Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie in Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van mRNA-moleculen met enkele molecuulspecificiteit in enkele gistcellen te detecteren. Bevestig eerst de gistcellen en formaldehyde met behulp van lyase bevattende buffer. Maak de cellen doorlaatbaar totdat de meeste cellen niet meer helder zijn.

Behandel vervolgens de permeabele cellen met fluorescentie-gelabelde enkelstrengse DNA-moleculen en monteer vervolgens de cellen op een plasma-gereinigde deksel. Uiteindelijk kunnen de resultaten verkregen door middel van fluorescentiemicroscopie de aanwezigheid en lokalisatie van mRNA-moleculen in enkele cellen in detail weergeven. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals genexpressie, microarrays en northern blots, is dat individuele mRNA's in enkele cellen kunnen worden gevisualiseerd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van transcriptie. Dit omvat het kwantificeren van het aantal arm-RNA's per cel in een populatie, wat modellen van regulatie op promotorniveau kan informeren. Het kan ook worden gebruikt om de lokalisatie en halfwaardetijden van transcripten tijdens de celcyclus te bepalen.

In een plasma-gereinigde vacuümkamer deksels op de glijbanen plaatsen. Plaats vervolgens de vacuümkamer in een magnetron en zorg ervoor dat deze goed afgesloten is. Schakel de pomp in zodra de pomp is gestart.

Schakel nu het vacuüm in, zet de magnetron aan en stop vijf seconden nadat het plasma zichtbaar is. Schakel vervolgens het vacuüm uit, gevolgd door de pomp. Trek de vacuümkamer eruit.

Breng vervolgens de gezuiverde deksels met de schoongemaakte kant omhoog over in 12-welplaten. Laat de gist groeien tot een A 600 van ongeveer 0,1 tot 0,2. In minimaal media levert 10 ml cellen genoeg op voor ongeveer 10 hybridisaties.

Voeg een 10e volume van 37% formaldehyde rechtstreeks toe aan het groeimedium en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 3000 Gs. Resuspendeer het pellet in één ml buffer B en breng over naar een microcentrifugebuisje.

Was twee keer met één ml ijskoud buffer B in een microcentrifugebuisje. Centrifugeer gedurende één minuut bij 13.000 RPM. Voeg vervolgens één ml sferische platering, buffer toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Bekijk de cellen om de paar minuten microscopisch totdat de meeste cellen zwart zijn. Was vervolgens twee keer met ijskoud buffer B. Draai met een lage snelheid van 3.500 RPM.

Voeg een ml 70% ethanolresus toe. Resuspendeer het pellet voorzichtig en plaats het een nacht bij vier graden Celsius of bewaar het onbeperkt bij min 20 graden Celsius. Om de hybridisatieoplossing voor te bereiden, voegt u één tot drie microliters sonde toe aan 100 microliters hybridisatiebuffer.

Vervolgens vortex en centrifugeer. We hebben drie verschillende genen gelijktijdig afgebeeld met behulp van drie verschillende sondesets. Centrifugeer vervolgens het gefixeerde gistmonster en zuig de wasbuffer af.

Voeg de hybridisatieoplossing toe en incubeer in het donker met zacht schudden overnacht bij 37 graden Celsius. Behandel schone deksels gedurende vijf minuten met 150 microliter 0,01% polylysine. Zuig vervolgens en laat het drogen aan de lucht.

Was de glijbanen drie keer met gedistilleerd water en laat ze drogen aan de lucht na één wasbeurt met een XSSC Resus. Breng de cellen in suspensie in 150 microliter 0,1 microgram per milliliter. Bereid vers stapje en breng een aliquot van de celsuspensie aan op de met polylysine behandelde deksels en incubeer gedurende 30 minuten. Ontdooi vervolgens het langdurige goudmontagemedium tot kamertemperatuur.

Plaats drie microliters op een glijbaan. Voeg vervolgens ongeveer 0,5 ml ethanol toe aan een deksel. Verwijder in de 12-welplaat het deksel en laat het drogen aan de lucht terwijl het met een pincet wordt vastgehouden.

Plaats het deksel met de celzijde naar beneden op het montagemedium en laat het enkele uren of een nacht in het donker hard worden. Verzegeld de randen met nagellak en ga verder met beeldvorming. Neem een Zack van afbeeldingen rond het referentiepunt waar de totale afstand vijf micrometer is met een grootte van 0,2 micrometer.

Herhaal de beeldvorming voor elke kleurkanaal die overeenkomt met elke sondeset. Ga vervolgens verder zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Om de cellen te identificeren door watershed-segmentatie, identificeer de vlekken met behulp van een radiaal verloop en meet de vlekken met behulp van een Gaussiaanse fit.

Histogrammen worden meestal berekend uit visbeelden en worden gebruikt om het aantal mRNA's in enkele cellen te bepalen. Een belangrijk voordeel van microscopiegebaseerde RNA-kwantificering is dat men informatie kan verkrijgen over de lokalisatie van transcripten. Deze vis gebruikt bijvoorbeeld enkele sondes om mRNA's in enkele cellen te identificeren met een induceerbare CCB CBF een allel.

Omdat veel mRNA-moleculen aanwezig zijn op de plaats van transcriptie, is het gemakkelijk om de aanwezigheid en locatie van transcriptieplaatsen in de kern te identificeren. Het gebruik van verschillende kleurstoffen om mRNA's van verschillende genen te labelen, vergemakkelijkt de kwantificering van meerdere mRNA-soorten in dezelfde cellen. In dit experiment werden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van alfa-factor en sorbitol. Met behulp van vis met de Stelara-sondes laten de gegevens één cel zien die alleen reageert op het feromoon, aangegeven door een rode FUS een startplaats.

Tegelijkertijd reageert een andere cel overwegend op sorbitol, waar de S TL een startplaats groen is gelabeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkele mRNA-moleculen in gist kunt labelen en visualiseren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen twee dagen correct worden uitgevoerd.

Onthoud om een voldoende dichte concentratie cellen te hebben. Verdunde monsters