Name: Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Leer een efficiënte methode om precursor B-cel subsets te isoleren uit navelstrengbloed met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en flowcytometrie. Deze techniek levert hoogwaardige nucleïnezuren op voor downstream analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) naar KT

1. Isolatie van mononucleaire cellen uit navelstrengbloed <ol><li> Bereid PBS-EDTA 5 ml bovine serum albumine (BSA) stockoplossing aan 95 ml spoelbuffer (1:20 verdunning) buffer-voegen. Degas de buffer en bewaar de buffer op het ijs. BELANGRIJK: Het niet ontgas de buffer kan leiden tot minder dan optimale resultaten bij het ​​isoleren van CD19 + B-cellen, omdat bellen kan de isolatie kolom blokkeren. </li><li> Bereid 50 ml conische buizen voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Bepaal het aantal buizen die nodig zijn voor het verwerken van het navelstrengbloed (1 tube kan 8 ml bloed te verwerken) en voeg 15 ml van Ficoll-Paque PLUS aan elke buis. </li><li> Verdun 8 ml van navelstrengbloed met 24 ml DPBS (1X) en voorzichtig het verdunde laag navelstrengbloed mengsel op de Ficoll-Paque PLUS in elk van de 50 ml conische buizen. Niet mengen het bloed en Ficoll-Paque PLUS. BELANGRIJK: Om te voorkomen dat het mengen van het navelstrengbloed en Ficoll-Paque PLUS, houdt u de buis in een hoek van 45 graden enlayer het bloed mengsel langzaam. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 40 min bij 20 ° C. Mononucleaire cellen (MNC) blijft op de plasma-Ficoll-Paque PLUS-interface dat granulocyten en erytrocyten sediment door hogere dichtheid bij de osmotische druk van Ficoll-Paque PLUS. Label zeven 5 ml rondbodem buizen voor gebruik in deel 3 met het monster ID, datum en de volgende: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Buis </td><td> Label </td><td> Doel </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Onbevlekt </td><td> Ongekleurde cellen voor normalisatie in flowcytometrie </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Levensvatbaarheid te bepalen tijdens flowcytometrie </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Bevat de cellen die worden gesorteerd </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Om CD34 + / CD19 verzamelt +(Late pro-B - vroege pre-BI) cellen </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 lage </td><td> / CD19 + / CD45 laag (pre-BI) cellen - aan CD34 te verzamelen </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> / CD19 + / CD45 med (pre-BII) cellen - aan CD34 te verzamelen </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 hoog </td><td> / CD19 + / CD45 hoog (onrijpe B) cellen - aan CD34 te verzamelen </td></tr></tbody></table> Coat buizen 4, 5, 6 en 7 met 2% FBS en plaats alle buizen op ijs. <ol start="5"><li> Zorgvuldig Zuig de bovenste plasma laag en vermijd contact met de mononucleaire cellaag. Met een 10 ml glazen pipet voorzichtig overdragen mononucleaire cellaag in nieuw 50 ml conische buis. Combineer de mononucleaire cellen uit drie buizen in een 50 ml buis. </li><li> Vul de buis met PBS, en meng bij 300 xg gecentrifugeerd gedurende 10 min bij20 ° C. Zorgvuldig aspireren het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Herhaal 1x. Na de eerste wasbeurt, resuspendeer de pellets en overbrengen naar een 50 ml conische buis. </li><li> Zachtjes resuspenderen de celpellet in 200 ul PBS. Verwijder 1 pi van de celsuspensie toe te voegen aan 1 ml PBS in een 1,5 ml microcentrifugebuis en gereserveerd voor het tellen (tellen cellen nadat het 50 ml celsuspensie in de centrifuge). Vul de buis met PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 15 min aan bloedplaatjes verwijderen. Volledig verwijderen van de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet. </li></ol> 2. Gewijzigd B-cel Isolatie van mononucleaire cellen met behulp van MACS Scheiding <ol><li> Resuspendeer de pellet uit stap 1.7 met 160 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. </li><li> Voeg 40 ul B-CLL biotine antilichaam cocktail. Pipetteer goed te mengen en gedurende 10 min incuberen bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen - voeg 1 ml koud (4 ° C) EDTA-PBS-buffer per 10 miljoen cellen (cel number bepaald in stap 1.7) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Zuig het volledig supernatant en resuspendeer de celpellet in 320 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. </li><li> Voeg 80 ul anti-biotine microkorrels, goed mengen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen - voeg 1 ml koude (4 ° C) EDTA-buffer PBS per 10 miljoen cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspenderen tot 100 miljoen cellen in 500 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. Scale buffervolume volgens het aantal cellen. </li><li> Bereid MACS Kolommen en MACS Separators tijdens het centrifugeren (Stap 2.5). Plaats een LS kolom in het magnetische veld van de MACS separator, 3 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer op de kolom en laat de buffer te druppelen door de kolom. Gebruik een bakje om de stroom te vangen door. Gooi de doorstroming. </li><li> Een 50 ml conische buis onder de kolom en pipetteer de celsuspensie op de kolom. Laat de niet-gelabelde cellen throug druppelenh de kolom en in de 50 ml conische buis. Belangrijk: Dit zijn de cellen die worden gebruikt voor antilichaam labeling en celsortering. Stel de stroom niet weg door. Om alle cellen van stap 2.5 herstellen, een extra 1 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer aan de wanden van de conische buis. Meng voorzichtig pipetteren en de resterende celsuspensie op de kolom. Herhaal 1x. Ga verder met stap 2.8 met de gelabelde cellen verzameld in de conische buis na het passeren door de kolom. </li><li> Vul de conische buis met ongelabelde cellen met PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Voeg 200 ul EDTA-buffer PBS en voorzichtig resuspendeer de cellen. </li></ol> 3. Antilichaam Labeling en voorbereiding voor celsortering <ol><li> Verstuif 1 pi van de celsuspensie en plaats in de buis met het label &quot;ongekleurd&quot; (Stap 1.4). Voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en slaan de buis op ijs. </li><li> Voeg 20pi van elk antilichaam (CD19, CD34 en CD45) per miljoen cellen in de resterende celsuspensie. Meng goed en plaats de buis in het donker gedurende 30 minuten bij RT. CD antilichamen zijn lichtgevoelig, voert u stap 2-4 met de lichten uitgeschakeld. </li><li> Na 30 min incubatie met antilichamen, zuig 40 pi van de celsuspensie en plaats het in de buis met het label &quot;7AAD&quot;. Voeg 1 ml PBS in de buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul bindingsbuffer. Voeg 7 pl 7AAD (7-Aminoactinomycin D) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij RT. Tijdens de 10 minuten incubatie volledig stap 3.4. </li><li> Voeg PBS naar de top van de buis met de overige cellen gelabeld met antistoffen CD. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en resuspendeer de celpellet. Breng het gehele volume van de celsuspensie in de buis met het label &quot;+ + +&quot;. Als u alle van de celsuspensie een herstellendd extra 1 ml EDTA-buffer PBS om de 50 ml conische buis en overbrengen in de buis met het label &quot;+ + +&quot;. </li><li> Na incubatie (Stap 3.3), voeg 300 ul bindingsbuffer in 7AAD buis. De &quot;ongekleurde&quot;, &quot;7AAD&quot; en &quot;+ + +&quot; samples en &quot;34 +&quot;, &quot;45 laag&quot;, &quot;med 45&quot; en &quot;45 hoog&quot; buizen klaar voor flowcytometrie. </li></ol> 4. Celsortering Met behulp van de MoFlo XDP Flow Cytometer <ol><li> Set-up MoFlo voor het sorteren: Lijn lasers; stabiliseren druppel stroom, het bepalen van daling vertraging. </li><li> Bereid enkele kleur vergoeding controles met behulp van Invitrogen AbC Mouse kraal kit (of iets dergelijks) volgens de instructies van de fabrikant. Run single kleurinstellingen, het aanpassen van de spanningen van fluorescentie-kanalen voor een optimale scheiding van positieve en negatieve populaties. Stel compensatie coëfficiënten en van toepassing gecompenseerd parameter aan collectie protocol. Herstel compensatie coëfficiënten telkens een nieuwe partij antilichaam verkregen. </li><li> Maak protocol waaronder plots zoals getoond in figuur 2. </li><li> Run ongekleurde monster, zet spanning en winst voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, en identificeren negatieve fluorescentie populaties. Omdat DNA-herstel is het doel van de soort, moet de drempel worden ingesteld laag (≤ 1%), zodat DNA-bevattende puin niet de herstelde monsters verontreinigen. * Zorg ervoor dat de Aerosol Evacuatie System draait te allen tijde die leven van menselijke cellen worden uitgevoerd op de MoFlo. </li><li> Voer een kleine hoeveelheid van de + + + sample (~ 50.000 events) aan de gating strategie (figuur 2). Omdat B-cell progenitors niet scatter identiek aan B-cellen rijpen, backgate de ungated CD19 + / CD34 + populatie op de SSC versus FSC plot te zorgen voor de lymfocytpoort omvat potentiële pro-B-cellen. Van deze steekproef ook de negatieve fluorescentie bevolking voor 7AAD. </li><li> Voer het 7AAD monster naar het levensvatbaarheid te bepalen. Enige soort cellen van een monster met een hoge levensvatbaarheid op deaanvang (≥ 95%) als dode cellen zullen zonder onderscheid vlekken en kan verontreinigen soort populaties. </li><li> Stel soort beslissingen tot vier populaties te verzamelen: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 laag; CD19 + / CD34 - / CD45 med, en CD19 + / CD34 - / CD45 hoog. Neem de lymfocyt en doublet discriminatie poorten in de soort beslissingen van alle bevolkingsgroepen. </li><li> Om klompen te voorkomen in de sorteer-tip, filter + + + monster door een 40 um cel zeef onmiddellijk voor het sorteren en opnieuw filtreer als er een aggregatie optreedt in steekproef tijdens het sorteren. </li><li> Sorteren cellen in verzamelbuizen (Stap 1.4) bekleed met 2% FBS in PBS in een gekoelde of ijs vol buishouder. </li><li> Onmiddellijk na sorteren is voltooid, extraheren DNA. </li></ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

De factor met de grootste invloed op het succes van het protocol is de aanwezigheid van verontreinigende puin. Als verzoekende bloed van een navelstrengbloed bank is het belangrijk om het bloed zo snel na monstername mogelijk verstuurd. Bovendien moeten, die als lymfocytose bevatten hogere aantallen lymfocyten, maar deze monsters niet voldoende aantallen precursor B-cellen en mag niet worden gebruikt. Om de kans dat een voldoende aantal cellen voor elk van de precursor subsets raden beginnen met ten minste 85 ml van navelstrengbloed verhogen. Het is belangrijk op te merken dat in tegenstelling tot volwassen perifere bloed scheidingen, wanneer het fractioneren van navelstrengbloed het mononucleaire laag vaak verontreinigd is met rode bloedcellen 12. Dit protocol bevat een extra wasstap aan besmettelijke bloedplaatjes te verwijderen. Protocollen beschrijven mononucleaire scheidingen uit navelstrengbloed wordt voorgesteld om een ​​lysis stap to verwijderen van ongewenste rode bloedcellen. We raden deze stap omdat het produceert vervuilende puin en heeft een negatieve invloed op het succes van de cel soort. Om het aantal cellen die moeten worden onderscheiden door middel van flowcytometrie moet een B-cel verrijking uit te voeren celsortering. Het protocol door Miltenyi Biotec, dat de B-Cell Isolation Kit (B-CLL) vergezelt, is geoptimaliseerd voor het perifere bloed en adviseert om 10 ul B-CLL biotine antilichaam cocktail per 10 miljoen cellen. Deze stap maakt antistoffen tegen CD2 (T-cellen, NK cellen), CD4 (T-cellen), CD11b (granulocyten, monocyten, macrofagen), CD16 (NK-cellen, macrofagen, mestcellen), CD36 (bloedplaatjes), CD235a (erytroïde cellen) niet-B-cel depletie van het navelstrengbloed. Het is belangrijk beschreven kit en niet B-cel isolatiekit II gebruiken omdat de eerste kit bevat een antilichaam tegen CD43 die aanwezig is op pro-B-cellen. Tijdens onze optimization van dit protocol bleek dat in totaal 40 pl B-CLL biotine antilichaam cocktail voldoende is om een ​​positieve cel soort resultaat. Bovendien vonden we dat het gebruik van slechts 5 ui meer B-CLL biotine antilichaam cocktail nadelige gevolgen voor de cel aard had. Daarom raden we het gebruik 40 ul van B-CLL biotine antilichaam cocktail voor totale mononucleaire cel aantallen tussen 175-250 miljoen. Als beginnend met lagere of hogere aantallen cellen kan het nodig dienovereenkomstig schaal van de reagentia. Er zijn tal van publicaties waarin de tegenstrijdige markers die kunnen worden gebruikt om onderscheid te subpopulaties van B-cellen. De meeste verschil kan worden verklaard door het feit dat differentiatie een continu proces en dat de aanwezigheid of afwezigheid van celoppervlaktemerkers optreedt in geleidelijke wijze plaats van in een alles of niets wijze. In dit protocol CD34 - / CD19 + en de intensiteit van CD45 + (laag, medium, hoog) expressie werd gebruikt om vooraf BI, pre-BII en onrijpe B-cellen onderscheiden door een verhoging van het niveau van CD45 expressie overeenkomt met de progressie van differentiatie 6. Pro-B-cellen zijn beschreven door sommigen als CD19 + / CD34 + 13 terwijl anderen hebben aangetoond dat pro-B-cellen CD19 - / CD34 + en pre-BI cellen CD19 + / CD34 + 9,10. Op basis van deze verschillen hebben wij aangewezen CD19 + / CD34 + cellen late pro-B cellen / vroege pre-BI cellen. Het is belangrijk op te merken dat deze strategie werd ontwikkeld om subsets van precursor B-cellen die corresponderen met de cellen aangetast door de ziekte acute lymfatische leukemie isoleren. Er zijn echter meerdere sorteren strategieën die kunnen worden gebruikt afhankelijk van de cel subtype plaats. Antilichaam-fluorochroom combinaties moeten worden gekozen op basis van de mogelijkheden van de beschikbare celsorteerder. Als general regel de helderste fluorochroom in het paneel moet worden gebruikt om de minst bevolkte antigeen en vice versa labelen. Bij het ​​opsporen van dubbele-gekleurde bevolking, vooral bij zeldzame gebeurtenissen zoals deze, doublet discriminatie (figuur 2B) is een uiterst belangrijk onderdeel van de gating strategie. Dit zorgt ervoor dat dubbel positieve gebeurtenissen eengemaakte cellen gekleurd met beide antilichamen en niet slechts twee single-gekleurde cellen gehecht aan elkaar. Hoge snelheid, 4-weg celsortering creëert per definitie een gecontroleerde aerosol omgeving. Daarom dienen levende menselijke celsortering worden uitgevoerd met grote zorg. Gepubliceerd veiligheid en decontaminatie richtlijnen zijn beschikbaar en moeten worden herzien en ten uitvoer gelegd voordat de soort 14. Goedkeuring van Institutionele bioveiligheid comites of hun equivalenten kan verplicht worden gesteld voorafgaand aan het sorteren. Voor een goede reiniging na sorteren worden bleekmiddel worden toegevoegd aan de afvalcontainer een eindconcentratie van 10%. Similarly moeten alle monsters buis en alle oppervlakken in de ruimte grondig worden gereinigd met vers 10% bleekmiddeloplossing. Kortom, dit protocol is een strategie voor het verkrijgen van populaties van zeldzame precursor B-cellen en kan worden gewijzigd om een ​​populatie zeldzame in navelstrengbloed waaronder hematopoietische stamcellen en onrijpe T-cellen te isoleren. Onlangs hebben onrijpe B-cellen geïdentificeerd in het perifere bloed van individuen met voortgeschreden HIV 15. Derhalve het nut van deze werkwijze verder dan de studie van bloedkanker. Tenslotte hebben we nog niet uitgevoerd RNA isolatie op de stroming gesorteerde cellen, maar deze methode is aanpasbaar met het voorbehoud dat tijdens celsortering de cellen rechtstreeks moet worden gesorteerd in TRIzol of een gelijkwaardige RNA verenigbare oplossing zoals RLT van de RNeasy kit beschikbaar via Qiagen.

Ter identificatie van afwijkingen die aanwezig zijn in ziekte, is van groot belang dat we gezonde weefsels of cellen die overeenkomen met het weefsel of celtype beïnvloed door de ziekte gebruiken. Een reden hiervoor is dat epigenetische variatie onder weefseltypen is verantwoordelijk voor het reguleren van genexpressie en is essentieel voor celdifferentiatie tijdens normale menselijke ontwikkeling 1,2. Een tweede reden is dat afwijkende weefselspecifieke genregulatie kan ernstige gevolgen hebben op de normale ontwikkeling en is bekend bij te dragen aan een veelheid van ziekten waaronder kanker. Derhalve een beter begrip van een ziekte die hematopoietische cellen omvat vereist kennis van gezonde hematopoietische cellen. De ontwikkeling van hematopoietische cellen in het beenmerg verloopt via een systematische volgorde van gebeurtenissen gekenmerkt door veranderingen in de expressie van celoppervlaktemerkers 3. Studies waarbij volwassen deelnemers hebbenaangetoond dat beenmerg meestal een laag aantal precursor B-cellen 4,5 bevat en dat onderzoeken met pediatrische deelnemers blijkt dat het percentage precursor B-cellen relatief hoog bij individuen jonger dan 5 jaar 6. Navelstrengbloed wordt gebruikt als een bron van hematopoietische stamcellen in de behandeling van bloed aandoeningen en maligniteiten is beschikbaar via navelstrengbloed banken en verrijkt voor onrijpe B en T cellen 7 die de doelcellen van meerdere aandoeningen zoals leukemie en lymfomen. Precursor B-cellen in het beenmerg zijn uitgebreid fenotype 8,9 en kan worden gedefinieerd door de aanwezigheid van specifieke celoppervlak markers die kunnen worden gebruikt om deze cellen te sorteren in verschillende subsets. Normale B-celdifferentiatie verloopt via een aantal stadia in het beenmerg beginnen met de eerste pro-B-cellen en afgesloten met onrijpe of naïeve B-cellen. VolgensVan Zelm en collega&#39;s 10 worden pro-B-cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van CD34 en in de overgang naar fase 2 (Pre-BI) CD19 wordt verkregen. Fase 3 (Pre-BII) cellen niet meer uitdrukkelijke CD34 en beginnen te cytoplasmatische IgM uit te drukken. Ten slotte is een belangrijk kenmerk van fase 4 (onrijpe B-cellen) is de uitdrukking van oppervlakte-IgM. De sorteerinrichting strategie beschreven in dit protocol werd eerst beschreven door Caldwell en collega 6 en omvat het gebruik van slechts 3 celoppervlaktemerkers die sterk vermindert de complexiteit en de kosten om celsortering experimenten. In dit werk werd een relatie tussen CD45 en de fasen van B-celdifferentiatie vastgesteld. Zij opgemerkt dat B-cellen in het beenmerg variabele niveaus van expressie van CD45 weer. Specifiek cellen die hoge niveaus van CD45 tot expressie kwam overeen met cellen die oppervlakte IgM uitgedrukt (onrijpe B-cellen), die een gemiddeld niveau van CD45 expressie overeen met cellen die cytopl uitgedruktasmic IgM (pre-BII cellen) en die lage niveaus van CD45 tot expressie overeenkwam met cellen die niet brengen cytoplasmatische IgM (pre-BI cellen). Dit protocol gebruikt de strategie van Caldwell en collega 6 tot subsets van precursor isoleren B-cellen uit navelstrengbloed (figuur 1) die gebruikt kunnen worden in assays die downstream kwaliteit nucleïnezuren zoals de gemethyleerde CpG-eiland recovery assay (MIRA ) 11 en kwantitatieve real time PCR assays. De werkwijze gebruikt een eerste scheiding met magnetische korrels voor alle niet-B cellen uit navelstrengbloed afbreken en vereist kleuring met slechts 3 antilichamen (CD34, CD19 en CD45). De cellen die zijn teruggewonnen vertegenwoordigen 4 stadia van B-cel differentiatie: 1) CD34 +, CD19 + (late pro-B en vroege pre-BI), 2) CD34 -, CD19 +, CD45 laag (late pre-BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 med (pre-BII) en 4) CD34 -; CD19 +, CD45 high (onrijpe B-cellen).

```html
<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS Column</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck Alignment beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Alignment beads</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC Mouse bead kit</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Evacuation Unit</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

isolatie van precursor b-cel subsets van navelstrengbloed

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Navelstrengbloed is zeer verrijkt voor hematopoietische stamcellen in verschillende afkomst inzet fasen. We hebben een protocol ontwikkeld voor het isoleren precursor B-cellen in vier verschillende stadia van differentiatie. Omdat genen worden uitgedrukt en epigenetische veranderingen optreden in een weefsel-specifieke wijze, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen weefsels en celtypen om te kunnen veranderingen in het genoom en de epigenoom die kunnen leiden tot de ontwikkeling van een ziekte. Deze methode kan worden aangepast aan elke type cel in navelstrengbloed in elk stadium van differentiatie. Deze werkwijze omvat vier hoofdstappen. Eerst worden mononucleaire cellen gescheiden door dichtheidscentrifugatie. Ten tweede worden B-cellen verrijkt met biotine geconjugeerde antilichamen die herkennen en niet B-cellen uit de mononucleaire cellen. Derde van de B-cellen fluorescerend gemerkt met celoppervlakeiwit antilichamen specifiek voor verschillende fasenvan B-celontwikkeling. Tenslotte worden de fluorescent gelabelde cellen gesorteerd en afzonderlijke populaties worden teruggewonnen. De teruggewonnen cellen van voldoende kwantiteit en kwaliteit worden gebruikt in downstream nucleïnezuur assays.

Tussen monster variatie speelt een rol in het succes van de cel sorteren (tabel 1). De monsters met goede rendementen hebben weinig contaminerende afval (Figuur 3A) en de monsters met slechte succespercentage hoge gehalten aan verontreinigende resten (figuur 3B). Tussen monster variatie kan enigszins worden gecontroleerd als het navelstrengbloed monster werd verzameld binnen 24 uur van verzending (O / N eerste prioriteit). De stroming gesorteerde cellen van elk precursor B-cel subsets van voldoende kwantiteit en kwaliteit nucleïnezuur isolatie voeren. Het geïsoleerde DNA van hoge kwaliteit en kunnen worden gebruikt in downstream analyses. We gebruiken deze routinematig DNA in MIRA 11 te verrijken voor gemethyleerd DNA (Figuur 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cord Blood Facility gegevens </td><td> Slechte Sorteer </td><td><strong&gt; Goede Sorteer </td></tr><tr><td> Werken Blood Volume met anticoagulantia (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> White Blood Cells [10 3 / ul] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Lymfocyten [10 3 / ul] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Lymfocyt (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Red Blood Cells [10 6 / ul] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house data </td></tr><tr><td> Aantal cellen na Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Aantal cellen na MACS Scheiding </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Totaal Evenementen Count (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Levensvatbaarheid (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Cellen in lymfocytpoort (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Totaal aantal cellen </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Van de totale Evenementen </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Rendement </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 lage </td></tr><tr><td> Totaal aantal cellen </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Van de totale Evenementen </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Rendement </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Totaal aantal cellen </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Van de totale Evenementen </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Rendement </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 hoge </td></tr><tr><td> Totaal aantal cellen </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Van de totale Evenementen </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Rendement </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Vertegenwoordiger cel soort statistieken. Rijen 1-5 zijn tellingen die door het navelstrengbloed faciliteit. De resterende rijen zijn verzameld in ons laboratorium. De arme soort hoge niveaus van puin en een laag percentage cellen in de lymfocytpoort. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> FiguAd 1. Stroomschema van procedure. Navelstrengbloed wordt verwerkt en mononucleaire cellen werden geïsoleerd met behulp van Ficoll-Paque plus. Een extra wasstap is opgenomen om verontreinigende bloedplaatjes verwijderen. B-cellen geïsoleerd uit mononucleaire cellen met de MACS humane B-cel isolatiekit (B-CLL). Deze stap maakt gebruik van biotine-geconjugeerde monoklonale antilichamen (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE en CD235a) verwijderen van alle niet-B cellen. De teruggewonnen B-cellen gelabeld met CD19-APC, CD34-PE en CD45-FITC antilichamen vervolgens gesorteerd met de MoFlo XDP flowcytometer om precursor B-cel subsets herstellen: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 laag ; CD19 + / CD34 - / CD45 med en CD19 + / CD34 - / CD45 high. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Figuur 2. Gating strategie voor het identificeren en sorteren van popvraagd. Rode pijlen geven de poort die wordt toegepast op alle volgende perceel. R4, R5, R6 en R7 poorten geven gesorteerd populaties. A) Forward vs side scatter plot met verrijkte lymfocyt populatie. R1, lymfocytpoort. B) Lengte vs breedte van voren scatterplot voor het identificeren van individuele cellen versus wambuizen. R2, enkele cel poort. C) CD19-APC positieve cellen vallen in CD34-PE negatieve en positieve populaties. R3, CD19 + / CD34 - poort; R4, CD19 + / CD34 + poort aangeeft gewenste soort populatie d) CD19 + / CD34 - cellen vallen in drie enigszins verschillende CD45-FITC populaties.. R5 en R6, CD19 + / CD34 - / CD45 laag en CD19 + / CD34 - / CD45 med populaties respectievelijk. R7, vanwege de hoge celaantallen in de CD19 + / CD34 - / CD45 hoge populatie, dit soort poort omvat alleeneen deel van de bevolking. Alle cellen van deze populatie niet te worden verzameld voor downstream analyses. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Figuur 3. A) Lage contaminerende puin na kolom verrijking. R1, lymfocytpoort. B) Een hoge mate van besmetting van puin na kolom verrijking. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Figuur 4. Verrijking van gemethyleerd DNA deelverzamelingen van precursor B-cellen. A) gesonificeerd DNA geïsoleerd uit precursor B-cel subsets van hoge kwaliteit. Voor bibliotheekconstructie DNA wordt gesonificeerd tot een gemiddelde van 200-600 bp. Laan 1: 100 bp ladder Promega (catalogus # G2101), Laan 2: Totaal DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 + cellen; Lane 3: Totale DNA geïsoleerd uit CD19 + </sup&gt; / CD34 - / CD45 laag cellen Lane 4: 100 ng DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 - / CD45 med cellen Lane 5: 100 ng DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 - / CD45 hoge cellen. DNA werd gesoniceerd met de Diagenode Bioruptor on High voor een totaal van 9 min (30 sec ON, OFF 30 sec). DNA werd gezuiverd kolom en gevisualiseerd op een 1% agarose gel met SYBR groen nucleïnezuur gel vlek. B) Na MIRA met de ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR met SLC25A37 (1-6) en APC1 (7-12) wordt uitgevoerd om te bevestigen verrijking van gemethyleerd DNA. 1 en 7: gesonificeerd genomisch DNA (no MIRA) 2 &amp; 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 &amp; 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 laag DNA; 4 en 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA, 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 hoge DNA, 6 &amp; 12: Water controle. Hogere versterking van SLC25A37 bevestigt de verrijking van gemethyleerd DNAin de subsets van precursor B-cellen.

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren kunnen worden geëxtraheerd uit de cellen en gebruikt in daaropvolgende testen gebruik DNA of RNA.

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen uit het navelstrengbloed te isoleren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie. In de tweede stap worden celoppervlakteantigenen gelabeld met biotine-geconjugeerde antilichamen om alle overgebleven niet-B-cellen magnetisch te verwijderen.Vervolgens worden de geïsoleerde B-cellen fluorescent gelabeld met antilichamen tegen de celoppervlakte-antigenen CD 19, CD 34 en CD 45. In de laatste stap worden de cellen gesorteerd via flowcytometrie om de precursor B-cel-subsets terug te winnen. Uiteindelijk kunnen cellen in voldoende aantal en kwaliteit worden verkregen voor gebruik in downstream-assays waarvoor hoogwaardig DNA en RNA vereist zijn.Een voordeel van de cel-sorteerstrategie ten opzichte van alternatieve methoden is dat onze strategie minder tijd op de flowcytometer vereist en slechts drie fluorescerende antilichamen gebruikt, wat de kosten van het experiment aanzienlijk verlaagt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de verscheidenheid aan beschikbare methoden voor het prepareren van navelstrengbloedcellen voor flowcytometrie en de complexiteit van de voorbereiding van de flowcytometer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in gezonde precursor B-cellen, kan ze ook worden toegepast op andere celtypen die in navelstrengbloed aanwezig zijn, zoals T-cellen, of op studies naar ziekten waarbij hematopoëtische cellen betrokken zijn, zoals leukemie of lymfoom.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het moeilijk is om de juiste technieken voor het verwerken van navelstrengbloed en cellen te beschrijven op een manier die de celviabiliteit maximaliseert en de aanwezigheid van contaminerende debris vermindert. Om mononucleaire cellen uit navelstrengbloed te isoleren, worden eerst aliquots van 8 mL navelstrengbloed verdund met 24 mL DPBS. Vervolgens wordt elk verdund bloedmengsel langzaam bovenop 15 mL aliquots van Ficoll-Paque in 50 mL conische buizen gelaagd, waarbij nauwgezet wordt toegezien op het gescheiden houden van de lagen.Centrifuge vervolgens het bloed gedurende 40 minuten bij 400 ×g en 20 °C, terwijl de cellen worden gescheiden via een dichtheidsgradiënt. Label zeven buizen van 50 mL met een ronde bodem met het monster-ID, de datum en alle andere relevante informatie zoals beschreven in de tabel. Na de scheiding blijven de mononucleaire cellen op de interface tussen het plasma en de ondoorzichtige laag, terwijl de granulocyten en erytrocyten sedimenteren. Aspireer nu de bovenste plasmalagen, waarbij contact met de mononucleaire cellagen wordt vermeden. Gebruik vervolgens een glazen pipet van 10 mL om de mononucleaire cellagen uit drie van de 50 mL buizen voorzichtig te verzamelen in één nieuwe buis van 50 mL.Vul deze nieuwe buis met PBS, meng de celsuspensie voorzichtig en was de cellen vervolgens twee keer gedurende 10 minuten bij 300 ×g en 20 °C. Resuspendeer na de eerste wasbeurt de pellets en breng deze over naar één conische buis van 50 milliliter. Resuspendeer na de tweede wasbeurt het celpellet voorzichtig in 200 µL PBS en breng één µL van de celsuspensie over naar één milliliter PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor het tellen.Was de cellen in de buis van 50 milliliter vervolgens met meer PBS en verwijder daarna het supernatant volledig zonder de pellet te verstoren. Om de B-cellen uit de mononucleaire cellen te isoleren, wordt de zojuist gewassen pellet eerst geresuspendeerd in 160 microliters vers bereide DGAs E-D-T-A-P-B-S buffer bij vier graden Celsius.Meng vervolgens 40 µL van de B-cel isolatiekit, bio ITIN antilichaamcocktail met de celsuspensie. Na het incuberen van de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C, wordt het vrije antilichaam weggewassen met 1 mL EDTA-PBS buffer bij 4 °C per 10 miljoen cellen. Resuspendeer de celpellet vervolgens in 320 µL EDTA-PBS buffer bij 4 °C.Meng nu 80 µL anti-biotine microbeads met de celsuspensie na een incubatie van 15 minuten bij 4 °C. Was de cellen opnieuw terwijl de cellen centrifugeren. Plaats een LS-kolom in het magnetische veld van een Max Separator en laat 3 mL E-D-T-A-P-B-S buffer van 4 °C door de kolom druppelen.Resuspendeer vervolgens tot 100 miljoen van de gewassen cellen in 500 µL E-D-T-A-P-B-S-buffer van 4 °C. Pipetteer daarna de celsuspensie op de kolom en vang de ongelabelde cellen die door de kolom passeren op in een conische buis van 50 mL. Voeg nog eens twee mL E-D-T-A-P-B-S-buffer van 4 °C toe aan de wanden van de oorspronkelijke conische buis, telkens één mL per keer; meng vervolgens voorzichtig en pipetteer telkens de resterende celsuspensie op de kolom om zeker te zijn dat alle cellen zijn teruggewonnen.Vul tenslotte de conische buis met de ongelabelde cellen aan met PBS. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer de cellen vervolgens voorzichtig in 200 µL EDTA-PBS-buffer.Start met de antilichaamlabeling. Begin door één µL van de celsuspensie over te brengen naar de eerder gelabelde ongekleurde buis. Voeg 500 µL EDTA-PBS-buffer toe aan de buis en bewaar deze op ijs.Schakel alle lichten uit en voeg vervolgens per 1 miljoen cellen telkens 20 µL CD 19-, CD 34- en CD 45-antilichamen toe aan de resterende celsuspensie. Meng goed en plaats de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Draag daarna 40 µL van de met antilichamen gelabelde celsuspensie over naar de buis met label A t/m D.Was de cellen in één milliliter PBS en resuspendeer daarna het pellet in 100 µL bindingsbuffer. Voeg zeven µL 7-AAD toe aan deze cellen en incubeer ze vervolgens 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur, terwijl de cellen worden gelabeld met 7-AAD. Vul de buis met de antilichaam-gelabelde cellen aan met PBS, was de antilichaam-gelabelde cellen en resuspendeer het pellet vervolgens in 500 µL EDTA-PBS-buffer. Draag nu het volledige volume van de antilichaam-gelabelde celsuspensie over naar de buis gelabeld als CD19-positief, CD34-positief, CD45-positief.Spoel de buis met nog eens 1 mL EDTA-PBS-buffer en overbreng de resterende celсусpensie naar de buis gelabeld als CD19 positief CD34 positief CD45 positief. Voeg tot slot 300 µL bindingsbuffer toe aan de buis 7 Aad om de cellen te sorteren met de MoFlo XDP flowcytometer. Stel eerst de MoFlo in voor sortering, draai de juiste compensatiecontroles en maak vervolgens een protocol aan inclusief plots zoals geïllustreerd in deze figuur.Zorg ervoor dat het aerosolafzuigingssysteem constant is ingeschakeld en gebruik vervolgens het ongekleurde monster om de spanning en gain voor de forward- en side scatter-plots in te stellen. Stel de drempelwaarde in op minder dan of gelijk aan 1% om te identificeren welke populaties een negatieve fluorescentie vertonen, zodat debris dat DNA bevat de teruggewonnen monsters niet contamineert.Verwerk ongeveer 50.000 events van het CD 19 positieve CD 34 positieve CD 45 positieve monster. Stel de gating-strategie in zoals zojuist gedemonstreerd door de ongated CD 19 positieve CD 34 positieve populatie terug te projecteren (back gating) op de side scatter versus forward scatter plot. Dit is om er zeker van te zijn dat de lymfocyt-gate potentiële pro-B-cellen bevat.Gebruik dit monster om ook de negatieve fluorescentiepopulatie voor de 7-AAD-kleuring in te stellen. Voer vervolgens het 7-AAD-monster uit om de levensvatbaarheid van het monster te bepalen; sorteer alleen cellen uit een monster met een levensvatbaarheid van groter dan of gelijk aan 95% bij de start, aangezien dode cellen aspecifiek kleuren en de sorteerpopulaties kunnen contamineren. Stel nu de sorteerbeslissingen in om de volgende vier populaties te verzamelen: CD19 positief, CD34 positief; CD19 positief, CD34 negatief, CD45 laag; CD19 positief, CD34 negatief, CD45 medium; en CD19 positief, CD34 negatief, CD45 hoog.Neem de gates voor lymfocyt- en doublet-discriminatie op in de sorteerbeslissingen van alle populaties om verstoppingen te voorkomen. Filter in de sorteertip het CD 19 positieve, CD 34 positieve, CD 45 positieve monster onmiddellijk voor het sorteren door een cellstrainer van 40 micron. Plaats vervolgens gelabelde opvangbuisjes, gecoat met 2% FBS in PBS, in een met ijs gevulde buishouder en sorteer de cellen direct nadat het sorteren is voltooid in het juiste opvangbuisje.Extraheer het DNA waarbij monster-variatie een rol speelt in het succes van de cel, sorteer in een goede sortering. Er is een hoog percentage cellen in de lymfocyt-gate. Monsters met goede succespercentages bevatten lage niveaus aan contaminerende debris, zoals blijkt uit het lage aantal events dat onder en links van de gegate lymfocytpopulatie valt.De monsters met lage succespercentages bevatten hoge hoeveelheden contaminerende debris. Bij slechte monsters is een duidelijke toename van deze gebeurtenissen zichtbaar. De via flowcytometrie gesorteerde cellen en het daaropvolgend geïsoleerde DNA uit elke precursor B-cel subset bezitten een kwantiteit en kwaliteit die volstaan voor downstream analyses.We hebben dit DNA routinematig gebruikt in Myra om gemethyleerd DNA te verrijken uit DNA dat is geïsoleerd uit CD 19 positieve CD 34 positieve cellen, CD 19 positieve CD 34 negatieve CD 45 lage cellen, CD 19 positieve CD 34 negatieve CD 45 medium cellen en CD 19 positieve CD 34 negatieve CD 45 hoge cellen; deze werden gedurende in totaal negen minuten op een hoge stand gesoniceerd, kolomgezuiverd en vervolgens gevisualiseerd op een 1% agarosegel met SYBR Green nucleïnezuregelkleuring in deze baan. Er werd ook een controle 100 base pair ladder meegestuurd. Na Myra is, gebruikmakend van de Active Motif MethylCollector Ultra Kit, PCR uitgevoerd met de controle gemethyleerde SLC 25 A 37 en controle ongemethyleerde APC 1 genen om de verrijking van het gemethyleerde DNA te bevestigen.De hogere amplificatie van SLC 25. A 37 bevestigt de verrijking van gemethyleerd DNA in de precursor B-cel subsets. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 10 uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cellen zeer voorzichtig te behandelen en de geoptimaliseerde hoeveelheid antilichamen te gebruiken, zodat de vorming van contaminerende debris na deze procedure tot een minimum wordt beperkt.Andere methoden, zoals next generation sequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen gemethyleerd zijn en welke precursor B-cel subsets aanwezig zijn. Vergeet niet dat het werken met levende menselijke cellen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er te allen tijde voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure, zoals het gebruik van een aerosolevacuatiesysteem.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

The video explains a way to purify B-cells by immunomagnetic targeting and separation from peripheral blood mononuclear cells suspension. The method involve labeling unwanted cell types with specific antibodies or ligands (linked to magnetic particles) targeting specific cell surface proteins, to be depleted from the heterogenous cell suspension by magnetic separation.

Negative Immunomagnetic Selection: A Method to Purify B-cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en klonen van de schaarse T-cel entiteit van perifere Vδ1+CD4+ T-cellen die, zoals we onlangs hebben laten zien, een extrathymische αβ T-cel voorloper is. Deze techniek maakt het mogelijk om deze cellen kwantitatief te isoleren, klonen en efficiënt uit te breiden in ex vivo cultuur.

Isolatie en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur van Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Leer een efficiënte methode om precursor B-cel subsets te isoleren uit navelstrengbloed met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en flowcytometrie. Deze techniek levert hoogwaardige nucleïnezuren op voor downstream analyses.

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Meer video's verkennen