Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de intercellulaire communicatie via gap junction-kanalen en HEMI-kanalen te bestuderen door middel van kwantificering van de verspreiding van de intercellulaire calciumgolf, opgewekt door mechanische stimulatie in monolagen van primaire corneale endotheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst de primaire corneale endotheelcellen te isoleren uit verse runderogen. Als tweede stap, twee tot drie dagen na het uitzaaien in kamer-slides, wordt de confluente monolaag cellen geladen met de fluorescente calciumgevoelige kleurstof flu O 4:00 AM. Vervolgens passen we een gecontroleerde en lokale mechanische stimulus toe op één enkele cel van de monolaag om een intercellulaire calciumgolf op te wekken, die vervolgens met een confocale microscoop wordt gevisualiseerd.

De resultaten tonen de verspreiding van de intercellulaire calciumgolfpropagatie. Uiteindelijk wordt de inhibitie van gap junction-kanalen en hemikanalen gebruikt om de eigenschappen en regulatie te ontrafelen van verschillende connexine- en panexine-isoformen die gap junction-kanalen en hemikanalen vormen. Het belangrijkste voordeel van door mechanische stimulatie geïnduceerde intercellulaire calciumgolfpropagatie is dat het een eenvoudige en betrouwbare methode biedt om de bijdrage en eigenschappen van verbindende en axiale kanalen op een niet-invasieve manier te onderzoeken.

Bovendien is de methode afhankelijk van de fysiologische signaleringsmoleculen en cascades die aanwezig zijn in de bestudeerde cellulaire systemen. Ten slotte is deze eenvoudig aanpasbaar aan diverse celsystemen, inclusief primaire cellen en celmodellen die bepaalde connexine- of PanIN-isoformen ectopisch tot expressie brengen. Deze methoden kunnen inzicht verschaffen in de functie en dynamische regulatie van connexine- en PanIN-gebaseerde gap junction-kanalen en hemikanalen door gebruik te maken van siRNA-gemedieerde knockdown van endogene connexine- of PanIN-isoformen en door het gebruik van selectieve remmers van gap junction-kanalen en hemikanalen.

Dit systeem is zeker niet beperkt tot alleen corneale endotheelcellen. Het is aanpasbaar aan vrijwel elk celtype en ook aan complexere weefsels. Deze procedure maakt gebruik van een vers geënucleerd oog van een koe die niet ouder is dan 18 maanden en niet langer dan vijf minuten postmortem is.

Dit werd naar het laboratorium getransporteerd in de gebalanceerde zoutoplossing van Earl en een 1% jodiumoplossing bij vier graden Celsius. Overbreng eerst het oog naar een Petrischaal van 100 millimeter bij 20 millimeter. Spoel het oog vervolgens af met EBSS die 1% jodium bevat.

Steriliseer het vanaf dit punt met een oplossing die 70% ethanol bevat. Werk in een steriele laminaire flowkast. Dissekeer voorzichtig het hoornvlies uit het oog en plaats het in een Petrischaal van 35 millimeter bij 10 millimeter met EBSS, waarbij de epitheliale cellaag naar boven is gericht.

Verwijder voorzichtig alle resterende irisweefsel dat nog aan het hoornvlies vastzit. Indien nodig, breng het hoornvlies over naar een andere schaal met EBSS met de endotheelcellaag naar boven en spoel dit vervolgens twee keer af met EBSS. Plaats daarna het hoornvlies met de endotheellaag naar boven in een zandloper-vormige houder en bedek dit met groeimedium.

Om te spoelen, wordt het medium verwijderd met een zuigpipet. Breng 300 µL tripsinoplossing (0,5 g/L) aan op de endotheellaag van het hoornvlies. Plaats het zandlopervormige houdersysteem met het hoornvlies in een afgedekte Petrischaal en breng dit over naar de incubator voor 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.

Nadat het zandloper-instrument is teruggehaald, worden de endotheelcellen voorzichtig van het hoornvlies geschraapt met een vuurgepolijste, haakvormige glazen Pasteurpipet. Aspireer de oplossing die de endotheelcellen bevat en voeg deze toe aan een vierkante kweekfles van 25 cm² met vier milliliter kweekmedium. Breng vervolgens 300 µL groeimedium aan op het hoornvlies.

Herhaal het afschrapen en voeg de oplossing met de endotheelcellen toe aan de kweekfles. Herhaal deze stap nogmaals, plaats vervolgens de kweekflessen met de corneale endotheelcellen in het groeimedium in de incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Voeg twee dagen later zes milliliter kweekmedium toe en ververs het groeimedium om de tweede dag.

De cellen moeten binnen zeven tot 10 dagen na isolatie confluent zijn voor passage. Aspireer eerst het kweekmedium en spoel vervolgens tweemaal met EBSS. Voeg daarna twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de cellen en plaats de kolf gedurende drie tot vier minuten in de incubator.

Voeg vervolgens 12 milliliters groeimedium toe en pipetteer het medium drie keer op en neer om de cellen te dispergeren. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer of een automatische celsteller. Voeg 165 000 cellen toe aan twee well culture slides.

Bereid vervolgens vierkante kweekflessen van 75 centimeter kwadraat voor voor een nieuwe passage bij een dichtheid van 6.250 cellen per centimeter kwadraat, voeg vers kweekmedium toe tot een totaalvolume van 25 milliliter en plaats de flessen en kamerslides in de incubator. Het medium wordt elke twee dagen ververst en de confluentie van de cellaag moet binnen drie tot vier dagen worden bereikt. Laad eerst de cellen in de kamerslide met 10 micromolar Fluo-4 AM in fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C onder zachte schudding. Terwijl de cellen incuberen in Fluo-4 AM, koppelt u een glazen micropipet met een tipdiameter van minder dan één micrometer aan een Pito electro crystals nanopositioneer en verbindt u deze met een versterker die op een micromanipulator is gemonteerd.

Stel de spanning van de nanopositioneer in op tussen 0,2 en 1,5 volt. Verwijder de flu van 4:00 AM-oplossing. Was de cellen vervolgens vijf keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing en incubeer de cellen daarna gedurende ten minste vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur voor de meting.

Exciteer bij 488 nanometers met een argonlaser en gebruik een HFT 48 beamsplitter. Verzamel de fluorescentie-emissie bij 530 nanometers met een longpass-emissiefilter, LP 5 0 5, waarbij het pinhole op het minimum is ingesteld; hier wordt een 40 x olie-immersieobjectief gebruikt. Plaats het chamber-preparaat op de tafel van een confocale microscoop en zoek een gebied met confluente cellen.

Beweeg vervolgens de micromanipulator om de glazen micropipet zodanig te positioneren dat deze de celmembraan onder een hoek van 45 graden raakt. Bedien de micromanipulator om met de glazen micropipet kortstondig minder dan 1% van het membraan van de enkele cel aan te raken en zo een mechanische stimulatie van één seconde aan de cel toe te dienen. Meet vervolgens met een confocale microscoop de ruimtelijke veranderingen in de calciumionconcentratie na de mechanische stimulatie en verzamel en sla de beelden op.

Teken tot slot met de software van de confocale microscoop een polyгонаal interessegebied om het totale oppervlak van de responsieve cellen te definiëren. Mechanisch gestimuleerde calciumtransiënten in bovine corneaal endotheelcellen onder controlecondities worden weergegeven op verschillende tijdstippen via representatieve pseudo-gekleurde fluorescentiebeelden; de fluorescentie-intensiteiten vóór stimulatie zijn zichtbaar in het eerste beeld. De witte pijl in het tweede beeld identificeert de mechanisch gestimuleerde cel.

De calciumgolf plant zich voort naar zes naburige cellagen, waarbij het totale gebied van de door de golf bereikte cellen een actief oppervlak van 62, 870 micrometers squared oplevert. De lijngrafiek toont het tijdsverloop van de genormaliseerde fluorescentiewaarde of NF in de mechanisch gestimuleerde cel, aangeduid als ms, en de gemiddelde waarde van NF in de naburige cellagen één tot vijf, in de grafiek aangeduid als MB één tot MB vijf. Deze afbeeldingen tonen in detail significante veranderingen in de verspreiding van intercellulaire calciumgolven na behandeling met exogene nucleotiden in de grafiek links, en na behandeling met ectonucleotidase-remmers in de grafiek rechts. Meer specifiek laat de grafiek links een significante afname van het actieve oppervlak zien na behandeling van bovine corneale endotheelcellen met de exogene Aras Aase zes en Aase zeven, die ATP en ADP hydrolyseerden en hiermee de pericriene intercellulaire communicatieroute remden.

Het sterretje geeft een P-waarde van minder dan 0,001 aan bij de aanwezigheid versus afwezigheid van ace. De grafiek rechts toont een significante toename van het actieve oppervlak na behandeling van BCEC met een selectieve ectonucleotide-remmer, A RL 6 7 1 56, waardoor de pericriene intercellulaire communicatieroute wordt versterkt. Het sterretje geeft een P-waarde van minder dan 0,001 aan bij de aanwezigheid versus afwezigheid van a RL zodra dit onder de knie is.

Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd, in vijf tot 10 minuten worden voltooid voor één experiment in één conditie. Het uitvoeren van een volledige serie experimenten waarmee verschillende condities vergeleken kunnen worden, neemt één dag in beslag om tot statistische conclusies te komen. Er moeten onafhankelijke experimenten worden gebruikt die op verschillende dagen en met verschillende batches geïsoleerde cellen zijn uitgevoerd.

Het meten en kwantificeren van de propagatie van intracellulaire calciumgolven maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van de celbiologische regulatie van verschillende connexine-isoformen als gap junction-kanalen en hemikanalen. Ik wil er ook op wijzen dat deze methode niet op zichzelf staat, maar aangevuld dient te worden met andere moleculaire en functionele benaderingen, variërend van dye transfer tot TP-release en elektrofysiologie.