Name: Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer mechanische stimulatie-geïnduceerde calciumgolfvoortplanting in bovine cornea endotheelcellen met confocale microscopie. Deze methode onderzoekt gap junction kanalen en hemikanalen voor intercellulaire communicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek uitgevoerd in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO; subsidie ​​nummers G.0545.08 en G.0298.11), de Interuniversitaire attractiepolen Program (Federaal Wetenschapsbeleid; toekenningsnummer P6/28 en P7/13) en is ingebed in een FWO-ondersteund onderzoeksgemeenschap. CDH is een post-doctoraal onderzoeker van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO). De auteurs zijn erg dankbaar voor alle huidige en voormalige leden van het Laboratorium voor Moleculaire en Cellulaire Signalering (KU Leuven), dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometrie, USA), het laboratorium van Dr Leybaert (Universiteit Gent) en van Dr Vinken (VUB) die behulpzaam discussies verstrekt, geoptimaliseerde procedures of betrokken waren bij de ontwikkeling van instrumenten voor de studie van connexine hemikanalen.

1. Isolatie van corneale endotheelcellen Voordat u begint: Isoleer de cellen van de frisse ogen, verkregen uit een lokaal slachthuis, zo spoedig mogelijk na enucleating het oog. Zorg ervoor dat het oog werd enucleated uit een koe van maximaal 18 maanden oud zijn, vijf minuten post mortem en bewaard in Earle&#39;s Balanced Salt Solution - 1% jodium oplossing bij 4 ° C voor het transport naar het laboratorium. <ol><li> Neem het oog uit het Earle&#39;s Balanced Salt Solution - 1% jodium-oplossing en plaats deze in een petrischaal (100 x 20 mm). </li><li> Steriliseer het oog met een oplossing die 70% ethanol en spoel met Earle&#39;s gebalanceerde zoutoplossing bevattende 1% jodium. </li><li> Vanaf deze stap over, werken in een steriele kap. Ontleden voorzichtig het hoornvlies van het oog en plaats deze in een petrischaal (35 x 10 mm) met Earle&#39;s Balanced Salt Solution, de epitheliale cellaag naar boven. Verwijder zorgvuldig alle resterende irisweefsel still indien nodig aan de cornea. </li><li> Breng de cornea andere Earle&#39;s Balanced Salt Solution bevattende petrischaal met de endotheliale cellaag omhoog en spoel tweemaal met Earle&#39;s Balanced Salt Solution. </li><li> Breng het hoornvlies met de endotheellaag naar boven in een zandloper, een komvormig schotel, en bedekken met groeimedium. Het groeimedium bestaat uit Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium bevattende 25 mM glucose, 10% foetaal runderserum, 6,6% L-glutamine, 2,5 ug / ml amfotericine-B en 1% antibioticum-antimycoticum mengsel dat 10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B. </li><li> Verwijder het medium een ​​zuigkracht pipet. </li><li> Breng 300 pi van een trypsine-oplossing (0,5 g / L) de endotheliale laag van het hoornvlies (alle stappen die trypsine bevatten worden door met dezelfde concentratie). </li><li> Plaats de zandloper met het hoornvlies in een overdekte petrischaal en zet het in de incubator gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voorzichtig schrapen de endotheelcellen uit de buurt van het hoornvlies met een brand-gepolijste haakvormige glas Pasteur pipet in een steriele kap. </li><li> Zuigen uit de oplossing die de endotheelcellen toevoegen aan kolven (25 cm2) met 4 ml kweekmedium. </li><li> Breng 300 pi groeimedium aan het hoornvlies en herhaal het schrapen en voeg de oplossing die de endotheelcellen aan de kweekkolf. </li><li> Herhaal deze laatste stap (1.11) eens te meer. </li><li> Plaats de cultuur kolven met de corneale endotheelcellen in het groeimedium in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na twee dagen, voeg 6 ml kweekmedium. </li><li> Vernieuw het groeimedium elke tweede dag. </li></ol> 2. Celkweek <ol><li> Verwijder het kweekmedium en twee keer was de cellen met Earle&#39;s Balanced Salt Solution, wanneer confluentie bereikt is (binnen about 10 dagen na isolatie). </li><li> Voeg 1,5 ml trypsine oplossing om de cellen om ze los door de kolf in de incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 3 tot 4 min. </li><li> Voeg 12 ml groeimedium. Pipetteer de middellange drie keer in en uit om de cellen te verspreiden en tel de cellen. </li><li> Zaad van de cellen met een variabele fractie afhankelijk van de celdichtheid en zet ze in de couveuse. Bereid twee goed-kamer slides (met een oppervlakte van 4,2 cm 2) met een celgetal van 165.000 cellen (celdichtheid 39.286 per cm 2). Bereid 80 cm2 cultuur flessen een nieuwe passage in een dichtheid van 6.250 per cm2, door vers kweekmedium tot een totaal volume van 25 ml. </li><li> Vernieuw het medium om de twee dagen. </li><li> Confluentie van de cellaag wordt bereikt na 3 tot 4 dagen. Gebruik cellen voor experimenten. </li><li> Wanneer confluentie van de cellaag in de kolven wordt bereikt, herhaalt u de stappen 2,1-2,6. Celculturen tot passage 2 kan worden fof experimenten. </li></ol> 3. Mechanische stimulatie voor Inducerende Calcium Wave <ol><li> Plaats de cellen in de chambered dia met 10 pM Fluo-4:00 in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de TL 4:00 oplossing was de cellen vijf keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing, incubeer de cellen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing en laat de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur vóór de meting. </li><li> Excite bij 488 nm met Argon laser en gebruik beam splitter HFT 488, het verzamelen van de fluorescentie-emissie bij 530 nm met behulp van een longpass emissiefilter LP 505, stellen de pinhole op minimum. Gebruik een olie-immersie 40X objectief (Air, 1.2 NA). In experimenten met ARL-67156, gebruik dan een 10X objectief (Air, 0.3 NA). </li><li> Zoeken naar een veld waarin de cellen confluent de confocale microscoop. </li><li> Plaats de pipet zodat deze op 45 ° ten opzichte van de chambered glijbaan en aanraken van de celmembraan.Leiden tot een korte (≈ 1 sec) mechanische stimulatie van een enkele cel. De mechanische stimulatie bestaat uit een acuut en kortdurend vervorming van de cel door kort minder dan 1% van het celmembraan aanraken met een glazen micropipet (tip diameter &lt;1 pm) gekoppeld met een piëzo-elektrisch kristal nanopositioner, bediend via een versterker die gemonteerd op een micro-manipulator. De glazen micropipetten zijn gemaakt met een micro-elektrode trekker. Zorg ervoor dat de nanopositioner wordt bediend door een spanning tussen 0,2 en 1,5 V tijdens de mechanische stimulatie. Een spanning lager dan 1,5 V kunnen tot celbeschadiging. Voor elk type cel en conditie, moet de optimale spanning voor mechanische stimulatie zonder beschadiging van cellen zorgvuldig worden bepaald door toepassing van een reeks spanningen vanaf laag (0,2 V) naar hoog (1,5 V) spanning. De spanning is een maat voor de kracht van de stimulatie aangezien deze spanning bepaalt de mechanische spanning en spanning die worden toegepast op de celmembraan. Dewerking van de mechanische stimulatie kan worden berekend door de mechanische spanning te vermenigvuldigen met het gebied. Aangezien zowel de omgeving (&lt;3,14 um 2) en de spanning zeer laag, de kracht van de mechanische stimulatie laag. (Merk op dat wanneer een cel wordt beschadigd, de fluorescentie lekt uit de cel en de cel wordt donker.) </li><li> Meet ruimtelijke veranderingen in [Ca 2 +] i na mechanische stimulatie met de confocale microscoop. </li><li> Verzamelen en opslaan van afbeeldingen. </li><li> Teken een veelhoekig gebied van belang de totale oppervlakte van reagerende cellen (actief gebied AA) met de software van de confocale microscoop definiëren. </li></ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode om intracellulaire Ca2 +-golven meten monolagen van primaire boviene corneale endotheelcellen door een lokale en gecontroleerde mechanische stimulatie met behulp van een micropipet. Mechanisch gestimuleerde cellen reageren met een lokale toename van intracellulaire IP3 en Ca2 +, die beide essentiële intracellulaire signalerende moleculen die rijden intracellulaire Ca 2 +-golven 11,67. IP3 wordt direct overgebra...

Intercellulaire communicatie en signalering zijn essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen in reactie op extracellulaire agonisten op weefsel en hele-orgaan level 1,2. De meest directe manier intercellulaire communicatie wordt door het optreden van gap junctions. Gap junctions zijn plaquettes van gap junction kanalen, die eiwitachtige kanalen gevormd door de head-to-head couperen van twee connexine (Cx) hemichannels van aangrenzende cellen 3,4 (figuur 1) zijn. Gap junctions doorlaten kleine signaalmoleculen met een molecuulgewicht van minder dan 1,5 kDa, zoals Ca2 + of IP 3 5, waardoor modulerende Ca2 +-afgifte uit de intracellulaire opslagplaatsen van de naburige cellen 6 (figuur 2). Gap junction kanalen zijn strak gereguleerd door intra-en intermoleculaire eiwit interacties en door cellulaire signalering processen, zoals redox wijziging enfosforylering 7. GJS vergemakkelijken de gecoördineerde respons van de aangesloten cellen, waardoor die als een chemische en elektrische syncytium. Bijvoorbeeld, de verspreiding van cardiale actiepotentiaal in de atriale en ventriculaire myocyten wordt gemedieerd door Cx-based GJ kanalen 85. Cxs niet alleen een rol van gap junction kanalen, maar ook vormen ongepaarde hemichannels, daardoor functioneren als kanalen in membranen eveneens regelmatig ionenkanalen 8-10 (Figuur 1). Hemichannels deelnemen aan paracrienen tussen naburige cellen door het regelen van de uitwisseling van ionen en signaalmoleculen tussen de intra-en extracellulaire milieu. In veel celtypen (zoals epitheelcellen, osteoblasten, astrocyten, endotheelcellen, enz.) en organen (zoals de hersenen, de lever, de retina, cochlea en het vaatstelsel), intercellulaire Ca2 +-golven zijn fundamenteel voor de coördinatie van meercellige reacties <sup&gt; 11. Verhogingen van de intracellulaire Ca2 + niveaus in een bepaalde cel zijn niet beperkt tot deze cel, maar doorgeven aan de omringende naburige cellen is, zodat de intracellulaire Ca 2 +-wave 12,13. Deze intercellulaire Ca2 +-golven zijn belangrijk voor de normale fysiologische regulering cellagen als syncytia en de dysregulatie is geassocieerd met pathofysiologische processen 11. In de hoornvliesendotheel en epitheel, verschillende groepen 14-24, inclusief onze eigen 25-33, bestudeerde de mechanismen en de rol van intercellulaire communicatie. In niet-exciteerbare cellen, zoals corneale endotheelcellen, twee verschillende modi van intercellulaire communicatie plaatsvinden 28,29, namelijk spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie. Spleetovergangen intercellulaire communicatie impliceert een directe uitwisseling van signaalmoleculen via gap junctions 7. Gap juncnale intercellulaire communicatie is van cruciaal belang voor het behoud van weefsel homeostase, het regelen van celproliferatie, en de oprichting van een gesynchroniseerde reactie op extracellulaire spanning 10,34,35. In een aantal pathologieën, wordt gap junction koppeling verminderd als gevolg van gebrekkige Cxs, en hierbij van invloed spleetovergangen intercellulaire communicatie 36. Dit benadrukt het belang en de invloed van spleetovergangen intercellulaire communicatie in meercellige organismen. In tegenstelling tot spleetovergangen intercellulaire communicatie paracriene intercellulaire communicatie is niet afhankelijk van cel-cel bijstelling, omdat impliceert de diffundeerbare extracellulaire messengers (figuur 2). Verschillende soorten signaalmoleculen worden uitgebracht in de extracellulaire ruimte door signalering cellen. Het molecuul wordt dan naar de doelcel, waar het wordt gedetecteerd door een specifiek receptoreiwit. Vervolgens wordt het receptor-complex signaal induceert een cellulaire reactie diewordt beëindigd door verwijdering van het signaal, inactivering of desensibilisatie. Uitgebracht lipofiele extracellulaire signalen boodschappers penetreren het membraan en handelen op intracellulaire receptoren. Daarentegen hebben hydrofiele boodschappers niet over de plasmamembraan van de reagerende cel, maar fungeren als een ligand dat bindt aan het oppervlak tot expressie gebrachte receptor eiwitten, die doorzenden het signaal naar de intracellulaire omgeving. Drie belangrijke families van celoppervlak receptor-eiwitten aan dit proces: ionkanaal-gekoppelde, enzyme-linked, en G eiwit-gekoppelde. De vrijgegeven boodschappermolecule kan handelen receptoren van dezelfde cel (autocriene) op doelwitcellen in de nabijheid (paracriene) of op verre doelcellen die de bloedsomloop (endocriene) vereist. In vele celtypen, waaronder corneale endotheel 28,29, ATP is een van de belangrijkste hydrofiele, paracriene factoren die de voortplanting van intracellulaire Ca2 +-golven 37-40 drijven. During mechanische vervorming, hypoxie, ontsteking of stimulatie door verschillende agenten, kan ATP uit gezonde cellen 41-44 worden uitgebracht in reactie op shear stress, rek, of osmotische zwelling 44,45. Verschillende ATP-afgifte mechanismen geopperd, zoals vesiculaire exocytose 44 en een veelheid van transportmechanismen, zoals ATP-bindende cassette (ABC) transporters, plasmalemmal spanningsafhankelijke anion kanalen 46, P2X7 receptor kanalen 47,48, alsmede connexin hemichannels 49-52 en pannexin hemikanalen 43,49,53. Extracellulair ATP kan snel gehydrolyseerd ADP, AMP en adenosine 54,55 door ectonucleotidases die in het extracellulaire milieu. Het extracellulair vrijgegeven ATP en zijn metaboliet ADP 56 zal verspreiden via diffusie. De daaropvolgende interactie van deze nucleotiden purinerge receptoren in de naburige cellen is betrokken bij de propagation van intercellulaire Ca2 +-golven 28,37,51. Twee verschillende klassen van purinerge receptoren aanwezig zijn: adenosine is de voornaamste natuurlijke ligand voor P1-purinoceptoren, terwijl zowel purine (ATP, ADP) en pyrimidine (UTP, UDP) nucleotiden handelen meeste P2-purinoreceptoren 57. Intercellulaire communicatie kan worden onderzocht door verschillende methoden, zoals schrapen loading, kleurstofoverdracht, lokale uncaging van agonisten zoals IP3 en Ca 2 +, mechanische stimulatie enz.. Hier beschrijven we de studie van Ca 2 +-golven opgewekt door mechanische stimulatie van een enkele cel. Het voordeel van het bestuderen van Ca 2 +-golven door mechanische stimulatie is dat het een eenvoudig hulpmiddel om de verspreiding van de Ca 2 +-golf in de tijd te kwantificeren en geeft kwantitatief vergelijken van verschillende voorbehandelingen van de cellen. In het corneale endothelium, die intracellulaire Ca 2 +-golven kunnen een cogecoördineerd antwoord van de monolaag, wordt als een mogelijke afweermechanisme van de niet-regeneratieve corneale endotheel helpen het endotheel aan extracellulaire spanningen tijdens intraoculaire chirurgie weerstaan, of na blootstelling aan ontstekingsmediatoren bij afstoting of uveitis 58,59.

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (Glutamax)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic mixture</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two chambered glass slides</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211;lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplifier</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td><td>E463 HVPZT-amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211;lectrode puller </td><td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td><td>WZ DMZ-Universal Puller</td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische stimulatie geïnduceerde calcium golfvoortplanting in celmonolagen: het voorbeeld van bovine corneale endotheelcellen

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellulaire communicatie is essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen tussen cellen in diverse organen en weefsels zoals de hersenen, lever, retina, cochlea en vaatstelsel. In experimentele opstellingen, intracellulaire Ca2 +-golven worden opgewekt door een mechanische prikkel een enkele cel. Dit leidt tot de afgifte van de intracellulaire signalerende moleculen IP3 en Ca2 + die de voortplanting van de Ca 2 +-golf inleiding concentrisch van de mechanisch gestimuleerde cel om de naburige cellen. De belangrijkste moleculaire pathways die intercellulaire Ca2 +-golven controle worden geleverd door gap junction kanalen via de rechtstreekse overdracht van IP-3 en door hemikanalen door het vrijkomen van ATP. Identificatie en karakterisering van de eigenschappen en de regelgeving van de diverse connexin en pannexin isovormen als gap junction kanalen en hemikanalen zijn toegestaan ​​door de quantification van de verspreiding van de intercellulaire Ca 2 +-golf, siRNA, en het gebruik van remmers van gap junction kanalen en hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca2 +-golf in monolagen van primaire corneale endotheliale cellen met Fluo4-vm in antwoord op een gecontroleerde en gelokaliseerde mechanische stimulus veroorzaakt door een acuut en kortdurend vervorming van de cel te meten als gevolg het aanraken van de celmembraan met een micromanipulator gecontroleerde glazen micropipet met een tip diameter van minder dan 1 urn. Ook beschrijven de isolatie van primaire boviene corneale endotheelcellen en het gebruik ervan als modelsysteem voor Cx43 hemichannel activiteit uitoefent als de aangedreven kracht intracellulaire Ca 2 +-golven door het vrijkomen van ATP. Tenslotte bespreken we het gebruik, voordelen, beperkingen en alternatieven van deze werkwijze in het kader van gap junction kanaal en hemichannel onderzoek.

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties en het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van het dier zorg en gebruik commissie van de KU Leuven. In runder corneale endotheelcellen (BCEC) worden functionele gap junctions expressie en beide spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie aanzienlijk bijdragen aan intercellulaire ...

Intercellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Golven worden gedreven door gap junctie kanalen als hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca meten<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Golven in celmonolagen in reactie op een lokale eencellige mechanische stimulus en de toepassing ervan op de eigenschappen en de regulering van de gap junction kanalen en hemikanalen onderzoeken.

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de intercellulaire communicatie via gap junction-kanalen en HEMI-kanalen te bestuderen door middel van kwantificering van de verspreiding van de intercellulaire calciumgolf, opgewekt door mechanische stimulatie in monolagen van primaire corneale endotheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst de primaire corneale endotheelcellen te isoleren uit verse runderogen. Als tweede stap, twee tot drie dagen na het uitzaaien in kamer-slides, wordt de confluente monolaag cellen geladen met de fluorescente calciumgevoelige kleurstof flu O 4:00 AM. Vervolgens passen we een gecontroleerde en lokale mechanische stimulus toe op één enkele cel van de monolaag om een intercellulaire calciumgolf op te wekken, die vervolgens met een confocale microscoop wordt gevisualiseerd.De resultaten tonen de verspreiding van de intercellulaire calciumgolfpropagatie. Uiteindelijk wordt de inhibitie van gap junction-kanalen en hemikanalen gebruikt om de eigenschappen en regulatie te ontrafelen van verschillende connexine- en panexine-isoformen die gap junction-kanalen en hemikanalen vormen. Het belangrijkste voordeel van door mechanische stimulatie geïnduceerde intercellulaire calciumgolfpropagatie is dat het een eenvoudige en betrouwbare methode biedt om de bijdrage en eigenschappen van verbindende en axiale kanalen op een niet-invasieve manier te onderzoeken.Bovendien is de methode afhankelijk van de fysiologische signaleringsmoleculen en cascades die aanwezig zijn in de bestudeerde cellulaire systemen. Ten slotte is deze eenvoudig aanpasbaar aan diverse celsystemen, inclusief primaire cellen en celmodellen die bepaalde connexine- of PanIN-isoformen ectopisch tot expressie brengen. Deze methoden kunnen inzicht verschaffen in de functie en dynamische regulatie van connexine- en PanIN-gebaseerde gap junction-kanalen en hemikanalen door gebruik te maken van siRNA-gemedieerde knockdown van endogene connexine- of PanIN-isoformen en door het gebruik van selectieve remmers van gap junction-kanalen en hemikanalen.Dit systeem is zeker niet beperkt tot alleen corneale endotheelcellen. Het is aanpasbaar aan vrijwel elk celtype en ook aan complexere weefsels. Deze procedure maakt gebruik van een vers geënucleerd oog van een koe die niet ouder is dan 18 maanden en niet langer dan vijf minuten postmortem is.Dit werd naar het laboratorium getransporteerd in de gebalanceerde zoutoplossing van Earl en een 1% jodiumoplossing bij vier graden Celsius. Overbreng eerst het oog naar een Petrischaal van 100 millimeter bij 20 millimeter. Spoel het oog vervolgens af met EBSS die 1% jodium bevat.Steriliseer het vanaf dit punt met een oplossing die 70% ethanol bevat. Werk in een steriele laminaire flowkast. Dissekeer voorzichtig het hoornvlies uit het oog en plaats het in een Petrischaal van 35 millimeter bij 10 millimeter met EBSS, waarbij de epitheliale cellaag naar boven is gericht.Verwijder voorzichtig alle resterende irisweefsel dat nog aan het hoornvlies vastzit. Indien nodig, breng het hoornvlies over naar een andere schaal met EBSS met de endotheelcellaag naar boven en spoel dit vervolgens twee keer af met EBSS. Plaats daarna het hoornvlies met de endotheellaag naar boven in een zandloper-vormige houder en bedek dit met groeimedium.Om te spoelen, wordt het medium verwijderd met een zuigpipet. Breng 300 µL tripsinoplossing (0,5 g/L) aan op de endotheellaag van het hoornvlies. Plaats het zandlopervormige houdersysteem met het hoornvlies in een afgedekte Petrischaal en breng dit over naar de incubator voor 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.Nadat het zandloper-instrument is teruggehaald, worden de endotheelcellen voorzichtig van het hoornvlies geschraapt met een vuurgepolijste, haakvormige glazen Pasteurpipet. Aspireer de oplossing die de endotheelcellen bevat en voeg deze toe aan een vierkante kweekfles van 25 cm² met vier milliliter kweekmedium. Breng vervolgens 300 µL groeimedium aan op het hoornvlies.Herhaal het afschrapen en voeg de oplossing met de endotheelcellen toe aan de kweekfles. Herhaal deze stap nogmaals, plaats vervolgens de kweekflessen met de corneale endotheelcellen in het groeimedium in de incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Voeg twee dagen later zes milliliter kweekmedium toe en ververs het groeimedium om de tweede dag.De cellen moeten binnen zeven tot 10 dagen na isolatie confluent zijn voor passage. Aspireer eerst het kweekmedium en spoel vervolgens tweemaal met EBSS. Voeg daarna twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de cellen en plaats de kolf gedurende drie tot vier minuten in de incubator.Voeg vervolgens 12 milliliters groeimedium toe en pipetteer het medium drie keer op en neer om de cellen te dispergeren. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer of een automatische celsteller. Voeg 165 000 cellen toe aan twee well culture slides.Bereid vervolgens vierkante kweekflessen van 75 centimeter kwadraat voor voor een nieuwe passage bij een dichtheid van 6.250 cellen per centimeter kwadraat, voeg vers kweekmedium toe tot een totaalvolume van 25 milliliter en plaats de flessen en kamerslides in de incubator. Het medium wordt elke twee dagen ververst en de confluentie van de cellaag moet binnen drie tot vier dagen worden bereikt. Laad eerst de cellen in de kamerslide met 10 micromolar Fluo-4 AM in fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C onder zachte schudding. Terwijl de cellen incuberen in Fluo-4 AM, koppelt u een glazen micropipet met een tipdiameter van minder dan één micrometer aan een Pito electro crystals nanopositioneer en verbindt u deze met een versterker die op een micromanipulator is gemonteerd.Stel de spanning van de nanopositioneer in op tussen 0,2 en 1,5 volt. Verwijder de flu van 4:00 AM-oplossing. Was de cellen vervolgens vijf keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing en incubeer de cellen daarna gedurende ten minste vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur voor de meting.Exciteer bij 488 nanometers met een argonlaser en gebruik een HFT 48 beamsplitter. Verzamel de fluorescentie-emissie bij 530 nanometers met een longpass-emissiefilter, LP 5 0 5, waarbij het pinhole op het minimum is ingesteld; hier wordt een 40 x olie-immersieobjectief gebruikt. Plaats het chamber-preparaat op de tafel van een confocale microscoop en zoek een gebied met confluente cellen.Beweeg vervolgens de micromanipulator om de glazen micropipet zodanig te positioneren dat deze de celmembraan onder een hoek van 45 graden raakt. Bedien de micromanipulator om met de glazen micropipet kortstondig minder dan 1% van het membraan van de enkele cel aan te raken en zo een mechanische stimulatie van één seconde aan de cel toe te dienen. Meet vervolgens met een confocale microscoop de ruimtelijke veranderingen in de calciumionconcentratie na de mechanische stimulatie en verzamel en sla de beelden op.Teken tot slot met de software van de confocale microscoop een polyгонаal interessegebied om het totale oppervlak van de responsieve cellen te definiëren. Mechanisch gestimuleerde calciumtransiënten in bovine corneaal endotheelcellen onder controlecondities worden weergegeven op verschillende tijdstippen via representatieve pseudo-gekleurde fluorescentiebeelden; de fluorescentie-intensiteiten vóór stimulatie zijn zichtbaar in het eerste beeld. De witte pijl in het tweede beeld identificeert de mechanisch gestimuleerde cel.De calciumgolf plant zich voort naar zes naburige cellagen, waarbij het totale gebied van de door de golf bereikte cellen een actief oppervlak van 62, 870 micrometers squared oplevert. De lijngrafiek toont het tijdsverloop van de genormaliseerde fluorescentiewaarde of NF in de mechanisch gestimuleerde cel, aangeduid als ms, en de gemiddelde waarde van NF in de naburige cellagen één tot vijf, in de grafiek aangeduid als MB één tot MB vijf. Deze afbeeldingen tonen in detail significante veranderingen in de verspreiding van intercellulaire calciumgolven na behandeling met exogene nucleotiden in de grafiek links, en na behandeling met ectonucleotidase-remmers in de grafiek rechts. Meer specifiek laat de grafiek links een significante afname van het actieve oppervlak zien na behandeling van bovine corneale endotheelcellen met de exogene Aras Aase zes en Aase zeven, die ATP en ADP hydrolyseerden en hiermee de pericriene intercellulaire communicatieroute remden.Het sterretje geeft een P-waarde van minder dan 0,001 aan bij de aanwezigheid versus afwezigheid van ace. De grafiek rechts toont een significante toename van het actieve oppervlak na behandeling van BCEC met een selectieve ectonucleotide-remmer, A RL 6 7 1 56, waardoor de pericriene intercellulaire communicatieroute wordt versterkt. Het sterretje geeft een P-waarde van minder dan 0,001 aan bij de aanwezigheid versus afwezigheid van a RL zodra dit onder de knie is.Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd, in vijf tot 10 minuten worden voltooid voor één experiment in één conditie. Het uitvoeren van een volledige serie experimenten waarmee verschillende condities vergeleken kunnen worden, neemt één dag in beslag om tot statistische conclusies te komen. Er moeten onafhankelijke experimenten worden gebruikt die op verschillende dagen en met verschillende batches geïsoleerde cellen zijn uitgevoerd.Het meten en kwantificeren van de propagatie van intracellulaire calciumgolven maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van de celbiologische regulatie van verschillende connexine-isoformen als gap junction-kanalen en hemikanalen. Ik wil er ook op wijzen dat deze methode niet op zichzelf staat, maar aangevuld dient te worden met andere moleculaire en functionele benaderingen, variërend van dye transfer tot TP-release en elektrofysiologie.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft de techniek die wordt gebruikt om dubbelkanaals optisch karteren uit te voeren in gekweekte HL-1 atriale celmonolagen. Dit unieke protocol maakt de gelijktijdige visualisatie van zowel calcium (Ca) als spanning (Vm) activiteit in hetzelfde gebied mogelijk voor de gedetailleerde detectie en analyse van elektrofysiologische eigenschappen van gekweekte monolagen.

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.

Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Dit protocol beschrijft het gebruik van silicium nanodraden voor intracellulaire optische bio-modulatie van cellen in een eenvoudige en eenvoudig uit te voeren methode. De techniek is zeer aanpasbaar aan diverse celtypes en kan zowel in vitro als in vivo toepassingen worden gebruikt.

Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Leer mechanische stimulatie-geïnduceerde calciumgolfvoortplanting in bovine cornea endotheelcellen met confocale microscopie. Deze methode onderzoekt gap junction kanalen en hemikanalen voor intercellulaire communicatie.

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen (Video) | JoVE Journal

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Meer video's verkennen