Name: Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Leer een correlative microscopiemethode voor 3D-structurele analyse van dynamische interacties tussen HIV-1-deeltjes en HeLa-cellen. Deze techniek combineert fluorescentielicht- en cryo-elektronenmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Travis Wheeler en de werkplaats aan de afdeling Celbiologie en Fysiologie, Universiteit van Pittsburgh bedanken voor de bouw van de cryo-fluorescentie monstertafel, Changlu Tao en Cheng Xu aan de Universiteit van Wetenschap en Technologie van China voor technische bijstand, en Dr Teresa Brosenitsch voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. HeLa Cell Culture on Carbon coating, Goud EM Finder Grids <ol><li> Gloedlossing de koolstof-kant van een 200-mesh R2 / 2 Quantifoil goud EM finder net onder de 25 mA voor 25 sec. </li><li> De vacht van de EM rooster met fibronectine, door drijven het, carbon-kant naar beneden, op een 40 pi druppel van 50 ug / ml fibronectine oplossing, desinfecteer het dan onder UV-licht voor 2 uur in een weefselkweek kap. </li><li> Plaat HeLa cellen op het rooster op een dichtheid van 2 x 10 4 cellen / ml (totaal 2 ml kweek) in een glazen bodem cultuur schotel en groeien de cellen bij 37 ° C, met 5% CO2, in DMEM aangevuld met 4,5 g / L L-glutamine en glucose, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, gedurende ongeveer 18 uur. HeLa cellen worden geïnfecteerd na O / N cultuur. </li></ol> 2. HIV-1 infectie en live-cell imaging <ol><li> Voeg een fluorescerende cel tracker (Red CMTPX, 1 ui / 2 ml) in de glazen bodem cultuurschotel (uit stap 1.3) en incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 10 min, om up-opbrengst van de fluorescerende kleurstof. </li><li> Was de cellen met PBS en voeg 50 ul voorverwarmde vers medium. </li><li> Zet de schaal op de live-cell kamer, bij 37 ° C, van een bocht beschreven Field confocale microscoop scanner. Selecteer meerdere velden (10-15 posities) die 1-3 cellen / vierkante bevatten, met de cellen tussen twee mitose fasen wanneer ze het meest verspreid-out en platte (zie figuren 2c en 2d), sinds cryoEM vereist relatief dunne gebieden van de monster. Bewaar deze posities voor toekomstige beeldvorming (stap 2.5). </li><li> Infecteren de cellen met VSV-G pseudo-getypeerde HIV-1 deeltjes die GFP-Vpr bevatten (we gebruiken 40 ul van een monster met 40 ng / ml p24). Bij het toevoegen van het virus deeltjes in de bodem van de schaal, voorzichtig zijn om de EM net niet storen, omdat de posities van beeldvormende reeds geselecteerd en opgeslagen. </li><li> Onmiddellijk na toevoeging van virions, verzamelen time-vervallen high-speed 3D confocale beelden, bij de eerder gekozen standen (uit stap 2.3) gedurende 20-40 minuten. </li><li> Confocale beelden werden verkregen met behulp van MetaMorph en geanalyseerd door geautomatiseerde 3D ​​deeltje volgen voor enkel deeltje dynamiek behulp Imaris software (zie figuur 1). Aangezien we correleren het dynamische gedrag van buigingsbegrensde HIV-1 deeltjes met cellulaire ultrastructuur, time-lapse live cell imaging en 3D deeltjes volgen kritisch zijn voor de resultaten. Voor een grote en statische structuur, een eenvoudige fluorescentiebeeld (zonder levende cellen) zou voldoende correlatieve analyse. </li></ol> 3. Frozen-gehydrateerd EM Monstervoorbereiding Om de vertraging tussen de verzameling van de laatste confocale afbeelding en cryo-fixatie van het monster te minimaliseren, moet de FEI Vitrobot (of ander apparaat vitrificatie) worden geïnitieerd en voorbereid voor duik-bevriezing tijdens het verzamelen van fluorescentie confocale live cell afbeeldingen.<ol><li> Schakel de verglazing apparaat en stel het klimaat temperatuur tot 22 ° C, de doelstelling luchtvochtigheid tot 100%, de blotting tijd om 7 sec, en het wachten en afvoer tijd tot 1 sec. </li><li> Plaats de opbergbox raster in de zuiger dewar en bereiden koude vloeistof ethaan. Monteer de dewar op de verglazing apparaat. </li><li> Onmiddellijk na confocale voor live-cell imaging (hoofdstuk 2), plaats de cultuur schotel op een met ijs gekoelde koperen blok en overbrengen naar het cryoEM monstervoorbereiding kamer. Laad de EM rooster op de gespecialiseerde pincet en snel alle media op de grid weg te deppen. De blotting gebeurt handmatig, met filtreerpapier, waarna 4 pl van 15 nm goud kraal oplossing gemengd met 0,2 um wordt fluorescerende microsferen direct op het rooster. De gouden kralen worden gebruikt als ijkmarkeringen om tomografische gegevens verzamelen en uitlijning hulp. De fluorescente microsferen worden gebruikt om de correlatie tussen tl en cryoEM afbeeldingen steun (zie figuur 2c-2f). </li><li> Laad de pincet op de verglazing apparaat en instrueren het apparaat te wissen en storten bevriezen in vloeibare ethaan 16. De blotting parameters geoptimaliseerd om het beste resultaat te bereiken zijn: vlek tijd, 7 sec; vlek offset, 0; drain tijd, 1 sec, temperatuur, 22 ° C, en de luchtvochtigheid, 100%. </li><li> Breng de bevroren-gehydrateerd grid naar een cryoEM houder voor onmiddellijke cryoET beeldvorming, of een vloeibare stikstof opslag dewar voor later gebruik. </li></ol> 4. Cryo-fluorescentie lichtmicroscopie Een zelfgebouwde, cryo-fluorescentie monsterkamer en fase-systeem (figuur 3) is nodig voor het uitvoeren van de stappen 4,1-4,10. De gedetailleerde specificaties en de beschrijving van de fase kan worden gevonden in juni et al.. 15. <ol><li> Vul een zelf-druk vloeibare stikstof Dewar met vloeibare stikstof ten minste 2 uur voor aanvang van cryo-fluorescentie microscopie (zie figuur 3a). </li><li> Monteer een zelfbouw cryo-fluorescence monstertafel 15 (figuur 3) op een omgekeerde fluorescentie lichtmicroscoop, zoals een Olympus IX 71. </li><li> Sluit de vloeibare stikstof inlaat van de cryo-monster etappe naar de zelf-druk Dewar en plaats de stikstof overloopbeveiliging afvoer vloeistof in een geschikte container. Sluit een droog stikstofgas lijn naar een huls geplaatst over de doelstelling om de lens aan warme en vorstvrij te houden. </li><li> Plaats een koperen blok platform (zwarte pijl in figuur 3b) in de cryo-fasekamer voor het laden van de bevroren-gehydrateerde monster raster. Afkoelen en vul de koperen kamer van de cryo-podium met vloeibare stikstof door de inlaat lijn van de self-druk vullen dewarvat. </li><li> Wanneer de cryo-podium temperatuur van vloeibare stikstof (in ~ 4-6 min) bereikt, dragen de opbergbox raster (uit stap 3.5) naar de cryo-podium. </li><li> Plaats de bevroren-gehydrateerde monster rooster in de EM specimen cartridge op de koperen blok en clip de gontdoen in plaats met behulp van een C-ring (bij gebruik van een Polara microscoop cartridge), of plaats een pre-gekoelde koperen ring op de top (zwarte pijlpunt in figuur 3d), om het rooster op zijn plaats voor het gemakkelijk terugvinden van het net te houden en ook na cryo-fluorescentie beeldvorming (indien een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop). </li><li> Plaats de cartridge (uit stap 4.6) in de binnenkamer van de cryo-podium (witte pijl in figuur 3b). </li><li> Zoek en vind op dezelfde virusdeeltjes uit de live-cell imaging data. Aangezien EM kap heeft een index, is het eenvoudig om hetzelfde deeltje op het rooster zowel levende cellen beelden en cryo-bloei beelden lokaliseren. </li><li> Acquire cryo-DIC en GFP beelden op de geïdentificeerde posities onder cryo-toestand met behulp van een lichtmicroscoop met een lang werkende (2,7-4 mm) objectief. Tijdens de cryo-fluorescentie beeldvorming, periodiek de vloeibare stikstof niveau in de cryo-podium en vul het, zo nodig, aan het monster podium houden onder de -170° C. </li><li> Na voltooiing van cryo-fluorescentie beeldvorming, zorgvuldig het model cartridge terug te keren naar de koperen blok platform en bewaar de cartridge in een vloeibare stikstof Dewar voor toekomstige cryoET analyse met een Polara systeem. Bij gebruik van een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop, verwijder de koperen ring, halen het monster rooster, plaats het in een rooster opbergdoos, en het monster op te slaan in een vloeibare stikstof Dewar totdat het monster wordt onderzocht door cryoET. </li><li> Voor data-analyse, overlappen de verworven cryo-DIC en GFP beelden (uit stap 4.9, zie figuur 4b) en correleren van de posities van de GFP-signalen in de cryo-fluorescentie afbeelding met die verkregen in de live-cell imaging-serie. </li></ol> 5. Cryo-electron tomografie <ol><li> Plaats het monster patroon in de cryo-overslagstation van een elektronenmicroscoop uitgerust met een veldemissiebron, zoals Polara G2 microscoop. </li><li> Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 140X, identify en sla de bijbehorende rooster vierkanten (van stap 4.11) in een podium bestand. </li><li> Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 3500 X, plaatst u een 100 um objectieve diafragma, zoek en alle posities gecorreleerd met GFP signalen om in een tweede fase bestand op te slaan. </li><li> Onder lage dosis-belichting, vinden een leeg gebied aan lichtintensiteit aan te passen aan een dosis van 1 of 2 e - / Å 2 en verfijnen van de tilt-as, met behulp van het podium y-functie, door het wegbranden van het ijs in een onbelangrijke carbon regio met verscheidene gouden kralen. </li><li> Onder lage dosis-focus modus, om de scherpstelafstand tot ~ 3 micrometer en de hoek aan te passen aan de richting van de focus lijn parallel aan de kantelas te zijn. </li><li> Onder lage dosis-zoekmodus, herinneren opgeslagen posities (uit stap 5.3), past het model eucentrische hoogte en controleer de tilt bereik van het gebied van belang. Verwerven afbeelding een projectie met zeer lage elektron-dosis (~ 1 e - / Å 2) op 8 tot 10 micrometer defocus, in expoure-modus, om de gecorreleerde virusdeeltjes te bevestigen voor cryo-electron tomografie. </li><li> Schakel over naar de lage-dosis-scherpstelling. In TEM menu automatische functies, vooraf aan de geautomatiseerde eucentrische hoogte en richten functies op het focusgebied. </li><li> Stel de parameters voor het verwerven van een tilt-serie. Voor figuur 4 in dit document, kantelhoeken variërend ± 70 °, onder en boven 45 °, bij 3 ° en tilt stappen van 2 °, respectievelijk, werden gebruikt, met een 6 micrometer defocus en ongeveer 70 e - / Å 2 totale dosis. </li><li> Herhaal de stappen 5.7 en 5.8 voor alle opgeslagen posities. Batch tomografie software kan worden gebruikt voor automatische gegevensverzameling op meerdere posities van de doorvoer te verhogen. </li></ol> 6. Driedimensionale reconstructie met behulp IMOD 17 <ol><li> Inspecteer de ruwe tilt-serie om de minimale en maximale densiteit waarden aan te passen en te bepalen of er een te worden uitgesloten vanwege grote afbeelding shift. </li><li> Start eTomo en setup tomogram paneel met astype, pixelgrootte, de vaste diameter, enz. Maak vervolgens com scripts. </li><li> Configureert het hoofdvenster zodanig dat verschillende stadia van de tomogram berekening kan worden aangepast / gelijktijdig gevolgd. Wijzig de nodige parameters en uitvoeren van de specifieke programma&#39;s die nodig zijn door elke bewerkingsstap (zie eTomo tutorial <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> In de laatste fase, maak een volledige lijn stack (met een gemiddelde resterende fout minder dan 0,6) en het reconstrueren tomograms behulp van een gewogen back-projectie algoritme in IMOD. </li><li> DeNoise potentiële aandachtsgebieden behulp van een 3D-lineaire anisotrope diffusie rand versterken programma geïmplementeerd in IMOD met de juiste parameters om het contrast en de helderheid te verbeteren. </li></ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li>
<li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li>
<li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015(2008).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84(2009).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
<li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

We hebben een eenvoudige set protocollen gepresenteerd aan een geavanceerde correlatieve benadering te analyseren dynamische cellulaire gebeurtenissen met behulp van time-lapse confocale, levende cellen fluorescentie beeldvorming gevolgd door cryoET bieden. De methodologische ontwikkeling 3D levende cellen beeldvorming met hoge resolutie cryoET correleren is cruciaal voor vele uitdagende biologische problemen, zoals zeldzame visualiseren, dynamische (niet statisch, zoals eerder vermeld), en diffractie beperkte virale de...

Cryo-electron tomography (cryoET) is een krachtige imaging techniek die driedimensionale (3D) visualisatie van cellen en weefsels mogelijk maakt en geeft inzicht in de organisatie van de inheemse organellen en cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een dicht-bij fysiologische toestand 1. Echter, de inherent lage contrast van ongekleurde bevroren gehydrateerde monster, gecombineerd met hun stralingsgevoeligheid, bemoeilijkt gebieden plaats binnen een cel lokaliseren en vervolgens uitvoeren van de tilt series succes zonder beschadiging van het doelgebied. Om deze problemen te overwinnen, een correlatieve benadering die licht en elektronenmicroscopie combineert noodzakelijk. Bijzonderheden gemarkeerd door fluorescentielabelling worden geïdentificeerd en gelokaliseerd door fluorescentie microscopie, en vervolgens de coördinaten worden overgedragen aan de elektronenmicroscoop voor het ingaan van hoge resolutie 3D structurele gegevens. Deze correlatieve methode helpt het lokaliseren van de doelgroep eenReas van belang zijn worden aangepakt. Door de beperking van monsterdikte met cryoEM (&lt;300 nm), nog alleen de randgebieden van de cel geschikt voor 3D structuuranalyse door CryoET. Verdere vermindering van de dikte van bevroren gehydrateerd monsters door glasvocht snijden 8 of door cryo-focused ion beam (FIB) frezen 9 zou het vermogen van correlatieve beeldvorming breiden. Voorheen werden correlatieve methoden voornamelijk gebruikt om cryoET data acquisitie voor grote en statische constructies 10-13 vergemakkelijken. In deze studies zijn cryo-fasen geïmplementeerd om cryoEM roosters accepteren en passen op ofwel een rechtopstaande microscoop of een omgekeerde microscoop 10,11,14. Hoewel schakelende grids lijkt vrij eenvoudig in hun ontwerpen, zijn er extra stappen die overdracht van de EM rooster, waardoor de kans dat het rooster kan worden vervormd, beschadigd en vervuild. We hebben onlangs aangetoond een technische vooruitgang incorrelatieve microscopie die ons in staat stelt om direct te visualiseren dynamische gebeurtenissen die van nature moeilijk te vangen, zoals HIV-1 en gastheercel interactie in een vroeg stadium van de infectie 15. We bereikte dit door het ontwerpen en implementeren van een cryo-lichtmicroscopie monstertafel dat een cartridge systeem om het monster schade door raster handling minimaliseren aanpast, waardoor het gemakkelijker correlatie. Ons ontwerp omvat een geïntegreerd exemplaar patroonhouder, waardoor beide cryo-licht en cryo-elektronenmicroscopie worden uitgevoerd, achtereenvolgens, op hetzelfde monster houder, zonder monster overdracht, waardoor het stroomlijnen van het correlatieve proces. Daarnaast hebben we eveneens uitgevoerd een nauwkeurige en betrouwbare correlatie procedure met fluorescerende latex kralen als markeerders.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>HeLa celcultuur op EM rasters</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Red CMTPX</td></tr><tr><td>Protein A goudconjugaten</td><td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm diameter</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m fluorescente microspheren</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Geel-groen fluorescerend</td></tr><tr><td>Heat-inactivated foetaal runderserum</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurbakje met glazen bodem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gold quantifoil finder EM rasters</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Duitsland</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Glow-discharge apparaat 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 elektronenmicroscoop met een Field Emission Gun</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX 71 microscoop</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2,7-4 mm werkafstand) objectieflens</td></tr><tr><td>Nikon TiE microscoop</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>met behulp van een 60X/1.35 NA olie-immersie objectieflens</td></tr><tr><td>Sweptfield confocale microscoop</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit live celkamer</td><td>Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-fluorescentie sample stage</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>Gebouwd door machinefabriek, zie referentie 15 voor het ontwerp.</td></tr></tbody></table>

correlatieve microscopie voor 3d structural analysis van dynamic interactions

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) maakt het mogelijk 3D-visualisatie van cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een close-to-fysiologische toestand 1. Echter, directe visualisatie van individuele virale complexen in hun gastheer cellulaire omgeving met cryoET 2 is uitdagend, gezien de lage frequentie en de dynamische aard van virale binnenkomst, met name in het geval van HIV-1. Terwijl de time-lapse live cell imaging veel informatie over de vele aspecten van de levenscyclus van HIV-3-07 januari heeft opgeleverd, de resolutie wordt geboden door levende cellen microscopie is beperkt (~ 200 nm). Ons werk is gericht op het ontwikkelen van een correlatie methode die directe visualisatie van de vroege gebeurtenissen van HIV-1 infectie toelaat door het combineren van levende cellen fluorescerend licht microscopie, cryo-fluorescentie microscopie, en cryoET. Op deze wijze kunnen levende cellen en cryo-fluorescente signalen worden gebruikt voor het nauwkeurig geleiden van de bemonstering in cryoET. Bovendien, structurele informatie uit cryoET kunnen be aangevuld met de dynamische functionele data verkregen door middel van live-cell imaging van fluorescent gelabelde doelwit. In deze video artikel, bieden we gedetailleerde methoden en protocollen voor structurele onderzoek van HIV-1 en gastheer-cel interacties met behulp van 3D correlatieve high-speed Live-cell imaging en hoge-resolutie cryoET structurele analyse. HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 deeltjes werden eerst gekenmerkt door confocale microscopie van levende cellen, en het gebied dat dezelfde virale deeltje werd vervolgens geanalyseerd met cryo-electron tomografie voor 3D structurele details. De correlatie tussen de twee reeksen van beeldgegevens, optische beeldvorming en elektronen imaging, werd bereikt met behulp van een zelfgebouwde cryo-fluorescentie lichtmicroscopie podium. De aanpak die hier beschreven zal waardevol zijn, niet alleen voor studie van virus-gastheercel interactie, maar ook voor bredere toepassing in celbiologie, zoals signaaltransductie, receptor membraan handel, en vele andere dynamische cellulaire processen. &lt;/ P&gt;

Om het dynamische gedrag van de virusdeeltjes karakteriseren, werden HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 afgebeeld door high-speed confocale microscopie levende cellen en deeltjes bewegingen werden geanalyseerd door geautomatiseerde 3D ​​deeltjes volgen (figuur 1). Om de tijdspanne van enkele minuten die kunnen optreden tussen de verzameling van de laatste afbeelding confocale live cell en duik-invriezen (die lang genoeg is om gecorreleerd HIV-1 deeltjes verliezen kan zijn), een cryo-fluorescentie micros...

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van de correlatieve fluorescentielicht- en cryo-elektronenmicroscopie-methode te demonstreren door dynamische kleine HIV-1-partikels te beelden die interageren met HeLa-gastcellen. Dit wordt bereikt door eerst HeLa-cellen uit te platen en te kweken op een gouden finder EM-grid in een glazen kweekschaal met bodem en de HeLa-cellen te infecteren met GFP-gelabelde HIV-1-partikels. De tweede stap bestaat uit het verzamelen van time-lapse high-speed 3D levende-cel confocale beelden van HIV-1-geïnfecteerde cellen, en het analyseren van deze beelden via geautomatiseerde 3D-partikeltracking voor enkelvoudige partikeldynamica na vitrificatie.De monsters, bestaande uit dezelfde virale deeltjes als in de live-cell imaging-data, worden gelokaliseerd in cryo-fluorescentiebeelden voor verdere 3D cryo-elektronentomografie-analyse met hoge resolutie. De laatste stap is het verzamelen van gekantelde cryo-EM projectieseries voor alle geïdentificeerde posities die HIV-1-deeltjes bevatten en het reconstrueren van 3D-toms met een weighted back projection-algoritme met behulp van imad-software. Uiteindelijk worden geavanceerde 3D correlatieve live-c

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Hier introduceren we een methode, cocem3D, om de ultrastructuur van een specifieke cel in zijn oorspronkelijke weefsel te onthullen door confocale en seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie te verbinden.

Correlatieve Confocal en 3D Electron Microscopy van een specifiek Sensory Cell

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.

Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Leer een correlative microscopiemethode voor 3D-structurele analyse van dynamische interacties tussen HIV-1-deeltjes en HeLa-cellen. Deze techniek combineert fluorescentielicht- en cryo-elektronenmicroscopie.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Meer video's verkennen