Name: De flybar: Toedienen Alcohol te Flies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer alcoholgeïnduceerd gedrag meten bij Drosophila met een eenvoudige flybar-setup. Deze methode onderzoekt circadiane ritmes en genetische variaties in alcoholgevoeligheid, ideaal voor onderwijs en gedragsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door een Program in Neuroscience Award van de Florida State University College of Medicine en steun van de afdeling Biologische Wetenschappen aan FSU. Aanvullende financiering werd verstrekt door een Grant-in-Aid van Onderzoek Fonds de Alcohol Beverage fabrikant.

1. Vergadering van de flybar Achtergrond en overzicht: Het systeem is ontworpen om gecontroleerde percentages van alcohol damp te dienen aan vliegen. Opmerking: Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de flybar set-up zoals hieronder beschreven in drie fasen (montage van de luchtstroom, de set-up van de alcohol en water flessen, en montage van de observatie flesjes). Kortom, een constante luchtstroom in twee fracties die worden geleid door alcohol en water respectievelijk gemengd en toegediend aan 4 waarneming injectieflacons. <ol><li> Vergadering van de Airflow <ol><li> Sluit een kort stuk van flexibele siliconen slang aan beide gebouw lucht of een aquarium beluchter een consistente luchtstroom en split met een y-connector te genereren. Sluit de eerste afslag naar de volumergelaar dat de totale hoeveelheid lucht regelt via het systeem (meestal 1000 ml / min voor 4 observatie flacons). </li><li> Plaats een snelkoppeling in de tweede buiszodat de luchtstroom aan het begin van het experiment kan worden onderbroken zonder dat de gekalibreerde luchtstroom. Voeg een y-connector en sluit iedere vertakking buis om de luchtstroom regelaar. </li><li> Sluit de leidingen om de luchtstroom toezichthouders en vervolgens twee luchtstroom meter verbinden. </li></ol></li><li> Set-up van de Alcohol en waterflessen <ol><li> Toevoegen flexibele slang aan de uitgang van de luchtstroom meter en plaats een dunne glazen buis (delen van 1 ml glazen pipetten) met een 90 ° bocht in het uiteinde van elk buisstuk. Dit zal dienen als de inlaat luchtstroom in het water en alcohol flessen. </li><li> Plaats rubberen stop met 2 gaten door ze in de flessen gevuld met alcohol en water. Houdt beide flessen bij een constante temperatuur 2 ° C lager dan omgevingstemperatuur met behulp van een waterbad. In onze experimenten is de milieu kamer gehandhaafd op 25 ° C, terwijl het waterbad bij 27 ° C. </li><li> Steek de rechte glazen pipet voor de eenir inlaat door de rubber stop en zich in de vloeistof tot ongeveer 1 cm van de bodem van de fles. </li><li> Plaats een elleboog gedeelte glazen pipet in de resterende gat in de rubberen stop tot het einde van het glas gelijk ligt met de onderkant van de stopper in de fles. Plaats dit luchtuitlaat in een ander stukje slang. </li><li> Herenigen de luchtstromen met een y-connector en een andere lengte van siliconen slang aan op de luchtstroom rechtstreeks via een lege mengen kolf of fles met gebogen glazen pipet secties ingebracht via een twee-gaten rubberen stop. Gebruik een andere lengte van siliconen buizen voor de afvoer gemengde luchtstroom. </li></ol></li><li> Vergadering van de Observation Vial <ol><li> Splits de uitlaat luchtstroom die uit het mengen kolf 2-3x 4 of 8 kleinere luchtstromen te vinden zodat meerdere flacons waarneming kan in elk experiment. Sluit de flexibele siliconen slang aan op de observatie flesjes. </li><li> Stel de waarneop flacons met lege injectieflacons afgesloten met een rubberen stop die twee openingen voor de glazen buizen garanderen een inlaat en een uitlaat voor de alcohol damp. </li><li> Bedek het einde van de eerste glazen buis met een net en houden de netten in plaats met behulp van een klein stukje van de flexibele plastic buis. Plaats deze buis door het eerste gat totdat het zich uitstrekt tot ongeveer de halve lengte van de flacon. Indien nodig, gebruik teflon tape om een ​​goede pasvorm te verkrijgen. </li><li> Plaats de tweede glazen buis ook het einde waarop netten tot deze gelijk met de binnenrand van de rubberstop. </li><li> Plaats de injectieflacons horizontaal op een wit stuk papier om het contrast met de vliegen onder gedimd rood licht omstandigheden te maximaliseren. </li><li> Meng geschikte fracties van de luchtstroom geleid door alcohol en de luchtstroom door het water borrelen. Monitor de luchtdruk continu en aanpassingen die nodig zijn om de gewenste menging van de luchtstromen te behouden. Opmerking: de continu draaiendevan verschillende Fly Bar assays parallel of zelfs een enkele test in een kleine ruimte kan leiden tot een merkbare accumulatie van alcohol damp. Om voortdurende introductie van alcohol damp die mogelijk de onderzoeker kan beïnvloeden in een afgesloten ruimte te vermijden, dient een adequaat systeem in de plaats die adequaat verwijdert alcohol damp die tijdens het experiment te worden gezet. Aan alcohol dampen te verwijderen, sluit u een 6-12 inch stuk slang op de tweede glazen buis uitsteekt uit elke flacon, bundelen ze en rechtstreeks naar een trechter-vacuümsysteem. Onderzoekers moeten er ook voor zorgen dat de experimentele testen ruimte voldoende geventileerd. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van Proefdieren Achtergrond en overzicht: De juiste cultuur en huisvesting van de vliegen zal variabiliteit te verminderen in de gegevens. Dit wordt bereikt door middel van standaardisatie en minimalisering van stress ervaren door de vliegen. Daarom is geen verdoving (CO2 of alternatieve) gebruikt During een van de volgende stappen van het protocol. Bovendien moet vliegen vergelijkbare leeftijd over experimenten en tijdstippen van de variabiliteit te minimaliseren als standaard voor andere gedrags-analyses waaronder het leren en het geheugen experimenten 17 zijn. Verschillende licht: donker omstandigheden kan worden gebruikt om de functie van de circadiane klok in de gedragsreactie ethanol sonde. Om te bepalen of een dagritme bestaat, kan experimenten onder een bepaalde LD cyclus uitgevoerd om te meten op specifieke Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 vertegenwoordigt de dageraad en wordt gedefinieerd als de tijd van de lichten op onder LD cycli, terwijl ZT 12 is de tijd lichten worden uitgeschakeld met een 00:12 hr LD cyclus. Onder constante omstandigheden, het circadiane tijd (CT) meet de tijd voor het dier in de afwezigheid van signalen uit de omgeving, dat wil zeggen vrij looptijd, en is gerelateerd aan de vorige LD entrainment cyclus. In wild type Drosophila, CT weerspiegelt de vorige ZT gedurende de eerste dags in constante omstandigheden als vrijlopende circadiane periode en ritmes zijn ~ 24 uur. Om circadiane modulatie meten en acute licht effecten op het gedrag te elimineren, zijn vliegen meegevoerd aan het licht: donker cyclus en vervolgens overgebracht naar constante donkere omstandigheden (DD) voorafgaand aan de experimenten. Circadiane experimenten worden uitgevoerd op de tweede dag van DD om prestaties te meten op specifieke Circadiaanse Times (CT). In Drosophila, continu licht (LL) omstandigheden leiden tot circadiaanse dysfunctie met vochtige of afgeschaft moleculaire trillingen van kern circadiane genen en verstoring van gedrags circadiane ritmes zoals blijkt uit aritmische bewegingsactiviteit 18-21 en aritmische korte termijn geheugen 17. Het protocol is geoptimaliseerd voor circadiane studies kan worden vereenvoudigd andere experimenten. Alle circadiane experimenten worden uitgevoerd met behulp van gedimd rood licht (omgevingslicht overhead rood licht &lt;1 lux op de bank top, kleine rode lichten gebruikt bij 12 centimeter van buizen~ 1 lux licht). <ol><li> Achterzijde de vliegen bij 25 ° C onder 12:12 uur licht: donker meesleuren voorwaarden (LD). </li><li> Verzamel vers eclosed vliegen aan het eind van de dag-lichtperiode op dag 1 en op te slaan voor 24 uur onder LD omstandigheden die flacons met een kleine hoeveelheid hoge concentratie agar voeding voedsel kleverigheid minimaliseren. Opmerking: Om te zorgen voor een gezonde, normaal ontwikkeld vliegen worden verzameld, alleen vliegen binnen de eerste dagen verzameld na verpopping begint in een cultuur fles. </li><li> Verzamel batches van ongeveer 30 (25-35) vliegt met een afzuiger op dag 2 aan het einde van de lichte periode, en transfer naar verse bedrijf flesjes. </li><li> Gebruik een sterke lichtbron te richten vliegen naar het einde van de flacon. Binnen dit bereik, het exacte aantal vliegen per flacon is niet kritisch gedragswaarnemingen worden in procenten van totaal aantal vliegen geteld aan het einde van elk experiment. </li><li> Handhaaf vliegen onder DD omstandigheden bij 25 ° C for twee dagen. </li><li> Op de dag van het experiment eerst alle vliegen ondergebracht in verschillende omstandigheden anders dan de experimentele gedrag ruimte in de kamer ten minste 1 uur voor het experiment incubators. Acclimatisatie vermindert variabiliteit als gevolg van veranderingen in temperatuur of vochtigheid. </li><li> Maak waarnemingen op zes tijdstippen per dag (CT 1, 5, 9, 13, 17 en 21) om te testen voor de circadiane modulatie van gedrag. </li><li> Vergelijk verschillende tijdstippen binnen een enkele set van gedragsexperimenten om de robuustheid van de experimentele opzet te verhogen en de variabiliteit te minimaliseren specifiek voor een enkel experiment. Zo kunnen waarnemingen van 1 CT en CT 13 gelijktijdig worden verkregen indien twee incubatoren met tegengestelde licht-donker schema worden gebruikt entrainment. Opmerking: De bovenstaande procedure beschrijft de bereiding van proefdieren Voor bepalingen in circadiane toestand van constante duisternis. Verschillende licht: donker omstandigheden kan worden gebruikt om de functie van de klok sondein de gedragsreacties op alcohol. Om te bepalen of een dagritme bestaat de experimenten onder een LD cyclus uitgevoerd om te meten op specifieke Zeitgeber Times (ZT). Bovendien kan het protocol worden gebruikt vliegen opgeheven onder constant licht voor experimentele testen circadiaanse dysfunctie. Voor alternatieve protocollen die vliegen gehuisvest in lichte omstandigheden te testen, moet gedrags testen nog worden uitgevoerd onder donkere omstandigheden. Vliegen moeten in het donker gedurende 1 uur overgebracht voorafgaand aan het experiment om gedrags variabiliteit te minimaliseren vanwege de acute effecten van licht op gedrag. </li></ol> 3. Gedragswaarnemingen Achtergrond en overzicht: De volgende alcohol administratie protocol is geoptimaliseerd voor observaties onder gedimd rood licht. De twee gedragsmaatregelen lorr en sedatie vertegenwoordigen twee verschillende punten van vlieg dronkenschap. Lorr vertegenwoordigt een laat punt van dronkenschap waarin het verlies of motor en posturale controle, terwijl sedatie maatregelen een zeer late eindpunt van intoxicatie. Genotype of circadiaanse modulatie kunnen verschillend deze twee maatregelen van invloed zijn; vandaar kan men willen beide onderzoeken. Kortom, vliegen in de flesjes geplaatst, het aantal vliegen weergeven lorr of sedatie gescoord elke 5 minuten gedurende alcoholblootstelling damp en het totale aantal vliegen geteld aan het einde van het experiment. <ol><li> Voordat de proef begon, lopen de lucht door het (lucht door water en alcohol flessen) gedurende ten minste 10 minuten en gebruik die tijd om de luchtstromen kalibreren. </li><li> Koppel de snelspanner om de luchtstroom te stoppen. Laad de vliegen in de flesjes, en sluit de luchtstroom en start de timers. Opmerking: Als reageert vliegen of dode vliegen worden achtergelaten op het bedrijf flesjes, kan dit een indicatie van stress omstandigheden. In het algemeen kunnen deze aandoeningen worden verlicht door huisvesten minder vliegen in het bedrijf flesjes of verminderen voedsel kleverigheid met een lichtely hogere agar concentratie tijdens het bereiden van voedsel. Voor optimale gedragsanalyses en minimale variabiliteit tussen experimenten moeten vliegen gezond voor experimenten. </li><li> Voor nauwkeurige tijd te houden, gebruikt u een timer voor het bijhouden van de totale tijd van de blootstelling alcohol en het gebruik van een tweede telling-back timer om de 5-minuten intervallen markeren. </li><li> Leg een stuk wit papier onder de flesjes om het contrast te verhogen en vliegen zichtbaarheid, vooral onder gedimd rood licht. </li><li> Controleer de luchtstroom regelmatig tijdens een experiment om een ​​constant niveau te houden. In het algemeen, wanneer luchtstromen gestabiliseerd, ze stabiel blijven tijdens de duur van het experiment. </li><li> Tel het aantal vliegen dat hun oprichtreflex eenmaal per 5 minuten hebben verloren voor een hr periode 1. Als de alcohol gevoeligheid varieert tussen genotypen en genetische achtergronden, kan het wenselijk zijn om vaker bepalingen uit te voeren of om de experiment gedurende een langere periode. </li><li> Til de flacon slightly van het oppervlak, en richten het licht van een rood-licht zaklamp in de richting van het papier achter de flacon. Houd de hand-held rode zaklampen op een afstand van ten minste 12 cm aan de experimentele flacon lichtniveaus niet groter dan 1 lux te handhaven voor alle experimenten onder gedimd rood licht. </li><li> Meet lichtniveaus met behulp van een lichtmeter om normen voor alle experimenten vast te stellen. </li><li> Bepaal het aantal vliegen dat hun oprichtende reflex hebben verloren door het aanbrengen van een stevige tik op de flacon en tellen hoeveel vliegen niet om zichzelf recht in ongeveer 4 sec. Vliegen die lorr weer kunnen nog bewegen hun benen en vleugels, maar kunnen zichzelf niet rechtop zetten. </li><li> Aan het eind van de sessie, tel het aantal vliegen per flacon. Opmerking: Soms kan een vlieg gevangen tussen de stop en de zijkant bij het laden vliegt in de experimentele flesjes. Dit gebeurt in het donker, kan niet gemakkelijk worden opgemerkt dat het noodzakelijk is de totale verdoven tellener vliegen op het einde van het experiment te kunnen percentages berekenen. </li></ol> Bovendien, deze procedure kan ook worden gebruikt voor sedatie van vliegen, die een andere gedrags eindpunt vertegenwoordigt meten. Terwijl verdoofd vliegen hun recht reflex hebben verloren, sedatie vereist een grotere blootstelling aan alcohol. Gedragsmatig kan verdoving gekenmerkt door het volledig ontbreken van duidelijke motorische activiteit met vliegen resterende roerloos in de flacon volgende aa stevig tik aan de flacon. Voor sedatie, tel het aantal vliegen die roerloos zonder been zwaaien na de uitspraak van een stevige tik van de flacon blijven. Daarnaast kan de flacon worden uitgerold links naar rechts om te bepalen of individuele vliegen nog steeds hun greep reflex. 4. Data Analysis <ol><li> Bepaal het percentage lorr op elk tijdstip bepaald op basis van het totale aantal vliegen per flacon. </li><li> Schatting verschillen tussen circadiane tijdstippen of stammen door berekeninng de 50% lorr voor elk monster, die in het lineaire gebied van de sigmoid curve valt (zie afbeelding 2 hieronder). </li><li> Alternatief statistieken: <ol><li> Als vergelijkingen tussen genotypen gepland, is het wenselijk om het hele tijdsverloop analyseren met behulp van herhaalde metingen ANOVAand de reeks tijdstippen dat de verschillen significant met Post-hoc tests (figuur 3) bepalen. Voor deze testen we bij voorkeur een a waarde van 0,001 gebruikt. Hierdoor kan aan individuele belichtingstijden ook worden beoordeeld als verschillen tussen genotypen in de helling van de curve. </li><li> Verschillen in gevoeligheid voor kan worden vastgesteld voor bepaalde tijden alcoholblootstelling voor een bepaalde reactie, zoals sedatie van het lineaire gedeelte van de grafiek (figuur 4). </li><li> Verschillen tussen stammen of circadiaanse tijdstippen kan worden geschat met behulp van standaard F-statistieken en tests post-hoc. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Linde, K., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+acute+alcohol+sensitivity+but+not+acute+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila.</a> Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).</li>
<li>Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+alcohol+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for alcohol reward.</a> Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).</li>
<li>Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+deprivation+increases+ethanol+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila.</a> Science. 335, 1351-1355 (2012).</li>
<li>Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fruit+fly%3A+A+model+organism+to+study+the+genetics+of+alcohol+abuse+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction.</a> Cell. 93, 909-912 (1998).</li>
<li>Guarnieri, D. J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%2C+a+genetic+model+system+for+alcohol+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research.</a> International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).</li>
<li>Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intoxicated+fly+brains%3A+Neurons+mediating+ethanol-induced+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors.</a> J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).</li>
<li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).</li>
<li>Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+genes+for+alcohol+dependence%3A+Animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).</li>
<li>Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+acute+ethanol-induced+behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).</li>
<li>Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+central+ethanol+sensitivity+by+the+mPer2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene.</a> Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).</li>
<li>Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+acamprosate+modulation+of+elevated+ethanol+drinking+in+mPer2+clock+gene+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice.</a> Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).</li>
<li>Sinclair, J. D., Geller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+consumption+by+rats+under+different+lighting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ethanol consumption by rats under different lighting conditions.</a> Science. 175, 1143-1144 (1972).</li>
<li>Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+in+consumption+of+the+first+drink+of+the+day+in+alcohol-dependent+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons.</a> Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).</li>
<li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taok2+controls+behavioral+response+to+ethanol+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice.</a> Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).</li>
<li>Lasek, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+role+for+anaplastic+lymphoma+kinase+in+behavioral+responses+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol.</a> PLoS One. 6, 226-236 (2011).</li>
<li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li>
<li>Lyons, L. C., Roman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+short-term+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of short-term memory in Drosophila.</a> Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).</li>
<li>Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+period-altered+circadian-rhythm+mutants+of+Drosophila+in+ligh-dark+cycles+%28Diptera+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae).</a> J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behavior+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+period+mutations+and+light+on+the+activity+rhythms+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).</li>
<li>Yoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+cycles+drive+Drosophila+circadian+oscillation+in+constant+light+that+otherwise+induces+behavioural+arrhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).</li>
<li>Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+chronic%3A+two+distinct+forms+of+ethanol+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ethanol+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional ethanol tolerance in Drosophila.</a> Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-regulated+genes+that+contribute+to+ethanol+sensitivity+and+rapid+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).</li>
<li>Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ABC+transporter+mutants+white%2C+brown+and+scarlet+have+altered+contents+and+distribution+of+biogenic+amines+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain.</a> J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).</li>
<li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+is+necessary+for+place+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Serotonin is necessary for place memory in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).</li>
<li>Bainton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+modulates+acute+responses+to+cocaine%2C+nicotine+and+ethanol+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+dopamine+neurons+target+the+D1-like+dopamine+receptor+DopR+in+the+central+complex+to+promote+ethanol-stimulated+locomotion+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Center+on+Addiction+and+Substance+Abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Shoveling+up+II%3A+The+impact+of+substance+abuse+on+federal%2C+state+and+local+budgets%22%5BJournal%5D)">The National Center on Addiction and Substance Abuse.</a> Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).</li>
<li>NIAAA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+economic+costs+of+alcohol+abuse+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States.</a> , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="www.medtext.com/hdcn.htm">www.medtext.com/hdcn.htm</a> (1992).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction-like+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).</li>
<li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoothroyd%2C+CE+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22">Annals of the New York Academy of Sciences</a>. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).</li>
<li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li>
<li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li>
<li>Cohan, F. M., Graf, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li>
<li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li>
<li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22in+Drosophila.+Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li>
<li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li>
<li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De kosten van alcoholmisbruik en alcoholisme voor de samenleving is enorm, zowel in termen van menselijke 29 en economische kosten 30,31. Drosophila als model biedt een snelle en veelzijdige systeem om de gedragsreacties van een groot aantal individuen snel te onderzoeken en als zodanig is uitgebreid gebruikt voor zowel alcohol 5,7,32-34 en circadiane onderzoek 35-37. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de gecontroleerde toedie...

Drosophila melanogaster demonstreren bifasische gedragsreacties op alcohol 1 die analoog is aan de menselijke reacties op dit medicijn 2,3 zijn. Na de eerste blootstelling aan lage concentraties van alcohol, vliegt vertonen verhoogde bewegingsactiviteit, vervangen door een gebrek aan motorische coördinatie, het verlies van posturale controle en oprichtende reflexen (meer verlies van evenwicht Reflex: lorr), en sedatie (volledige gebrek aan motorische activiteit in reactie mechanische stimulatie) blootstelling aan alcohol vordert 4-9. De endogene circadiane klok is een sterke modulator alcohol gevoeligheid en toxiciteit waargenomen bij muizen 10,11, ratten 12 en 13 mens. Recente ontwikkelingen in Drosophila onderzoek is gebleken dat de circadiane klok moduleert acute alcohol gevoeligheid, maar geen alcohol tolerantie 1. De krachtige genetische benaderingen beschikbaar in Drosophila mutant via studies en transgene manipulaties van de ruimtelijkeen tijdelijke genexpressie tot een systeem dat snelle vooruitgang bij het identificeren van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen voor complexe gedrag maakt. Het gebruik van Drosophila als onderzoeksinstrument is toegestaan ​​substantiële vooruitgang in het begrip alcohol neurobiologie die snel kunnen worden vertaald naar zoogdieren 14-16. Om het begrip van de moleculaire mechanismen waardoor de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid te vergemakkelijken en om gedragsreacties over circadiane tijdstippen, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor gebruik bij weinig rood licht gelijkmatig te meten is vereist. Voor Drosophila, kan alcohol worden toegediend via de voeding suppletie voor chronische blootstelling of betrouwbaar door het toedienen van alcohol in de vorm van damp voor acute blootstelling. Hier, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor de beoordeling van de circadiane modulatie van verlies-van-oprichtreflex (lorr) 1 alsmede beschrijven wesedatie. Vliegen worden meegevoerd met 12 uur: 12 uur LD cycli bij constante temperatuur en vervolgens overgebracht naar een gecontroleerde lichte regime voor 2-5 dagen, afhankelijk van de experimentele vraag. Vliegen worden blootgesteld aan ethanol damp in een apparaat dat bekend staat als de flybar. In deze inrichting worden gecontroleerde hoeveelheden lucht door water en alcohol; de dampen worden vervolgens gemengd en geleid in een flesje behuizing de vliegen. Elke 5 min de vliegen worden gescoord voor het nummer dat niet wordt weergegeven oprichtende reflexen of zijn geworden verdoofd. Lorr percentages voor elk tijdstip berekend en vergeleken tussen circadiane tijdstippen of tussen stammen van vliegen. De eenvoud en betrouwbaarheid van alcohol aflevering met behulp van de flybar alcohol levering in combinatie met gedrags-analyse opties biedt een significant voordeel voor circadiane experimenten uitgevoerd onder donkere omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Alcohol 190 proof</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerator</td><td>Locale dierenwinkel</td><td></td><td>We gebruiken Whisper 60</td></tr><tr><td>Siliconen slang 1/8&rdquo;</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&deg; Y-connector</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Snelkoppelingen</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof buisklemmen</td><td>Bell-art producten</td><td>132250000</td><td>Of dit of volgende</td></tr><tr><td>Miniatuur luchtregelaar</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Of dit of vorige</td></tr><tr><td>Miniatuur luchtregelaar montagebeugel</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Gilmont maat 12 stroomsnelheidsmeter</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Gereedschapsklemmen</td><td>McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Om stroomsnelheidsmeters vast te houden</td></tr><tr><td>Vial</td><td>VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Rubberstoep met twee gaten</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>Past in vials</td></tr><tr><td>5 mm Pyrex glasbuizen</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>Past het beste in vorige stop</td></tr><tr><td>Teflon tape</td><td>Hardware winkel</td><td></td><td>Om een goede pasvorm in stoppen te bereiken indien nodig</td></tr><tr><td>Rubberstoep met twee gaten</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Past op onze flessen</td></tr><tr><td>Weggeefbare glazen pipetten</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Snijden op lengte en buigen door verhitting</td></tr><tr><td>Zeer fijn nylon netwerk</td><td>VWR</td><td>Verschillende</td><td></td></tr><tr><td>15 watt lampen</td><td>Hardware winkel</td><td></td><td>Bovenliggend rood licht</td></tr><tr><td>Fotografische rode veilige lichtfilters</td><td></td><td></td><td>Bovenliggend rood licht</td></tr><tr><td>Mini zaklampen met rode filters</td><td>Mag-light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de flybar: toedienen alcohol te flies

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruitvliegen (Drosophila melanogaster) zijn een gevestigd model voor zowel alcohol onderzoek en circadiane biologie. Onlangs hebben we aangetoond dat de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid, maar niet de vorming van tolerantie. Hier beschrijven we ons protocol in detail. Alcohol wordt toegediend aan het vliegen met de flybar. In deze opstelling wordt verzadigd alcohol damp vermengd met bevochtigde lucht in set proporties, en toegediend aan de vliegen in vier tubes tegelijk. Vliegen zijn gefokt onder gestandaardiseerde omstandigheden om variatie tussen de herhalingen minimaliseren. Drie dagen oude vliegen van verschillende genotypen of behandelingen worden gebruikt voor experimenten voorkeur congruente vliegen twee verschillende tijdstippen (bijv. CT CT 5 en 17) die kunnen vergelijken. Tijdens het experiment zijn vliegen blootgesteld gedurende 1 uur tot het vooraf bepaalde percentage alcohol damp en het aantal vliegen die het verlies van oprichtreflex (lorr) vertonen of sedatie worden geteld om de 5 minuten. De gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van drie verschillende statistische benaderingen. De eerste is de tijd waarbij 50% van de vliegen de oprichtreflex verloren bepalen en gebruiken van een analyse van de variantie (ANOVA) om te bepalen of significante verschillen tussen tijdstippen. De tweede is om het percentage vliegen die lorr tonen na een bepaald aantal minuten, gevolgd door een ANOVA-analyse te bepalen. De laatste methode is om de hele tijd series met behulp van multivariate statistische analyse. Het protocol kan worden gebruikt voor niet-circadiane experimenten of vergelijkingen tussen genotypen.

Circadiane Modulatie van Alcohol Gevoeligheid gebruik van de 50% lorr als een marker. Een representatief voorbeeld toont circadiane modulatie alcohol gevoeligheid overdag wordt getoond in Figuur 2. Lorr gemeten op zes tijdstippen gedurende de 2 e dag van DD in Canton-S en 50% lorr werd voor elk tijdstip. Analyse toonde een significant effect van de tijd van de dag (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p &lt;0,001, N = 6-10 per tijdstip). De Fisher LSD test to...

Drosophila heeft zich ontpopt als een belangrijk modelsysteem voor het ontleden van de cellulaire en moleculaire onderbouwing van gedragsreacties op alcohol. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van alcohol gevoelige gegevens in een circadiane context die gemakkelijk kan worden toegepast op andere experimenten en is goed geschikt voor gegradueerdenonderzoek.

De flybar: Toedienen Alcohol te Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van door alcohol geïnduceerd gedrag bij Drosophila, met behulp van een goedkope en eenvoudig te assembleren opstelling die zeer geschikt is voor onderzoek door studenten of onderzoekers die nieuw zijn in circadiane studies. Dit wordt bereikt door eerst de vliegenstang te assembleren, waardoor gelijktijdige vergelijkingen van meerdere groepen vliegen mogelijk zijn.De volgende stap van de procedure is het kweken van drosophila onder specifieke licht-donkercycli en het verzamelen van vliegen van dezelfde leeftijd voor het experiment. Vervolgens worden de vliegen blootgesteld aan gedefinieerde concentraties alcoholdamp en worden de gegevens verzameld. Uiteindelijk kan het meten van het verlies van de schrijfreflex of sedatie verschillen in alcoholgevoeligheid tussen groepen aantonen, gebaseerd op respectievelijk het tijdstip van de dag of genetica.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de observatiestappen moeilijk aan te leren zijn vanwege de uitdagingen bij het observeren van het gedrag en het zwakke rode licht, en het bepalen welke vliegen hun schrijfreflex hebben verloren en welke niet. Zet eerst de vliegenstang in elkaar. Begin met het monteren van de luchtstroom.Sluit een kort stuk flexibele siliconen slang aan op een luchtaansluiting van het gebouw of een aquariumbeluchter om luchttoevoer te genereren. Verdeel de luchtstroom met een Y-connector. Sluit de eerste aftakking aan op een drukregelaar.Hiermee wordt de totale hoeveelheid lucht door het systeem geregeld. Sluit de tweede aftakking aan op een snelkoppeling. Hierdoor kan de luchtstroom indien nodig worden onderbroken zonder de gekalibreerde luchtstroom te beïnvloeden.Voeg een Y-connector toe en verbind elke vertakkingsbuis met een luchtstroomregelaar. Verbind vervolgens elke regelaar met een luchtstroommeter. Snijd nu glazen pipetten van één milliliter in secties en smelt in elke sectie een rechte hoek.Deze zullen fungeren als starre kniebuisjes in de opstelling. Steek de rechte glazen pipet voor de luchtinlaat door één gat en breng deze in de vloeistof tot één centimeter boven de bodem. Steek een kniebocht van glas door het andere gat totdat deze net de fles binnengaat.Gebruik deze uitlaten om de luchtstroom van elke fles samen te voegen bij een Y-connector. Verbind de luchtstroommeters met het rechte gedeelte van een pipette met behulp van flexibele slang. Deze dienen als de luchtinlaten voor de twee oplossingsflessen.Plaats beide flessen met oplossingen, water of alcohol, in een waterbad dat twee graden hoger is ingesteld dan de omgevingstemperatuur. Sluit de flessen af met rubberen stoppen die twee gaten hebben, voorzien van siliconen slangjes. Bevestig het andere uiteinde van de Y aan een fles met een rubberen stop met twee gaten.De luchtstroom uit deze mengkolf zal verdampte alcohol en water naar de observatiebuisjes voeren. Splits de uitgaande luchtstroom van de mengkolf twee of drie keer om vier of acht kleinere luchtstromen te verkrijgen. Eén voor elk observatiebuisje.Blijf siliconenslangen gebruiken. De observatiebuisjes zijn lege vliegvials die zijn afgesloten met een rubberen stop met twee gaten, een inlaat en een uitlaat voor de alcoholdamp. Glazen buisjes passen in de gaten van de stop.Bedek de uiteinden van de glazen buisjes met gaas. Zet het gaas vast met een klein stukje flexibele plastic slang. Steek deze slang door het eerste gat totdat deze ongeveer tot de helft van de lengte van het flaconje reikt.Gebruik indien nodig Teflontape om een nauwe aansluiting te verkrijgen. Voeg de tweede glazen buis met netwerk in totdat deze gelijk ligt met de binnenrand van de rubberen stop. Meng de juiste fracties van de twee luchtstromen die door alcohol of water worden geleid.Monitor de luchtdruk continu en breng indien nodig aanpassingen aan om de gewenste mengverhouding van alcohol en waterdamp in de mengfles te handhaven. Zorg bij dit soort experimenten altijd voor voldoende ventilatie in de ruimte. Om variatie tussen replica's te minimaliseren, moet er uiterste aandacht worden besteed aan de kweekomstandigheden van de vliegen.Vliegen moeten worden gekweekt onder omstandigheden met een lage dichtheid en zeer strikt worden gesynchroniseerd, zodat vliegen van dezelfde leeftijd en cohort tegen elkaar kunnen worden getest. Verzamel bij het invallen van de schemering vers uitgekomen dieren en bewaar deze gedurende 24 uur in houdflesjes met een kleine hoeveelheid voedsel met een hoge agarconcentratie op hetzelfde tijdstip.Verdeel de verzamelde vliegen de volgende dag met een aspirator in cohorten van ongeveer 30 vliegen en breng de cohorten over naar verse vials om de circadiane modulatie van het gedrag te testen. Bereid voldoende cohorten voor om elke conditie op zes gelijkmatig verdeelde tijdstippen op de testdag te testen op circadiane modulatie van het gedrag. Houd de vliegen daarnaast gedurende twee dagen vóór de test in constante duisternis bij 25 °C.Ongeacht het experimentele ontwerp moeten de vliegen ten minste één uur vóór de gedragsassay worden overgebracht naar de experimentele gedragsruimte, die alleen verlicht is met zwak rood licht. Voer de experimenten uit onder zwak rood licht, zodat fotostimulatie de resultaten niet beïnvloedt. Laat vóór het experiment ten minste 10 minuten lucht door het systeem stromen en kalibreer de luchtstromen.Plaats een stuk wit papier onder de observatiebuisjes om de zichtbaarheid van de vliegen te vergroten door extra contrast. Zodra de luchtstroom is gestabiliseerd, koppelt u de snelkoppeling los en brengt u per observatiebuisje één cohort van 30 vliegen over.Test bij elke run van de fly bar elke experimentele conditie. Dit vergroot de robuustheid van het experiment en minimaliseert de impact van dagelijkse variaties. Zodra alle observatiebuisjes zijn geladen, sluit u de luchtstroom opnieuw aan en start u de timers.Gebruik één timer om de totale blootstellingstijd aan alcohol bij te houden en de andere om intervallen van vijf minuten gedurende de proef af te tellen. Controleer de luchtstromen en voer indien nodig aanpassingen uit zodat deze constant blijven. Over het algemeen stabiliseren de luchtstromen elke vijf minuten met behulp van een rode lamp.Tel het aantal vliegen dat het schrijfreflex heeft verloren. Houd de lamp op minimaal 12 inches afstand van de vials. Geef de vial een stevige tik en tel hoeveel vliegen er niet binnen ongeveer vier seconden weer naar boven klimmen.Deze vliegen kunnen mogelijk nog met hun poten en vleugels bewegen, maar ze zullen niet in staat zijn om zichzelf weer rechtop te zetten. Als de vlieg geen enkel ledemaat beweegt, is deze volledig gesedeerd. Dit kan als een ander criterium worden gescoord dan het ontbreken van de writereflex.De sessie duurt ongeveer een uur; tel aan het einde het totale aantal vliegen in elk bestand met behulp van het beschreven protocol. Er werd een circadiane modulatie in alcoholgevoeligheid gemeten. Het ontbreken van de writingsreflex werd gemeten op zes tijdstippen tijdens de tweede dag van duisternis bij Canton S; het tijdstip van de dag had een significant effect op de tijd.De helft van de vliegen slaagde er niet in zichzelf te schrijven. Het percentage gesedeerde vliegen uit de cantons werd gemeten na 40 minuten met 30% alcohol. De damp werd gemeten bij CT vijf subjectieve dag en CT 17 nacht.Er werd vastgesteld dat er tijdens de subjectieve dag significant minder vliegen gesedeerd waren vergeleken met de nacht. Met behulp van een tijdreeks werden verschillen in het writen-reflex en de sedatie geïllustreerd wanneer Canton S-vliegen werden vergeleken met vliegen die de white 1 1 1 8-mutatie droegen. Binnen de Canton S-achtergrond vertoonden de white 1 1 1 8-vliegen een beter writen-reflex als reactie op ethanol-damp dan de Canton S-vliegen. Verschillen tussen white 1 1 1 8-mutanten en wildtype vliegen werden ook aangetroffen in de sedatiesnelheid.Het verschil is zeer waarschijnlijk toe te schrijven aan de veranderde niveaus van biogene vijanden bij de white 1 1 1 8 mutatie. Daarom is het noodzakelijk om te controleren voor gedragsreacties als gevolg van de white 1 1 1 8 mutatie die in veel transgene lijnen aanwezig is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alcohol aan vliegen dient toe te dienen met behulp van de fly barn.Het is essentieel dat de vliegen op een methodische manier worden verzameld en dat de waarnemingen bij het zwakke rode licht zo veel mogelijk worden gestandaardiseerd.

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een eenvoudige test om de sederende effecten van ethanol te meten...

Een eenvoudige manier om Ethanol Gevoeligheid meten in Flies

Deze video beschrijft hoe een injectie van levende volwassen vliegen uit te voeren en bevat een voorbeeldprotocol waarin gelabelde deeltjes en trypanblauw in de buik van vliegen worden geïnjecteerd om fagocytose te meten.

Injectie van volwassen Drosophila-vliegen: een methode voor samengestelde of labelafgifte

This video demonstrates the nano-injection of bacterial suspension into the fly body cavity, resulting in bacterial multiplication and infection. The fly's immune response clears some bacteria, while others escape immune clearance and survive within the host causing an infection.

Infecting Flies with Bacterial Suspension Using a Nanoinjector

This video demonstrates a technique to infect Drosophila by introducing a pathogenic bacteria directly into their body cavity. This method bypasses epithelial barriers and other passive defense mechanisms, allowing for the induction of systemic infection. Upon infection, the resulting immune response is assessed by monitoring fly mortality and performing downstream assays.

A Septic Pinprick Technique to Introduce Systemic Bacterial Infection in Flies

Eenvoudige tests voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij Drosophila vergemakkelijken het gebruik van dit modelorganisme voor het onderzoeken van deze belangrijke ethanol-gerelateerde gedragingen. Hier wordt een relatief eenvoudige, schaalbare test beschreven voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij vliegen.

Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in<em&gt; Drosophila</em

Hier beschreven is het gebruik van verschillende zelfgemaakte tools om volwassen Drosophilaover te dragen, te koelen en te doden, evenals om glazen cultuur flesjes schoon te maken en eieren te verzamelen. Deze gereedschappen zijn gemakkelijk te maken en zijn vrij efficiënt in het hanteren van Drosophila.

Eenvoudige zelfgemaakte gereedschappen voor het hanteren van fruit vliegjes-Drosophila melanogaster

De huidige methoden om de alcoholgevoeligheid in Drosophila te meten zijn ontworpen om groepen vliegen te testen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De methode vereist geen gespecialiseerde gereedschappen en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen.

High-Throughput Methode voor het meten van alcohol sedatie tijd van individuele Drosophila melanogaster

De Flypub test meet het gedrag dat de fruitvlieg Drosophila melanogaster toont onder invloed van ethanol. De test kan gemakkelijk worden beheerst door onderzoekers op alle niveaus en toegepast op verschillende verdampte stimuli, het vergemakkelijken van drugsmisbruik en verslavingsstudies.

Flypub om ethanol geïnduceerde gedragsstoornissen en sensibilisatie te bestuderen

De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) wordt veel gebruikt voor biologisch en toxicologisch onderzoek. Om het nut van vliegen uit te breiden, ontwikkelden we een instrument, de seriële anesthesie-array, die tegelijkertijd meerdere vliegenmonsters blootstelt aan vluchtige algemene anesthetica (VGA's), waardoor het mogelijk wordt om de neveneffecten (toxisch en beschermend) van VGA's te onderzoeken.

De seriële anesthesie-array voor het high-throughput onderzoek van vluchtige stoffen met behulp van Drosophila melanogaster

Dit artikel schetst het laboratoriumonderhoud (inclusief paring en voeding) van de onderste dipteranvlieg Bradysia (Sciara) coprophila.

Laboratoriumonderhoud van de onderste dipteravlieg Bradysia (Sciara) coprophila: een nieuw/oud opkomend modelorganisme

Leer alcoholgeïnduceerd gedrag meten bij Drosophila met een eenvoudige flybar-setup. Deze methode onderzoekt circadiane ritmes en genetische variaties in alcoholgevoeligheid, ideaal voor onderwijs en gedragsbiologisch onderzoek.

De flybar: Toedienen Alcohol te Flies

Meer video's verkennen