Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van de correlatieve fluorescente licht- en cryo-elektronenmicroscopiemethode te demonstreren door dynamische kleine HIV een-deeltjes te beeldvormen die interageren met gastheer hela-cellen. Dit wordt bereikt door eerst hela-cellen te plateren en te laten groeien op de gouden finder EM-grid in een glasbodemcultuurschaal en hela-cellen te infecteren met GFP-gelabelde HIV een-deeltjes. De tweede stap is om tijd-lapse hoge snelheid 3D levende cel confocale beelden van HIV een-geïnfecteerde cellen te verzamelen en de beelden te analyseren door geautomatiseerde 3D deeltjestracking voor de dynamiek van enkelvoudige deeltjes na vitrifieer.

De monster, dezelfde virale deeltjes uit de levende cel beeldvormingsgegevens bevinden zich in cryo fluorescente beelden voor verdere hoge resolutie 3D cryo-elektronentomografieanalyse. De laatste stap is om gekantelde cryo EM projectieserieën te verzamelen voor alle geïdentificeerde posities die HIV een-deeltjes bevatten en 3D toms te reconstrueren met een gewogen terugprojectiealgoritme met behulp van imad-software. Uiteindelijk worden geavanceerde 3D correlatieve levende celfluorescentiemicroscopie en hoge resolutie cryo-elektronentomografie gebruikt om dynamische diffractiebeperkte virale deeltjes en hun interacties met gastheercellen direct te visualiseren.

Ons werk is gericht op het ontwikkelen van een correlatiemethode die directe visualisatie van alleen gebeurtenissen van HIV een-infectie mogelijk maakt. Door live cell fluorescente-achtige microscopie, cryo-fluorescente microscopie en cryo-elektronentomografie op deze manier te combineren, kunnen live cell en cryo-fluorescente signalen worden gebruikt om de bemonstering in cryo-elektronentomografie aanzienlijk te leiden. Bovendien kan structurele informatie verkregen uit cryo-elektronentomografie worden aangevuld met de dynamische functionele gegevens die beschikbaar zijn via lifestyle-beeldvorming van fluorescent gelabelde doelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methode is dat geavanceerde correlatieve hoge snelheid 3D lifestyle-beeldvorming met een hoge resolutie 3D koraal elektrontetomografiebenadering wordt toegepast om dynamische gebeurtenissen te bestuderen die van nature moeilijk te vangen zijn, zoals HIV type een en gastheercelinteracties in een vroeg stadium van infectie.

Om de grid voor celcultuur voor te bereiden, voert u een glow discharge uit op de koolstofzijde van een 200 mesh R twee over twee quanti folie, gouden EM finder grid onder 25 milliamps gedurende 25 seconden. Bekleed de EM-grid met vezel nin door hem met de koolstofzijde naar beneden op een druppel van 40 microliter van een oplossing van 50 microgram per milliliter vezel nin te laten drijven. Laat het twee uur in een weefselcultuurhood onder UV-licht staan voor desinfectie, plateer hela-cellen op de grid met een dichtheid van twee keer 10 tot de vierde cellen per milliliter in een glasbodemcultuurschaal.

In DMEM met geschikte supplementen, incubeer cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende ongeveer 18 uur vóór HIV een-infectie. Voeg vóór HIV-infectie een fluorescerende celtracker toe aan de hela-cellen in de glasbodemcultuurschaal en incubeer de schaal bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten om opname van de fluorescerende kleurstof mogelijk te maken, was de cellen met PBS en voeg 50 microliter voorverwarmd vers medium toe. Plaats de schaal in de levende celkamer bij 37 graden Celsius van een swept field confocale scanner microscoop. Aangezien cryo EM relatief dunne gebieden van het monster vereist.

Selecteer meerdere velden die een tot drie cellen per vierkant bevatten met de cellen tussen twee mitosefasen wanneer ze het meest verspreid en plat zijn. Sla deze posities op met NIS-elementsoftware voor toekomstige beeldvorming. Vervolgens infecteert u de cellen met VSVG, pseudo-getypte HIV een-deeltjes die G-F-P-V-P-R bevatten en de virusdeeltjes in de bodemput van de schaal, zorg ervoor dat u de EM-grid niet verstoort. Aangezien de posities voor beeldvorming al zijn geselecteerd en opgeslagen onmiddellijk na toevoeging van de varians, verzamelt u tijd-lapse hoge snelheid 3D confocale beelden op de eerder geselecteerde posities gedurende 20 tot 40 minuten.

Onmiddellijk na confocale levende celbeeldvorming plaatst u de kweekschaal op een ijskoude koperblok en brengt u deze over naar de cryo EM monstervoorbereidingskamer. Laad de EM-grid op de gespecialiseerde pincetten, veeg snel resterend kweekmedium weg met filterpapier en plaats onmiddellijk microliters van een 15 nanometer gouden parel oplossing gemengd met 0,2 micron fluorescente microsferen op de grid. De fluorescente microsferen worden gebruikt om correlatie tussen fluorescentie en cryo-EM te ondersteunen.

Laad de pincetten op het vitrificatieapparaat voor induikvriezing met de blottingparameters geoptimaliseerd om de beste resultaten te behalen. Om de procedure voor cryofluorescentie lichtmicroscopie te beginnen, verbindt u een droge stikstofgaslijn naar een manchet geplaatst over de objectieflens om de lens warm en vrij van vorst te houden. Monteer een zelfgemaakte cryofluorescentiemonsterfase op een omgekeerde fluorescentielichtmicroscoop. Verbind de vloeibare stikstoftoevoer van de cryos monsterfase met de zelfgevulde doer en plaats de vloeibare stikstofoverloopbeveiligingsuitlaat in een geschikte container.

Plaats de bevroren gehydrateerde monsterschaal in de EM monstercartridge op het koperblok en plaats een voorgekoelde C-clipring erop om de grid op zijn plaats te houden. Plaats de cartridge in de binnenkamer van de cryo fase en zoek en vind dezelfde virusdeeltjes uit de levende cel beeldvormingsgegevens. Aangezien de EM-grid een index heeft, is het eenvoudig om hetzelfde deeltje op de grid in zowel levende celbeelden als cryofluorescentiebeelden te lokaliseren.

Verzamel cryo DIC en fluorescentiebeelden op de geïdentificeerde posities onder cryocondities met behulp van een lichtmicroscoop met een objectieflens met lange werkafstand. Controleer tijdens de cryofluorescentiebeeldvorming regelmatig het vloeibare stikstofniveau in de cryofase en vul het bij als dat nodig is om de monsterstap onder de min 170 graden Celsius te houden voor cryo-elektronentomografie. Laad de monsterscha