Name: Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer de analyse van HerDox-nanodeeltjes in HER2+ tumoren met multimodale optische beeldvorming. Deze methode toont gerichte aflevering en penetratie aan voor verbeterde kankertherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan LKM-K van de National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 en R01CA140995). Dr Medina-Kauwe bedankt C. Rey, M. M-Kauwe en D. Revetto voor blijvende steun.

1. Systemische Levering In vivo <ol><li> Meng genoeg HerDox met een steriele zoutoplossing tot 0,2 ml van een mg / kg dosis HerDox per injectie 0.004 voor een 6-8 week oude nu / nu muizen lager subcutane bilaterale flank xenograft tumoren gelijk. </li><li> Zuig de HerDox mengsel in een 3/10 cc insuline injectiespuit voorzien van een 29G naald, het vermijden van luchtbellen. </li><li> Anesthesie wordt geïnduceerd door korte isofluraan blootstelling in een inductie kamer uitgerust met een gas opvangsysteem; (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 3-4% (of lager). </li><li> Injecteer de gehele mengsel in de staart ader van een verdoofde muis (0,2 ml per injectie). IV injectie kan ook worden uitgevoerd in een beheerste, verdoofde muis. </li><li> Herhaal de injecties op dezelfde muis voor zes opeenvolgende dagen, eenmaal per dag. </li></ol> 2. Fluorescentie Imaging In vivo De accumulatie van HerDox fluorescentie in tumors kunnenworden aantoonbaar is met de laatste dag van de injectie (dag 7) met behulp van een multimode imager. De onderstaande procedures gebruik impliceren van een aangepaste macro-belichting en detectie (figuur 1) 8. <ol><li> Zet de Multimode In vivo Optical Imager. </li><li> Selecteer een emissie banddoorlaatfilter (590 nm ± 30 nm) geschikt voor doxorubicine fluorescentie detectie. </li><li> Schakel Argon-Krypton laser en plaats een excitatie banddoorlaatfilter (488 nm ± 10 nm) op de laser optische pad. </li><li> Zet de anesthesie-systeem en plaats dan een muis in de verlamming kamer (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 3-4% (of lager) uitgerust met een gas opvangsysteem;. </li><li> Breng de muis uit de verlamming kamer naar de beeldvorming kamer van de Multimode In vivo optische Imager wanneer de muis is verdoofd. </li><li> Plaats een neuskegel over de neus van de muis en open de stroom naar continue anesthe beherensia tijdens beeldacquisitie (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 2-3% (of lager). </li><li> Acquire fluorescentie beelden met behulp van een belichtingstijd van 5-15 sec. </li><li> Voer beeldanalyse en-verwerking, waaronder achtergrond correctie of aanpassing van het contrast. </li></ol> 3. Fluorescentie Imaging Ex vivo HerDox fluorescentie kan worden afgebeeld in tumoren en specifieke organen (zoals de lever, nieren, milt, hart en skeletspier) geoogst uit gedode muizen op 24 uur na de laatste (dag 7) injectie van HerDox. <ol><li> Zet de Multimode In vivo Optical Imager. </li><li> Selecteer een emissie banddoorlaatfilter (580 nm ± 20 nm) voor doxorubicine fluorescentie detectie. </li><li> Schakel Argon-Krypton laser en plaats een excitatie banddoorlaatfilter (488 nm ± 10 nm) op de laser optische pad. </li><li> Plaats tumoren en specifieke organen aangebracht op een Petri-schaal in de beeldvorming kamer of de Multimode In vivo Optical Imager. </li><li> Acquire fluorescentie beelden van weefsels met behulp van een belichtingstijd van 5-15 sec. Een voorbeeld van een initiële fluorescentie beeldacquisitie wordt getoond in figuur 2a. Herhaal hetzelfde met behulp van een lege Petri-schaal, die zal dienen als de achtergrond (Figuur 2b). </li><li> Voer beeldanalyse en-verwerking, waaronder achtergrond correctie of aanpassing van het contrast. Een voorbeeld van een gecorrigeerde beeld wordt getoond in figuur 2c, als gevolg van aftrekken van fig. 2b van fig. 2a. </li></ol> 4. In situ confocale beeldvorming van tumoren In situ confocale beeldvorming maakt detectie en analyse van HerDox tumorophoping op celniveau. <ol><li> Schakel een Leica SPE confocale microscoop. </li><li> Selecteer 488 nm laserlicht voor excitatie van doxorubicine en emissie golflengten (560-620 nm) voor doxorubicinefluorescentiedetectie. </li><li> Selecteer een 40X of 63X objectief en druppel immersie olie op het objectief. </li><li> Extract verse tumoren van muizen geëuthanaseerd die eerder HerDox en mock behandelingen ontvangen zoals beschreven in procedure 2. </li><li> Plaats tumoren op een Petri-schaal op het ijs om weefsel degradatie te voorkomen, en vervolgens over de tumoren een Delta T kamer voor confocale beeldvorming. </li><li> Acquire confocale beelden van de tumoren op sequentiële focale diepte (stapgrootte: 1 micrometer, dikte: 20 pm). Een voorbeeld van opeenvolgend verkregen beelden langs de z-as is weergegeven in fig. 3, linker paneel. </li><li> Voer maximale intensiteit z-projectie van de beelden. Een maximum intensiteitsprojectie van z-gestapelde beelden wordt getoond in figuur 3, rechter paneel. </li><li> Vastgesteld en de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de maximale intensiteit Z -. Projectie beelden gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de beelden die over de overall gezichtsveld werden berekenend behulp ImageJ. </li></ol> 5. Ratiometrische spectral imaging en Analyse Ratiometrische spectrale beeldvorming en analyse maakt onderscheid tussen Dox fluorescentie en autofluorescentie. <ol><li> Macht op een laser scanning fluorescentie confocale microscoop. </li><li> Acquire 15 beelden van de HerDox-behandelde en onbehandelde tumoren op een bepaalde diepte in het spectrale bereik van 510-650 nm, met een stapgrootte van 10 nm, en excitatie bij 488 nm licht met behulp van een Leica SPE confocale microscoop. </li><li> Bereid een 100 pM oplossing van doxorubicine. </li><li> Spectrale beeldvorming van de 100 uM doxorubicine oplossing uit te voeren om de zuivere spectrale signatuur van Dox fluorescentie (spectraal bereik: 510-650 nm, een stapgrootte: 10 nm) te verkrijgen. Typische resultaten van de beeldvorming van spectrale beeldvorming en resulterende fluorescentie spectrum uitgezet in een grafiek worden weergegeven in figuur 4. </li><li> Het verwerven van de autofluorescentie spectrale signatuur van een afbeelding cube (spectraal bereik: 510-650 nm, een stapgrootte: 10 nm) verkregen door spectrale beeldvorming van onbehandelde tumoren. Typische resultaten van de beeldvorming van spectrale beeldvorming en resulterende fluorescentie spectrum uitgezet als een grafiek getoond in figuur 5. </li><li> Genereer vier verwijzing spectrale signatuur (pure autofluorescence, 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescence, 0.2. Doxorubicine 0,8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0,7. Autofluorescentie) met behulp van het programma dat we ontwikkelden 9. Een kenmerkende curve die vier referentie spectrale signaturen wordt getoond in figuur 6. </li><li> Voer spectrale classificatie van de beelden zoals gedefinieerd door de verwijzing spectrale signaturen door Euclidische afstand meten met behulp van het programma dat we eerder ontwikkelde 9. </li><li> Voer lineaire spectrale ontmenging van die beelden met een spectrale ontmenging programma (plug-in in ImageJ) ontwikkelden wij 7, 10, ter vergelijking met de ratiometrische spectrale beeldvorming en analyse. Example scheiden HerDox fluorescentie van autofluorescentie van lineaire spectrale ontmenging wordt getoond in figuur 7. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

De auteur, Daniel Farkas, is voorzitter van Spectral Molecular Imaging. De overige auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Dox fluorescentie kan worden detecteerbaar in vivo met behulp van de multimode imager wanneer tumoren zijn onderhuids. De therapeutisch effectieve dosis van HerDox (0.004 mg / kg) onder de detectiegrens na een enkele dosis. Daarentegen na 7 dagelijkse injecties (1x/day gedurende 7 dagen), de tumor accumulatie en retentie van het deeltje is voldoende om visualisatie van Dox fluorescentie mogelijk. Het is essentieel bij het ​​werken met Dox of andere fluorofoor in vivo beeldv...

Tumor targeting van chemotherapie heeft het potentieel om kankercellen te elimineren bij lagere dosering in vergelijking met getargete drugs omdat meer van de afgegeven therapie kan ophopen op de plaats van bestemming verspreiden naar niet-tumorweefsel. Zoals de laatste situatie zou verwateren uit de werkzaamheid van het geneesmiddel en dus een hogere dosering nodig om effectief te zijn, tumor targeting heeft zowel therapeutische en veiligheid voordelen ten opzichte van standaard niet-gerichte behandeling. Targeting chemotherapie door inkapseling in zelfassemblerende nanodeeltjes kan het geneesmiddel blijft chemisch gemodificeerd met medicijnen die covalent zijn gekoppeld aan richtmoleculen. Als zodanig koppeling heeft het potentieel om de activiteit van zowel het geneesmiddel en het doel richtend molecuul veranderen, niet-covalente samenstel kan geneesmiddelsterkte te bewaren. We hebben eerder aangetoond dat de nieuwe drie-component, zelf-geassembleerde complex, HerDox, richt HER2 + tumoren <em&gt; In vivo en lokt tumor-groei ablatie terwijl het sparen van normaal weefsel, met inbegrip van het hart 1. HerDox wordt gevormd door niet-covalente interacties tussen de receptor-bindende cell-penetratie eiwit, HerPBK10, en het chemotherapeutische middel, doxorubicine (Dox), via een kleine nucleïnezuur linker. HerPBK10 bindt de humane epidermale groeifactor receptor (HER) en veroorzaakt receptor-gemedieerde endocytose 2-4, terwijl endosomale membraan penetratie wordt bereikt door incorporatie van het adenovirus-afgeleide penton base capside-eiwit 4-6. Een positief geladen domein op het eiwit kan nucleïnezuurbindende 4, 5, waardoor DNA-geïntercaleerde Dox worden vervoerd gerichte toediening. Elektrofiele, intercalatie, en eventueel eiwit oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes die stabiel zijn in het bloed en onder langdurige opslag bij verschillende temperaturen 1. Preferentiële richten naar HER2 + tumorcellen wordt vergemakkelijkt door de verhoogde affiniteit ligand als HER2 wordt verhoogd. Onze vorige studies hebben aangetoond dat systemische toediening van HerDox opbrengsten preferentiële accumulatie in tumoren via niet-tumorweefsel en in vergelijking met ongerichte Dox 1 en penetratie in tumorcellen in vivo 7. We hebben geconstateerd dat HerDox releases Dox na tumorcel binnenkomst, waardoor Dox accumulatie in de kern 1. Tumor-accumulatie lijkt te correleren met receptor-niveau, zoals relatief lage HER2-expressie tumoren accumuleren minder HerDox vergelijking met die met relatief hogere HER2 niveaus 1. Daarnaast draagt ​​de celdood concentratie vertoont een omgekeerde correlatie met HER2 weergave op tumor cellijnen verschillen celoppervlak HER2 niveau 1. HerDox vertoont een therapeutische en veiligheid voordeel ten opzichte van ongerichte Dox, zoals tumor doden optreedt bij meer dan 10-maal lagere dosis in vergelijking met de untarrichte drug en levert geen waarneembare nadelige invloed op het hart (gedetecteerd met echocardiografie en histologische kleuring) of lever (gedetecteerd door TUNEL kleuring) weefsel, in tegenstelling tot irrelevante Dox 1. Ondanks de afleiding van een viraal capside-eiwit, HerPBK10 vertoont geen waarneembare immunogeniciteit bij therapeutische niveaus 2. Dat reeds bestaande antilichamen tegen gehele adenovirus herkent HerPBK10, zij geen celbinding 2 voorkomen. Tumorvolume gemeten over de tijd is een standaard methode voor het beoordelen van de therapeutische werkzaamheid van gerichte therapieën, en is gebruikt voor de beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van HerDox. Aanvulling van deze aanpak met de in vivo en ex vivo fluorescentie-intensiteit beeldvorming heeft ons toegestaan ​​om beter te beoordelen richten efficiency 7. We hebben specifiek geïntegreerd in situ confocale beeldvorming van weggesneden tumoren met spectrale analyse van Dox fluorescentie om dat HerDox niet controlerent alleen opgebouwd op tumoren in vivo maar doorgedrongen in tumorcellen en geleverd Dox in het cytoplasma en de kern 7. Spectrale analyse bovendien konden we Dox fluorescentie onderscheiden van autofluorescence 7. Hier laten we zien meer in detail onze aanpak voor de beoordeling van HerDox in vivo na systemische toediening, en het belangrijkst, voor het beoordelen van targeting via multimode beeldvormende methoden en analyses.

<table><tbody><tr><td>Fluorescence laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Optical Imager</td><td>Spectral Molecular Imaging</td><td>Multimode In Vivo Optical Imager</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Nude (NU/NU) muis, vrouwtje, 6-8 weken</td><td>Charles River</td><td>Stamcode 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 humane HER2+ tumorcellen</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc insulinspuit U-100 met 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanent bevestigde naald</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T kamer </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van gerichte viral eiwit nanodeeltjes geleverd aan her2 + tumoren

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

De HER2 + tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox, vertoont tumor-preferentiële accumulatie en tumor-groei van ablatie in een diermodel van HER2 + kanker. HerDox wordt gevormd door niet-covalente zelfassemblage van een tumor gerichte cel penetratieproteïne het chemotherapeutische middel, doxorubicine, via een kleine nucleïnezuur linker. Een combinatie van elektrofiele, intercalatie, en oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes. HerDox vertoont stabiliteit in bloed en bij langdurige opslag bij verschillende temperaturen. Systemische levering van HerDox in tumordragende muizen resulteert in tumor celdood zonder waarneembare nadelige effecten op niet-tumorweefsel, waaronder het hart en de lever (die gekenmerkt schade door ongerichte doxorubicine ondergaan). HER2 hoogte vergemakkelijkt richten naar cellen die de humane epidermale groeifactor receptor, waardoor tumoren HER2 tonen verhoogde niveaus vertonen grotere accumulatie van HerDox opzichte cellen expreszing lagere niveaus, zowel in vitro als in vivo. Fluorescentie-intensiteit imaging gecombineerd met in situ confocale en spectrale analyse heeft ons toegestaan ​​om te controleren in vivo tumor targeting en tumorcel penetratie van HerDox na systemische toediening. Hier detail we onze methoden voor de beoordeling tumor targeting via multimode beeldvorming na systemische toediening.

Figuur 1 toont de in vivo optische imager prototype, dat is gebouwd voor het doel van de beeldvorming onder meerdere modaliteiten, zoals fluorescentie-intensiteit, spectrale, levensduur, 2-foton, intra-vitale confocale en bioluminescentie. Bovendien, de gekoelde zeer gevoelige camera en een hoog vermogen laserlijnen opgenomen in dit systeem levert een hoger contrast fluorescentiebeelden versus commercieel optische beeldvormingssystemen 11, met name voor de in vivo detectie v...

Dit artikel beschrijft de procedures voor optische beeldvorming analyse van de tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox. In het bijzonder wordt gebruik van de gedetailleerde multimode beeldvormingsinrichting voor het detecteren en beoordelen van tumor targeting tumorpenetratie beschreven.

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de in vivo systemische afgifte van het tumorgerichte nanodeeltje HeroX te detecteren en te analyseren met behulp van multimodaal optische beeldvorming. Eerst wordt het nanodeeltje geïnjecteerd in de staartvene van een tumor dragende muis en worden fluorescentiebeelden verkregen met een multimodaal optisch beeldvormingssysteem. Na euthanasie worden de tumor en organen geoogst en opnieuw in beeld gebracht om fluorescerende deeltjes binnen de tumorcellen te detecteren.Vervolgens wordt in situ confocale beeldvorming uitgevoerd. Analyse van de resulterende beelden toont kwantificeerbare targeting en penetratie van her docs in tumoren na systemische toediening. Een belangrijk voordeel van multimodale beeldvormingstechnieken ten opzichte van bestaande technieken, zoals enkelvoudige beeldvormingsmodi, is het verschaffen van meerdere en complementaire informatie die de analyse en kwantificering van de tumorlevering kan verbeteren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van geneesmiddelentoediening, zoals de vraag of een doelgericht geneesmiddel niet alleen bij tumoren terechtkomt, maar ook daadwerkelijk in tumorcellen penetreert. De procedure in dit protocol zal worden gedemonstreerd door Dr. J Yun Wang, een voormalig postdoc-onderzoeker in mijn laboratorium, en Janet Markman, een huidige promovendus. Zes tot acht weken oud.Er worden nieuwe muizen gebruikt met bilaterale subcutane flank-xenografttumoren. Bereid de systemische toediening voor door voldoende HeroX te mengen met steriele zoutoplossing om 0,2 milliliter van een dosis van 0,004 milligram per kilogram HeroX per injectie te verkrijgen. Trek voorzichtig 0,2 milliliter van het HeroX-mengsel op in een insulinespuit van 0,3 cc, voorzien van een naald met maat 29 gauge.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn na de anesthesie. Injecteer het volledige mengsel in de staartvene na de injectie. Knijp in de staart om bloedverlies vanuit de injectieplaats te voorkomen.Nadat het bloeden is gestopt, reinigt u de injectieplaats met een steriel wattenstaafje en plaatst u de muis terug in de kooi. Herhaal de injectie bij dezelfde muis gedurende nog zes opeenvolgende dagen. De accumulatie van HeroX-fluorescentie in de tumoren kan één keer per dag worden gedetecteerd tot de laatste injectiedag.Dag zeven, gebruikmakend van een multi-mode imager. De procedures hier maken gebruik van een optisch beeldvormingssysteem met mogelijkheden voor fluorescentie-intensiteit, spectrale fluorescentie, levensduur en intravitale confocale beeldvorming. Hier wordt het prototype van de in vivo optische imager getoond.De gekoelde camera met hoge gevoeligheid en de krachtige laserlijnen die in dit systeem zijn geïntegreerd, leveren fluorescentiebeelden met een hoger contrast op vergeleken met commerciële optische beeldsystemen, met name voor de in vivo detectie van doxorubicine-fluorescentie. Schakel de multimodus in vivo optische imager in de software in. Selecteer een emissiebanddoorlaatfilter dat geschikt is voor de detectie van doxorubicine-fluorescentie.Schakel de laser in en plaats een excitatie-banddoorlaatfilter in het optische pad van de laser. Nadat een muis in de anesthesiekamer met isofluraan is verdoofd, wordt deze overgebracht naar de beeldkamer van de multimode in vivo optische imager. Plaats een neusconus over de neus van de muis en open de toevoer om continue anesthesie toe te dienen.Neem tijdens de beeldacquisitie fluorescentiebeelden met een belichtingstijd van vijf tot 15 seconden. De fluorescentie van het doc kan worden vastgelegd in tumoren en specifieke organen, waaronder de lever, nier, milt, het hart en skeletspieren, geoogst van geëuthanaseerde muizen 24 uur na de laatste injectiedag. Zet de multi-mode in vivo optische imager aan.Plaats vervolgens de tumoren en specifieke organen gerangschikt op een Petrischaal. Leg de weefsels in de beeldvormingskamer van de multimode in vivo optische imager en maak fluorescentiebeelden met een belichtingstijd van 5 tot 15 seconden. Herhaal vervolgens dezelfde acquisities met een lege Petrischaal, die na de acquisitie als achtergrond zal dienen.Voer beeldanalyse en -verwerking uit, inclusief achtergrondcorrectie of contrastaanpassing. In situ confocale beeldvorming maakt detectie en analyse van de tumoraccumulatie van de kudde op cellulair niveau mogelijk. Maak hiervoor gebruik van een confocale microscoop.Selecteer laserlicht van 488 nanometer voor excitatie van doxorubicine en emissiegolflengten van 560 nanometer tot 620 nanometer. Selecteer voor de fluorescentiedetectie van doxorubicine een 40 x of 63 x objectief en breng hier een druppel immersie-olie op aan. Plaats de tumoren van de geëuthanaseerde muis op een Petrischaal om weefseldegeneratie te voorkomen.Breng de tumoren vervolgens over naar een delta T-kamer voor confocale beeldvorming. Neem confocale beelden van de tumoren op opeenvolgende brandpuntsdieptes met een stapgrootte van 1 micron en een dikte van 20 microns. Een voorbeeld van opeenvolgend verkregen beelden langs de Z-as wordt hier getoond.Genereer Z-projecties met maximale intensiteit van de beelden. Bereken vervolgens met ImageJ of een vergelijkbaar programma de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de Z-projectiebeelden met maximale intensiteit voor de verhouding van het totale gezichtsveld. Metrische spectrale beeldvorming en analyse maken discriminatie mogelijk tussen doxorubicine-fluorescentie en autofluorescentie.Leg met een laser-scanning fluorescentie confocale microscoop 15 beelden vast van de HeroX-behandelde en onbehandelde tumoren op een gespecificeerde diepte binnen het spectrale bereik van 510 tot 650 nanometer met een stapgrootte van 10 nanometer en excitatie bij 488 nanometer licht met behulp van een Leica SPE confocale microscoop. Bereid vervolgens een 100 micromolair doxorubicine-oplosmiddel in zoutoplossing voor. Voer spectrale beeldvorming uit van de 100 micromolaire doxorubicine-oplossing.Om de zuivere spectrale signatuur van doxorubicine-fluorescentie te verkrijgen, wordt de autofluorescentie-spectrale signatuur uit de beeldkubus verkregen door onbehandelde tumoren te beelden. Zodra alle gegevens zijn verzameld, worden referentie-spectrale signaturen gegenereerd, wordt een spectrale classificatie van de beelden uitgevoerd en wordt een lineaire spectrale ontmenging van deze beelden uitgevoerd om een kwantitatieve beoordeling van de ophoping van doxorubicine in tumoren te verkrijgen.Confocale fluorescentiebeelden werden in situ verkregen op verschillende brandpuntsdieptes, gevolgd door een Z-projectie van maximale intensiteit van de beelden en de acquisitie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het geprojecteerde beeld. De hoge tumorfluorescentie die in dit beeld wordt getoond, is typisch na systemische toediening van her docs en is indicatief voor de tumorpreferentiële targeting ervan. De fluorescentie die in de skeletspier is gedetecteerd, is atypisch en kan het gevolg zijn van anomalieën in de injectieprocedure.Kwalitatief gezien heeft deze afbeelding een lage achtergrond. Voor kwantitatieve analyse wordt een achtergrondcorrectie uitgevoerd met behulp van een lege schaal, zoals hier wordt getoond. De resulterende achtergrondgecorrigeerde afbeelding heeft aan de rand van de afbeelding een hoger achtergrondsignaal vergeleken met het origineel, omdat de achtergrondafbeelding aan de rand van de afbeelding lagere intensiteiten heeft.De gestapelde beelden aan de linkerzijde zijn representatief voor de confocale scans van tumorweefsel, verkregen bij sequentiële dieptes van één micron. De afbeelding aan de rechterzijde toont de compilatie van de gestapelde beelden aan de linkerzijde. De compilatie-afbeelding bevat de HeroX-accumulatie-informatie over de aangegeven Z-dieptes per pixel, waardoor het gemiddelde van de fluorescentie-intensiteiten de algehele accumulaties van herd doc in tumoren op verschillende dieptes kwantitatief weerspiegelt.Om de fluorescentie van herd doc te onderscheiden van autofluorescentie in tumoren en deze twee kwantitatief te differentiëren met hoge specificiteitsratio-metrieken, worden spectrale beeldvorming en analyse uitgevoerd. Deze afbeelding toont de zuivere spectrale signaturen voor doxorubicine.De fluorescentie-intensiteit van het afgebakende gestippelde gebied bij de aangegeven emissiegolflengten produceert een histogram dat het profiel van doxorubicine over het golflengtespectrum van 510 tot 650 nanometer laat zien. Hier worden de zuivere spectrale signaturen voor autofluorescentie getoond. De fluorescentie die door een onbehandelde tumor wordt uitgezonden bij de aangegeven emissiegolflengten produceert een helling die het emissieprofiel van de autofluorescentie vertegenwoordigt.Referentie.Spectrale signaturen werden ook gecreëerd door verschillende verhoudingen van de zuivere spectrale signaturen te mengen. Met behulp van het programma hebben we elke referentie ontwikkeld. De spectrale signatuur vertegenwoordigt hier de relatieve fluorescentie van haar docks die in tumoren zijn opgehoopt ten opzichte van autofluorescentie.Nadat de spectrale signaturen van de docks en de autofluorescentie zijn verkregen, worden de dock-signalen gescheiden middels lineaire spectrale ontmenging. De figuur toont het gemengde beeld van de autofluorescentie en de docks vóór de spectrale ontmenging en het gescheiden beeld van de docks na de spectrale ontmenging. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescentie-intensiteit, comfort car en spectrale imaging-modaliteiten gecombineerd kunnen worden om de analyse en kwantificering van tumorafgifte te verbeteren.Vergeet niet dat het werken met doxorubicine gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van dubbele handschoenen en het frequent vervangen van handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

analysis-targeted-viral-protein-nanoparticles-delivered-to-her2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Een voorbeeld van een nano geneesmiddel op basis polymalic zuur gepresenteerd naar het rationele ontwerp van gepersonaliseerde geneeskunde die voor kanker. Het beschrijft de synthese van een nano geneesmiddel Her2-positieve menselijke borst kanker in naakt muizen.

Polymalic Acid-gebaseerde Nano Biopolymeren voor Targeting van Multiple Tumor Markers: een kans voor Gepersonaliseerde Geneeskunde?

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie. Het protocol omvat ook antilichaam conjugatie aan de nanodeeltjes door de Fc eenheid voor diverse biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen.

Synthese van Immunotargeted Magneto-plasmonische Nanoclusters

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Leer de analyse van HerDox-nanodeeltjes in HER2+ tumoren met multimodale optische beeldvorming. Deze methode toont gerichte aflevering en penetratie aan voor verbeterde kankertherapie.

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

Meer video's verkennen