolong Gold montagemedium tot kamertemperatuur.Breng drie µL aan op een objectglas. Voeg vervolgens ongeveer 0,5 mL ethanol toe aan een dekglas. Verwijder het dekglas uit de 12-wellplaat en laat dit aan de lucht drogen terwijl u het met een pincet vasthoudt.Plaats het dekglas met de celzijde naar beneden op het monteermedium en laat dit enkele uren of overnacht in het donker uitharden. Seal de randen met nagellak en ga over tot de beeldvorming. Maak een z-stack van beelden rond het referentiepunt waarbij de totale afstand 5 µm is met een stapgrootte van 0,2 µm.Herhaal de beeldvorming voor elk kleurkanaal dat overeenkomt met elke probeset. Ga vervolgens te werk zoals gedetailleerd in de bijbehorende tekst. Om de cellen via watershed-segmentatie te identificeren, identificeert u de spots met behulp van een radiaal gradiënt en meet u de spots met een Gaussian fit.Meestal worden histogrammen berekend op basis van FISH-afbeeldingen en gebruikt om het aantal mRNA's in individuele cellen te bepalen. Een belangrijk voordeel van RNA-kwantificering op basis van microscopie is dat men informatie kan verkrijgen over de lokalisatie van transcripten. In dit geval wordt FISH met enkelvoudige probes gebruikt om mRNA's in individuele cellen te identificeren met een induceerbaar CCB CBF one-allel.Omdat er veel mRNA-moleculen aanwezig zijn op de plaats van transcriptie, is het eenvoudig om de aanwezigheid en locatie van transcriptieplaatsen in de nucleus te identificeren. Het gebruik van verschillende kleurstoffen om mRNA's van verschillende genen te labelen, vergemakkelijkt de kwantificering van meerdere mRNA-soorten in dezelfde cellen. In dit experiment werden gistcellen geïncubeerd in de aanwezigheid van alpha factor en sorbitol. Met behulp van FISH met de Stelara-probes laten de gegevens zien dat één cel alleen reageert op het feromoon, wat wordt aangegeven door één rode FUS startplaats.Tegelijkertijd reageert een andere cel voornamelijk op sorbitol, waarbij de S TL one startplaats groen is gelabeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u individuele mRNA-moleculen in gist kunt labelen en visualiseren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee dagen correct worden uitgevoerd.Zorg voor een voldoende hoge celconcentratie. Bij verdunde monsters moeten er meer gezichtsvelden worden gefotografeerd en opgeslagen.

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle techniek voor de visualisatie van de groeiende geïmmobiliseerde gistcellen, hier toegepast op de TL-verslaggevers bij de stille paring loci HML en...

Een snelle techniek voor de visualisatie van Live Geïmmobiliseerd gistcellen

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Het steady state niveau van specifieke mRNA's wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA's kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Dit protocol beschrijft een toepassing van fluorescentie met één molecuul in situ hybridisatie (smFISH) om de in vivo kinetiek van mRNA-synthese en -afbraak te meten.

Indringende mRNA Kinetics in ruimte en tijd in Escherichia coli met behulp van Two-Color Single-Molecule Fluorescentie in Situ Hybridisatie

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Leer FISH-visualisatie van individuele mRNA-moleculen in Saccharomyces cerevisiae voor transcriptieregulatieonderzoek. Deze methode kwantificeert transcriptlokalisatie en halfwaardetijden in enkele cellen.

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie

Meer video's verkennen