Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van veranderingen in de verhouding en relatieve timing van excitatoire en inhibitoire synaptische input op de spiking-activiteit van neuronen te onderzoeken met retinale ganglioncellen als modelneuronen. Dit wordt bereikt door het cellichaam van een ganglioncel in een gehele montageretina te patchen, met behulp van een glazen pipet gevuld met een intracellulaire oplossing die de fysiologische ionensamenstelling nabootst en Lucifer geel om het celtype morfologisch te identificeren als tweede stap. Met behulp van dynamische clamp worden een reeks excitatoire en inhibitoire geleidingsgolfvormen in het cellichaam geïnjecteerd, die een verandering in membraanpotentiaal als reactie produceren. Vervolgens worden verschillende geleidingsgolfvormen verkregen uit fysiologische experimenten onder controlecondities, of in aanwezigheid van geneesmiddelen, in het cellichaam geïnjecteerd om de corresponderende neuronale reacties te verkrijgen.

De resultaten tonen de effecten van veranderingen in de verhouding van excitatie en inhibitie op de spiking-activiteit van retinale ganglioncellen op basis van de injectie van stromen bestaande uit excitatoire en inhibitoire geleiding via dynamische clamp-opnamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals stroomclamp of spanningsclamp, is dat het een interactief hulpmiddel biedt waarmee de verhouding en de relatieve timing van excitatoire en inhibitoire synaptische geleiding in neuronen kunnen worden geïnjecteerd om de invloed op cellulaire reacties te onderzoeken. Deze methodologie kan inzicht geven in de functie van retinale circuits en van andere neuronale netwerken in het centrale zenuwstelsel.

Begin deze procedure door het reperfusionssysteem op te zetten met 250 milliliter van het gecarboxyleerd geoxygeneerd aims medium in de elektrofysiologische opstelling. Smeer vervolgens een dunne laag vacuümvet gelijkmatig op de bodem van de perfusiekamer. Verzegeld het met een dekglas en zorg ervoor dat het luchtdicht is.

Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid vet op de boven- en onderkant van de kamer. Het vet zal het raster op zijn plaats houden en voorkomen dat het te hard op de retina drukt. Bevestig nu de kamer op het platform en lijn beide openingen daarna uit.

Offer een dier op door middel van cervicale dislocatie nadat het is verdoofd met isoflurine. Verwijder snel de ogen met een paar kleine gebogen scharen. Was ze grondig met car geoxygeneerd extracellulair vloeistof in een kleine beker en plaats ze in een petrischaal gevuld met car geoxygeneerd extracellulair vloeistof.

Maak onder de dissectiemicroscoop een invoergat met een 19 gauge naald in het hoornvlies op ongeveer twee millimeter van de rand op beide ogen. Deze belangrijke stap moet snel zijn om oxygenatie van beide rein a mogelijk te maken. Verwijder vervolgens een hoornvlies met een klein paar irisscharen door parallel aan de rand te snijden.

Verwijder vervolgens de iris en lens met een paar fijne pincetten en herhaal de procedures voor het andere oog. Breng een oogkom over in een beker met de carboxy geoxygeneerde extracellulaire oplossing. Snijd met de scalpelmes een oogkom voorzichtig doormidden en scheid de retina voorzichtig van het pigmentepitheel met behulp van een botte dissectiepincet of door het voorzichtig eraf te trekken.

Houd vervolgens de rand van het losgemaakte retinale weefsel dicht bij de aura serta met een paar fijne pincetten en grijp de aura serta met een ander paar fijne pincetten. Trek het naar het centrum van de retina. Dit is een delicaat proces en kan een paar pogingen vergen.

Als het succesvol is, worden het ciliary lichaam van de aura serta en het glasvocht verwijderd en wordt de kromming van de retina verkleind. Trim vervolgens de randen en breng de retina over naar de perfusiekamer met de ganglioncellen naar boven. Houd het weefsel op zijn plaats door het raster op de vetbollen te plaatsen.

Bewaar het overgebleven weefsel met de andere oogkom in de carboxy geoxygeneerde extracellulaire oplossing voor later gebruik. Monteer de opnamekamer onder een rechtopstaande microscoop. Pas onmiddellijk de continue perfusie van de retina aan met carboxy geoxygeneerde extracellulaire oplossing met een snelheid van drie tot vijf milliliter per minuut bij 35,5 graden Celsius, zorg ervoor dat de aardingselektrode op zijn plaats is. Schakel nu de lichtbron van de microscoop in en breng deze in focus op de cellichamen van ganglioncellen via het 40 x objectief.

Loceer het centrum van de hole mount voor opname. In deze stap bevestigt u een glazen pipet van vijf tot acht mega ohm in zijn houder en beweegt u deze onder de microscoop met behulp van een microm manipulator onder een 40 x objectief. Laat de pipet langzaam zakken tot het een kleine kuil maakt op het oppervlak van de innerlijke begrenzingsmembraan.

Breng de pipet voorzichtig naar voren totdat het een kleine hoeveelheid weefsel vangt en beweeg het vervolgens omhoog en/of naar de zijkant om een klein gaatje te scheuren om de cellichamen van de ganglioncellen bloot te leggen. Vul nu een schone pipet met acht tot 10 microliters, een kalium-gebaseerde intracellulaire oplossing met Lucifer geel. Plaats deze in de houder, die aan het hoofdstadium van de versterker is bevestigd, en zorg ervoor dat de gechloreerde zilverchloride-elektrode is ondergedompeld.

Selecteer een cel met een groot cellichaam. Laat de pipettip met positieve druk langzaam zakken om een kleine kuil te maken op het oppervlak van het membraan. Stop vervolgens en laat de druk los om een giga seal te verkrijgen.

Zodra een giga seal is bereikt, brengt u voorzichtig negatieve druk aan om het membraan te breken om een whole cell patch clamp-configuratie te bereiken. Deze procedure is een delicate stap. Als er te veel negatieve druk wordt toegepast, wordt de verbinding lekkagegevoelig.

Als er te weinig is, blijft het membraan intact. Na verloop van tijd zal Lucifer geel de cel vullen, waardoor de morfologie van de cel kan worden gevisualiseerd als deze stabiel is. Deze opstelling moet 30 minuten of langer duren.

Voer nu een stroom-spanningstest uit van min 75 millivolt tot positief 35 millivolt elke 10 millivolt met behulp van patch master en ga verder met latere tests. Alleen als er een natriumstroom groter dan één nano ampère aanwezig is. Open vervolgens lab view en voer het op ma