Name: Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Leer dynamische klemtechnieken voor het bestuderen van synaptische geleidingen in retinale ganglioncellen van muizen. Deze methode onderzoekt hoe excitatoire en inhibitatoire inputs neurale activiteit beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door de Australische Research Council (ARC DP0988227) en de Biomedische Wetenschappen Research Initiative Grant van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. De apparatuur Patch Clamp Amplifier EPC 8 werd gefinancierd door het Fonds Startup van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. De apparatuur InstruTECH LIH 8 8 Data Acquisition System werd gekocht met het geld van Rebecca L. Kuiper Foundation en Startup Fund van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. We zouden graag de anonieme reviewers bedanken voor hun inzichtelijke suggesties en opmerkingen.

1. Algemene Set Up en Tissue Voorbereiding <ol><li> Houd de muis in het donker gedurende 30 minuten (gericht haar stress niveau te verlagen). Tijdens het wachten, bereiden 1 L van extracellulaire oplossing. Los eerste 1,9 g natriumbicarbonaat in een halve liter Milli-Q water. De pH wordt op 7,4 door borrelen met 95% O2 en 5% CO2. Vijf minuten later, los 8,8 g Ames Medium in 100 ml Milli-Q water, toe te voegen aan de oplossing van natriumbicarbonaat, top tot 1 L met Milli-Q water en meng goed. Bewaar deze oplossing carboxygenated de rest van het experiment. </li><li> Breng 250 ml van de carboxygenated Ames Medium en het opzetten van de vloeistof reperfusie systeem in de elektrofysiologische set-up. Bewaar de oplossing carboxygenated. </li><li> Gelijkmatig uitstrijkje een dun laagje vacuüm vet op de bodem van de perfusie kamer. Sluit deze af met een deksel slip en zorg ervoor dat het luchtdicht. Neem een ​​kleine hoeveelheid vet (~ 2 mm in diameter) en plaats het op de boven-enonderste uiteinden van de kamer. Deze ballen zullen de grid (platina kader bespannen met flosdraad) op zijn plaats houden en voorkomen dat het te stevig op het netvlies. Bevestig de kamer op het platform en lijn beide openingen. </li><li> Het dier wordt eerst verdoofd met isofluraan gedurende 2 min, en vervolgens gedood door cervicale dislocatie. Snel ogen verwijderen met een paar kleine schaar (schoepen), grondig wassen met carboxygenated extracellulair vocht in een kleine beker, en dan plaatsen in een petrischaal gevuld met carboxygenated extracellulair vocht. </li><li> Onder de microscoop ontleden, maakt een insteekopening in het hoornvlies (~ 2 mm van de rand) met een 19 gauge naald. Herhaal voor het andere oog. Deze belangrijke stap moet snel zijn om zuurstofvoorziening van beide retinae toestaan. Verwijder een cornea met een klein paar van iris schaar door parallelle snijden aan de rand. Verwijder vervolgens de iris en de lens met een paar fijne tang. Herhaal voor het andere oog. Overdracht een oog beker in een bekerglas metcarboxygenated extracellulaire oplossing. </li><li> Met een scalpel, snij een oogschelp in de helft, kunnen de hele-mount plat en twee hele mounts per retina verkrijgen. Scheiden het netvlies voorzichtig uit het pigment epitheel met een bot ontleden sonde of door voorzichtig los te trekken. Eenmaal los, het netvlies is tamelijk doorzichtig. Let op de convexe oppervlak is de fotoreceptoren kant. Het concave oppervlak van de ganglioncellen kant en het vastplakken aan zich door de aanwezigheid van kleverige glasachtige humor. </li><li> Met een paar fijne tang, houdt u de rand van de vrijstaande netvliesweefsel dicht bij de ora serrata en pak de ora serrata met een ander paar fijne tang, trek hem naar het centrum van het netvlies. Dit is een delicaat proces en kan een paar pogingen nemen. Indien succesvol, worden ora serrata, ciliaire lichaam en glasvocht verwijderd door deze werkwijze, en de kromming van het netvlies wordt (bijvoorbeeld platter). </li><li> Trim de randen, en vervolgens overbrengen naar de perfusiekamer met ganglioncellen naar boven. Houd het weefsel op zijn plaats door het plaatsen van het rooster op het vet ballen. Plaats restmateriaal met het andere oog beker voor later gebruik. Vergelijkbare procedures voor retinale dissectie worden beschreven in Middleton en Protti 16 en Pottek et al.. 17. </li><li> Monteer de opname kamer onder een microscoop rechtop. Onmiddellijk zetten de continue perfusie van het netvlies met carboxygenated extracellulaire oplossing (35,5 ° C) met een snelheid van 3 - 5 ml / min. Zorg ervoor dat de aardelektrode is op zijn plaats. </li><li> Aan de microscoop een digitale camera waardoor visualisatie van het weefsel. De hele set-up zit boven een air tabel (schokabsorptie) en in een kooi van Faraday (blokken externe statische en niet-statische elektrische velden). </li><li> Schakel de lichtbron (infrarood,&gt; 850 nm) en met een 40X objectief, breng de focus op de cellichamen van zenuwcellen. Vind de centrale ruimte van de hele-mount voor Recording. </li><li> Ontdooi een bevroren flacon K + gebaseerde intracellulaire oplossing (300 pl, pH = 7,4) bevattende (in mM) K-gluconaat: 140, HEPES acid: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 en EGTA: 10. Alle reagentia gekocht bij Sigma-Aldrich. </li></ol> 2. Patchen Cell Organen van retinale ganglioncellen <ol><li> Eerste brand polijsten de uiteinden van borosilicaatglas capillaire glazen buis, en trek ze met een glas micro-elektrode Puller met twee stappen verwarming (weerstand: 5-8 MQ). </li><li> Voeg 3 ul van Lucifer Yellow (eindconcentratie 0.2%) naar de intracellulaire oplossing, meng goed, en centrifuge het. Vervolgens dragen de top 85% van de oplossing in een 1 ml spuit, sluit het aan op een 0,22 pm f Ilter eenheid, vervolgens naar een 30 G herbruikbare injectienaald. Koel. </li><li> Bevestig de glazen pipet, van vergelijkbaar formaat tip als die worden gebruikt voor de opnames, in de houder en schuif het onder de microscoop met een micromanipulator. Onder een 40X objectief, langzaam lager de pipet totdat deze een klein kuiltje op het oppervlak van het binnenste beperkende membraan. Zorgvuldig vooraf de pipet naar voren totdat deze vangt een kleine hoeveelheid weefsel, en dan verplaatsen naar boven en / of zijwaarts naar een klein gaatje aan de cellichamen van de ganglion cellen bloot te scheuren. Hoe kleiner de opening, hoe hoger de mate van integriteit van het netvlies net gewaarborgd blijft. Desgewenst sulforhodamine 101 (SR101, 0,5-1 uM) kunnen worden toegevoegd aan het extracellulaire medium van beschadigde neuronen labelen met fluorescentiemicroscopie 15. </li><li> Vul een schone pipet met 8-10 pl intracellulaire oplossing. Steek deze in de houder bevestigd aan het hoofd podium van de versterker en zorg ervoor dat de gechloreerde zilverchloride elektrode wordt ondergedompeld. Weggooien als vuil en / of luchtbellen aanwezig is / zijn. </li><li> Schakel alle apparatuur. We gebruikten een EPC 8 patch clamp versterker aangestuurd door PatchMaster om whole-cell opnames realiseren in spanningsklem configuratie. Merk op dat andere versterkers die stroomklem opnames toestaan ​​in de snelle modus kan ook worden gebruikt. Toepassen en onderhouden van positieve druk in de pipet oplossing. Selecteer een cel met een grote cellichaam dus waarschijnlijk het is een ganglion cel dan een verplaatst amacrine cel of een glia cel. Langzaam zakken de pipet tip dus het is een kleine kuiltje op het oppervlak van het membraan, stoppen, en laat de druk. Onmiddellijk lager de holding potentieel om - 60 mV. Zodra een gigaseal (GQ) wordt bereikt tussen hen, zachtjes zuigen aan het membraan te breken naar een whole-cell patch clamp configuratie te bereiken. Deze procedure is een delicate stap, als er teveel negatieve druk wordt toegepast, is de verbinding lek wordt, indien te weinig, het membraan intact blijft. </li><li> Na verloop van tijd, zal Lucifer Geel de cel te vullen, waardoor visualisatie van de morfologie van de cel. Indienstabiel moet deze set-up 30 min of meer duren. </li></ol> 3. Opnames van ganglioncellen gebruiken Dynamic Clamp <ol><li> Ten eerste, een stroom-voltage test (van - 75 tot + 35 mV elke 10 mV) wordt uitgevoerd met behulp van PatchMaster. Overgaan tot later testen alleen als een groot Na + stroom (&gt; 1 nA) aanwezig is. Merk op dat in de zeldzame gelegenheid waar een ontheemde amacrine cel is gepatcht, in dat geval, zal niet antwoorden met treinen van actiepotentialen op latere huidige injecties. </li><li> Open LabVIEW en uitvoeren van de op maat geschreven Neuroakuma programma, dan laadt verschillende geleiding golfvormen. Stel herhaal nummer tot 8 (6 - 8 voor statistische doeleinden). Set omkering potentieel van prikkelende en remmende conductances bij 0 en - respectievelijk 75 mV. Selecteer een bijpassende paar prikkelende en remmende conductances voor het testen. Prikkelende geleiding trace (in groen) en remmende geleiding trace (in rood) verschijnen op het onderste paneel. </li><li> Ga terug naar PatchMaster, selecteert stroomtang modus, en meteen overschakelen van de versterker naar stroomtang modus &#39;CC + Comm FAST&#39;. Deze modus maakt het mogelijk om accurately volgen snelle veranderingen in de membraanpotentiaal. Als er een goede afdichting tussen het membraan en de pipet wordt onderhouden, weinig / geen compensatie nodig is, anders zal de opname niet lang duren. In Neuroakuma, drukt u op de &quot;record&quot; knop. De cellulaire respons (meestal met een driefase uitbarsting van actiepotentialen, figuur 1A) verschijnt op het bovenste paneel. Injecteren stroom in de cel met lage schalen van conductances eerste, als weinig / geen antwoord wordt waargenomen, te verhogen in kleine stapjes totdat het produceert een sterke reactie. Overmatige stroom injectie kan de cel te doden. Zodra tests zijn voltooid, selecteert u een nieuw paar geleiding golfvormen, herhaalt u de bovenstaande voor alle paren van fysiologische en kunstmatige geleidingen. De fysiologische stromen (I) geïnjecteerd in real time zijn gebaseerd op: I (t) = G exc (t) x (Vm (t) - V exc) + inw G (t) x (Vm (t) - V inw) </li></ol> Geleiding (G in ns) zou kunnen zijn synaptic of kunstmatig. Prikkelende en remmende synaptische geleiding golfvormen werden uit eerdere experimenten uitgevoerd door Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen en Solomon (ongepubliceerde resultaten) in reactie op verschillende stimuli in visuele controle condities en in aanwezigheid van tetrodotoxine (TTX, 1 uM) . Kunstmatige geleiding golfvormen werden gemodelleerd met een alfa functie. V m (in mV) is de opgenomen membraanpotentiaal. G exc en G inh vertegenwoordigen prikkelende en remmende conductances respectievelijk terwijl V exc en V inh vertegenwoordigen de omkering potentieel van prikkelende en remmende conductances respectievelijk. Tijd is t in ms. Bemonsteringsfrequentie is 40 kHz. I s = I 0 (t / α) e-αt De bovenstaande vergelijking is een alpha-functie (I 0 = maximale stroom; 1 / α = tijd tot piek (sec-1) van de huidige). De stijgtijd en de vervaltijd van de synaptischestroom wordt bepaald door α 4. De prikkelende geleidbaarheid was onveranderd terwijl de latentie van de remmende geleiding werd gewijzigd, waardoor de vertraging ten opzichte van het begin van excitatie (figuur 2D). <ol start="4"><li> Na de opname, zorgvuldig de pipet terug te trekken, zodat de cel lichaam intact blijft. Onmiddellijk de tissue in 4% paraformaldehyde gedurende 30 min, gevolgd door drie 10 min wassingen met 0,1 M fosfaatbuffer. Koel en uitvoeren antilichaamkleuring de volgende dag of binnen een week. </li></ol> 4. Antilichaamkleuring tegen Lucifer Yellow Gevuld retinale ganglioncellen <ol><li> Antilichaamkleuring tegen Lucifer Yellow gevuld ganglioncellen bij kamertemperatuur (primaire anti-Lucifer Yellow rabbit IgG (verdunning = 1:10.000) gedurende vijf dagen, op de zesde dag overnacht kleuring met secundaire geit anti-konijn IgG (1:500 verdunning = )). Nat monteren het netvlies in Fluorescent Behoud Media. Bedek slip en verzegelen met nagel polish. </li><li> Neem confocale beelden van de cel morfologie met een Leica Spec-II confocale microscoop (Figuur 1B). De aanwezigheid van een axon maakt de bevestiging van ganglioncellen. </li></ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

Alle procedures werden voor het eerst goedgekeurd door de Animal Care Ethische Commissie van de Universiteit van Sydney, en vervolgens uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Australische Code of Practice voor de verzorging en gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (National Health en Medical Research Council of Australia ).

Hier tonen we gebruik van dynamische klem om de invloed van de verhouding en de relatieve timing van excitatie en inhibitie van retinale ganglioncellen uitgang beoordelen. Dynamische klem wordt gebruik gemaakt van computersimulaties om fysiologisch opgenomen of kunstmatige synaptische conductances introduceren in levende neuronen. Deze methode biedt een interactief instrument waarmee geleidingen kunnen worden gemodificeerd en geïnjecteerd in neuronen voor het berekenen van hun invloed op neuronale reacties. Conductantie...

Het netvlies is een bijna transparante neuraal weefsel langs de achterkant van het oog. Veel studies gebruiken het netvlies als het model om de eerste stappen in de verwerking van visuele en mechanismen van synaptische signalering te onderzoeken. Aangezien de retinale netwerk van het-mount preparaat intact blijft na sectie, vormt dit een ideaal systeem synaptische interacties te bestuderen als fysiologische reacties zijn vergelijkbaar met de in vivo omstandigheden. Dus, met behulp van een geïsoleerde retina de eigenschappen van zijn neuronen kunnen worden bestudeerd met behulp van patch clamp technieken (voor reviews over de techniek, zie 6,9,13). Identificatie van de precieze bijdrage van specifieke circuits en neurotransmitters ganglion cel respons echter meestal belemmerd als farmacologische middelen werken op verschillende sites. Fysiologische reacties van retinale neuronen aan het licht, de natuurlijke stimulus, kan worden opgenomen met glazen pipetten gevuld met intracellulaire vloeistof. Met behulp van patch clamp technieken, neuronale reacties op licht stimulatie kan worden opgenomen als membraanpotentiaal fluctuaties (stroomtang) of als stromingen (voltage clamp). Door die de membraanpotentiaal op verschillende voltages en uitvoering a posteriori geleiding analyse is het mogelijk remmende en prikkelende synaptische inputs isoleren 5,12. Dit soort experimenten worden uitgevoerd in normale baden medium en in de aanwezigheid van verschillende farmacologische middelen om de bijdrage van verschillende neurotransmitters en receptoren neuronale reacties isoleren. Een schat aan studies van vele laboratoria gekarakteriseerd de afhankelijkheid van stekelige output en prikkelende en remmende ingangen op stimulus eigenschappen zoals grootte, contrast, ruimtelijke en temporele frequenties, richting, oriëntatie en andere stimulus variabelen. Hoewel deze experimentele benaderingen geven informatie over de relatie tussen de spike output en synaptische inputs als functie van stimulus eigenschappen,interpretatie van de bijdrage van specifieke celtypen en hun synaptische inputs naar cel exciteerbaarheid niet eenvoudig. Dit komt door het feit dat zowel typische prikkelende en remmende inputs variëren stimulus eigenschappen en dus is het niet mogelijk om het precieze effect dat veranderingen in een van deze parameters moet op neuronale spiking beoordelen. Een alternatieve benadering om deze beperkingen te omzeilen is voor het uitvoeren van dynamische clamp opnames, die een kritische evaluatie van de bijdrage van de individuele synaptische inputs naar stekelige uitgang toestaan. De dynamische clamp techniek maakt directe injectie van stroom in de cel en de hoeveelheid stroom geïnjecteerd in een bepaald afhankelijk van de opgenomen membraanpotentiaal destijds 1,2,3 (zie voor 7,14). Het is een gemodificeerde stroomklem set-up waarbij een real-time, snelle feedback interactie tussen de cel onder opname en de apparatuur bestaande uit gespecialiseerde hardware, softwareen een computer bereikt. De hoeveelheid stroom geïnjecteerd in de cel wordt dienovereenkomstig berekend. Vandaar dat het voordeel van deze methode is dat de cellen kunnen worden gestimuleerd met verschillende combinaties geleidingstijd golfvormen en de reactie zal de activatie van receptoren die synaptische inputs bemiddelen nabootsen. Bijvoorbeeld, vergelijking van de reactie op injectie van prikkelende en remmende geleidingen voor een kleine vlek met de reactie op injectie van prikkelende geleiding voor een kleine vlek alleen informatie over het effect van remming op de celrespons. Ook andere combinaties van fysiologisch opgenomen conductances collocatie kan worden geïnjecteerd om te onthullen hoe stimulus-afhankelijke veranderingen in prikkelende en / of remmende conductances invloed spike output. In onze studie is de dynamische clamp techniek gebruikt om het effect van de relatieve amplitude en tijdstip van synaptische inputs op de vuurgedrag van retinale ganglion cellen vertonen. Diverse conductantiesverkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of in aanwezigheid van farmacologische middelen werden gebruikt als input. Daarnaast zijn kunstmatige geleidingen gebaseerd op alpha functies ook gebruikt om te onderzoeken hoe synaptische inputs worden geïntegreerd door neuronen. Dit is dus een veelzijdige techniek die het mogelijk maakt verschillende soorten geleiding gegenereerd ofwel fysiologisch, farmacologisch of rekenkundig worden geïnjecteerd in dezelfde ganglion cel, zodat de respons op deze ingangen worden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Isofluraane Inhalatieanesthesie</td><td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Medium met L-Glutamaat (Poeder)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumgluconaat, Watervrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES Natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorideoplossing (4,9 mol/l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) dinatriumzouthydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5'-trifosfaat natriumzouthydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-amino–ethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Poeder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lucifer Geel, Konijn IgG Fractie (3 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Geit Anti-Konijn IgG (H+L) 2 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Behoud Media</td><td>BioFX Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Utrusting</td></tr><tr><td>Kapillair glazen buis met vlam gepolijste uiteinden (OD = 1,50 mm, ID = 0,86 mm, Lengte = 15 cm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>Enkeltraps glazen micro–elektrode Puller</td><td>Narishinge Japan</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 2</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 0,22 &mu;m Filter Unit</td><td>Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Herbruikbare Hypodermische Naald: 30 G</td><td>Smith Nephew (Australië)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enkel Inline Oplossing Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>Model SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Dual Automatische Temperatuur Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomicroscoop SZ61</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus Microscoop BX50WI: met 40X objectief</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2,5 A DC Voeding</td><td>Dick Smith Electronics</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Microscopische Camera ProgResMF cool</td><td>Jenoptik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator MP-225</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Versterker EPC 8</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisitie Systeem</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uitvoering dynamic klem met synaptic en kunstmatige geleidingen mouse in retinale ganglioncellen

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglioncellen de output vormen van de retina en de activiteit weerspiegelt de integratie van meerdere synaptische inputs die samenhangen met specifieke neurale circuits. Patch-clamp technieken, in voltage en stroom clamp clamp configuraties worden gewoonlijk gebruikt om de fysiologische eigenschappen van neuronen te bestuderen en om hun synaptische inputs karakteriseren. Hoewel de toepassing van deze technieken is zeer informatief, zij vormen diverse beperkingen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk te kwantificeren hoe de precieze interacties van prikkelende en remmende inputs bepalen reactie output. Om dit probleem aan te pakken, hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde stroom clamp techniek, dynamische klem, ook wel geleiding klem 1, 2, 3 en onderzocht de impact van de prikkelende en remmende synaptische inputs op de neuronale prikkelbaarheid. Deze techniek vereist de injectie van stroom in de cel en is afhankelijk van de real-time feedback van de membraanpotentiaal op dat moment. De injected stroom wordt berekend op basis van vooraf bepaalde prikkelende en remmende synaptische conductances, hun omkering potentieel en ogenblikkelijke membraanpotentiaal van de cel. Details over de experimentele procedures, worden patch klemmen cellen om een ​​whole-cell configuratie en de werkgelegenheid van de dynamische clamp techniek bereiken geïllustreerd in deze video artikel. Hier tonen we de responsen van muizen retinale ganglioncellen verschillende geleiding golfvormen verkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of de aanwezigheid van drugs. Verder tonen we het gebruik van kunstmatige prikkelende en remmende geleidingen gegenereerd middels alpha functies om de reacties van de cellen te onderzoeken.

De bijdrage van de verschillende bronnen van remmende ingangen aan ganglion cel responsen wordt aangetoond door de toepassing van verschillende geleiding golfvormen. Deze golfvormen werden verkregen met stimuli van verschillende luminantie in normale omstandigheden en in aanwezigheid van TTX, een spanningsafhankelijke Na + kanaal blocker blokkeert actiepotentiaal genereren slechts een subset van retinale remmende interneuronen. Figuur 2A toont een representatief reactie op injectie van prikke...

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van veranderingen in de verhouding en relatieve timing van excitatoire en inhibitoire synaptische input op de spiking-activiteit van neuronen te onderzoeken, waarbij retinale ganglioncellen als modelneuronen dienen. Dit wordt bereikt door de cellichamen van een ganglioncel in een whole-mount retina te patchen met een glazen pipet gevuld met een intracellulaire oplossing die lijkt op de fysiologische ionensamenstelling en Lucifer yellow om in een tweede stap het celtype morfologisch te identificeren. Met behulp van dynamic clamp worden vervolgens een reeks excitatoire en inhibitoire conductantie-golfvormen in het cellichaam geïnjecteerd, die als reactie een verandering in het membraanpotentiaal teweegbrengen. Vervolgens worden diverse conductantie-golfvormen, verkregen uit fysiologische experimenten onder controlecondities of in aanwezigheid van geneesmiddelen, in het cellichaam geïnjecteerd om de overeenkomstige neuronale responsen te verkrijgen.De resultaten tonen de effecten van veranderingen in de verhouding tussen excitatie en inhibitie op de spiking-activiteit van retinale ganglioncellen, op basis van de injectie

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video laten we zien hoe een geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron opgenomen in de whole cell configuratie in hersenen van de rat plakjes. Deze techniek heet de dynamische klem.

Toepassing van een NMDA-receptor Conductance in Rat middenhersenen dopaminerge neuronen Met behulp van de Dynamic clamp techniek

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.

Elektrofysiologische onderzoeken van Retinogeniculate en Corticogeniculate Synapse functie

We vatten een workflow samen om het gedrag van een netvliesneuron computationeel te modelleren als reactie op elektrische stimulatie. Het computationele model is veelzijdig en omvat automatiseringsstappen die nuttig zijn bij het simuleren van een reeks fysiologische scenario's en het anticiperen op de uitkomsten van toekomstige in vivo / in vitro studies.

Computationele modellering van retinale neuronen voor visueel protheseonderzoek - Fundamentele benaderingen

Dynamische klemelektrofysiologie kan causale verbanden leggen tussen neuronale vuurtekorten en disfunctie van ionkanalen. We beschrijven dynamische klemmethoden en protocollen in de cerebellaire Purkinje-neuronen van muizen, waarbij we nuttige bronnen en technische overwegingen opmerken. In een representatieve studie voegen we gemodelleerde natriumgeleiding toe aan Tsc1-/- Purkinje-neuronen om herhaald vuren te redden.

Dynamische klemmethoden om verminderde neuronale prikkelbaarheid geassocieerd met autisme te onderzoeken

Leer dynamische klemtechnieken voor het bestuderen van synaptische geleidingen in retinale ganglioncellen van muizen. Deze methode onderzoekt hoe excitatoire en inhibitatoire inputs neurale activiteit beïnvloeden.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Meer video's verkennen