Name: Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Leer hoe je fluorescentie-tijdsverloopfilms maakt van gistcellen en enkelceldynamiek analyseert met behulp van microfluïdische kamers en geautomatiseerde software. Deze methode helpt onderzoekers transcriptieveranderingen gedurende de celcyclus bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Emily Jackson, Joshua Zeidman, en Nicholas Wren voor commentaar op de software. Dit werk werd gefinancierd door GM95733 (tot NM), BBBE 103.316 en MIT opstarten van fondsen (tot NM).

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling-mediated+bacterial+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li>
<li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).</li>
<li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024(2005).</li>
<li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li>
<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het bovenstaande protocol beschrijft een eenvoudige methode om fluorescentie tijdreeksen gegevens te verkrijgen en te analyseren met een beperkte ervaring in microfluidics of in software ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om tijd-vervallen fluorescentie films van enkele gistcellen te verkrijgen; extraheren relevante celgrootte en metingen meningsuiting; kapelaan tracking en lineage opdrachten, en analyseren van het gedrag van de gehele cellen na verloop van tijd met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdi...

Single-cell analyse van genexpressie heeft bevorderd ons begrip van de vele aspecten van genregulatie. Statische momentopnamen van fluorescerende reporter expressie met behulp van flowcytometrie of microscopie nuttige informatie over de verdeling van eencellige expressie, maar missen de geschiedenis en evolutie van tijdreeksen gegevens die nodig zijn om gen-expressie dynamiek rechtstreeks te informeren. Fluorescentie time-lapse microscopie presenteert een middel om zowel single-cell metingen en hun geschiedenis te verkrijgen. Verschillende experimentele en analytische technieken ontwikkeld voor het verkrijgen en kwantificeren films van fluorescente reporter expressie, waardoor meegeven inzichten in genregulatie kenmerken (zie 1 voor een overzicht), zoals cel-cel variaties 2,3, bacteriële persister vorming 4, transcriptie initiatie en rek 5, transcriptie barsten 6,7, cel-cyclus afhankelijkheid 8,9 en erfelijkheid 10. Echter, OBTaining kwaliteit eencellige fluorescentie tijdreeks zijn aanzienlijke technische uitdagingen in kweken van een monolaag van cellen in een controleerbare omgeving en in high-throughput kwantificering van de fluorescentie verkregen films. Hier beschrijven we een procedure voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van S. cerevisiae zonder vereiste ervaring in celkweekinrichting vervaardiging of in software ontwikkeling (figuur 1). Ten eerste, we detail een voorbeeld protocol om fluorescentie tijdreeksen films te genereren voor gist uiten van een of meer fluorescerende reporters. Hoewel op maat microfluïdische cultuur kamers zijn gebouwd en met succes ingezet eerder 11-13, maken we gebruik van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische apparaat uit CellAsic (Hayward, CA). Het systeem beperkt cellen monolaag groei en maakt continue controle van de perfusie milieu. De microscopie protocol presenteren we een eenvoudig middel om tl verkrijgenlingen films van gist, maar elke gewijzigde experimentele protocol (een aangepaste cultuur apparaat, alternatieve media omstandigheden, enz.) gelijkblijvende fluorescentie film gegevens van enkele gistcellen kunnen worden vervangen. Vervolgens schetsen we de analyse van de films met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI)-based softwarepakket in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), ook wel de GUI voor snelle analyse van Fluorescentie Time Series (enten), om tijdreeksen gegevens te extraheren voor enkele cellen. Enten heeft dezelfde eigenschappen als de veelzijdige, open-source softwarepakket Cell-ID 14 in het segmenteren en het bijhouden van cellen en in het extraheren van fluorescentie-intensiteit en geometrische informatie. Echter, enten geeft belangrijke aanvullende functies. Ten eerste, het biedt gemakkelijke interactieve bewerking van segmentatie en het bijhouden van de resultaten om de nauwkeurigheid van gegevens, in plaats van alleen statistische venstertijd van uitschieters regio sporen na analyse controleren. Bovendien geldt voor de analyse automatically aanwijzen afkomst en cel-cyclus bezienswaardigheden van gist. Bepalen wanneer moeder en dochter delen om twee onafhankelijke cellen regio&#39;s te vormen is cruciaal voor het bepalen van whole cell (moeder met inbegrip van eventuele aangesloten bud) metingen in de hele celcyclus 8. De suite bestaat uit drie modules om deze taken te volbrengen. De eerste segmenten cel regio&#39;s op basis van het contrast tussen gericht en ongericht helderveld afbeeldingen en kan de gebruiker segmentatie parameters te definiëren en visueel te testen. De tweede tracks (. Met Blair en Dufresne&#39;s MATLAB implementatie van de Crocker et al. IDL routine, beschikbaar op: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) en meet cel regio&#39;s door de tijd; wijst lineages automatisch, en maakt visuele inspectie en foutcorrectie. Een eenvoudige plotten GUI is opgenomen om een ​​query eencellige eigenschappen. De derde module toeschrijft bud opkomst en divisie times en voert gehele cellen tijdreeksgegevens en hun eerste en tweede afgeleiden (zoals besproken in 9). De analyse module voert de data als een ruimte gescheiden tekstbestand voor verdere studie in de statistische software van keuze. Dus het pakket kan de gebruiker hoge kwaliteit tijdreeksen extraheren via een grafische interface. We hebben deze methode om real-time transcriptiesnelheden schatten enkele gist cellen als functie van de celcyclus 9. Hoewel de modules zijn geoptimaliseerd voor gist, de parameters of, indien nodig, de vrij beschikbare code worden aangepast voor andere organismen en beeldtypen. Segmentatie, tracking, en het geslacht toewijzing algoritmen kan specifiek type beeldvorming toegewezen en de betreffende organisme. De bestaande algoritmes kan worden vervangen, maar nog steeds de GUI interface die gebruiksvriendelijke visuele controle en correctie van segmentatie en het bijhouden van fouten die steevast bedrijfspensioenvoorziening mogelijk maaktr met elk algoritme.

<table><tbody><tr><td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>Gebruikt voor YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 controller and filter wheels</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64-bits versie kan grotere databestanden beter verwerken dan 32-bits</td></tr></tbody></table>

het verwerven fluorescentie time-lapse films van budding gist en analyseren van single-cell dynamics behulp enten

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescentie time-lapse microscopie is uitgegroeid tot een krachtig instrument in de studie van vele biologische processen op het eencellige niveau. In het bijzonder, films beeltenis van de temporele afhankelijkheid van genexpressie geven inzicht in de dynamiek van de regelgeving, maar er zijn veel technische uitdagingen voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van enkele cellen. We beschrijven hier een eenvoudig protocol met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische cultuur apparaat om dergelijke gegevens te genereren, en een MATLAB-gebaseerde, grafische gebruikersinterface (GUI)-gebaseerde software pakket om de fluorescentie beelden te kwantificeren. De software segmenten en tracks cellen, kan de gebruiker visueel curator fouten in de gegevens, en wijst geslacht en afdeling tijd uitgevoerd. De GUI analyseert verder de tijdreeks whole cell sporen en hun eerste en tweede afgeleiden produceren. Terwijl de software is ontworpen voor S. cerevisiae, moet zijn modulariteit en veelzijdigheid laat het to dienen als een platform voor het bestuderen van andere celtypes met enkele wijzigingen.

Een succes uitgevoerd en geanalyseerd experiment zal vooral continue tijdreeks opleveren voor enkele hele cellen met realistisch toegewezen bud opkomst en verdeeldheid tijden. Als voorbeeld, voerden we het bovenstaande protocol met een haploïde giststam expressie een geïntegreerde kopie van Cerulean fluorescerend eiwit (CFP) aangedreven door de constitutieve ADH1 promoter te zien hoe groei en wereldwijde expressie kunnen op termijn in afzonderlijke cellen (Tabel 4, Y47 ). We liepen de ...

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van fluorescentiemovies van groeiende individuele gistcellen en het extraheren van tijdreeksen van reporterexpressie voor elke cel. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag cellen in een microfluïdische kamer te kweken. De tweede stap is het uitvoeren van time-lapse fluorescentiemicroscopie voor één of meerdere reporters.Vervolgens worden de video's verwerkt met behulp van het softwarepakket graft om cellen in de tijd te volgen en te meten. De laatste stap is het analyseren van de celmetingen en de toewijzing van de cellijn, en het exporteren van de tijdreeksen van de reporterexpressie voor elke volledige cel. Uiteindelijk wordt een ogenblikkelijke transcriptiesnelheid, afgeleid uit de expressietijdreeksen, gebruikt om veranderingen in de transcriptie aan te tonen, zowel gedurende de celcyclus als in reactie op veranderende niveaus van transcriptiefactoren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van genregulatie, zoals de snelheid waarmee verschillende promotoren reageren op de plotselinge toevoeging of verwijdering van een actieve transcriptiefactor. Hoe variabel is deze respons binnen een populatie cellen en hoe beïnvloeden verschillende cellulaire kenmerken, waaronder morfologie en de fase van de celcyclus, deze respons? Bovendien kan deze methode de effecten van opeenvolgende toevoegingen en verwijderingen van een actieve transcriptiefactor op de genexpressie onderzoeken.Bereid gistcellen voor die groeien in een nutriëntenrijke, gestage toestand bij een dichtheid die geschikt is voor laden in het microfluïdische apparaat, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid vervolgens een Y zero four C microfluïdische cultuurplaat van cell ASIC voor door de putjes te spoelen met steriel water naden het verwijderen van de transportoplossing; gebruik het onyx perfusiesysteem om water door putjes één tot en met zes te laten stromen bij 6 PSI gedurende vijf minuten om de kanalen door te spoelen, en laat daarna water stromen vanuit de laadput acht bij 6 PSI gedurende 10 seconden. Verwijder het water uit alle putjes en vervang dit door 250 µL SC-medium in de inlaatputjes één tot en met zes en 50 µL van de bereide celcultuur in de celloading.Afdicht vervolgens de onyx manifold op de plaat en begin met het primen van de kanalen en de kweekkamer door gedurende twee minuten vloeistof vanuit toevoerputjes één tot en met zes te laten stromen bij 6 PSI. Volg dit op door gedurende ten minste vijf minuten vloeistof enkel vanuit het toevoerputje met het startmedium te laten stromen. Laat dit bij 6 PSI continu doorstromen tot de microscopiestap. Plak de plaat met tape aan de objecttafelbevestiging om verschuivingen tijdens het experiment te voorkomen en zo de celtracking tijdens de data-analyse te verbeteren. Nadat de microscoop is voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, worden enkele druppels immersievloeistof op het objectief aangebracht en het microfluïdische apparaat stevig gemonteerd.Focus in de tafel van de omgekeerde microscoop op het linkerderde deel van de eerste kweekkamer met behulp van een van de ingebouwde positiemarkeringen. Zet de stroom vanuit de mediuminlaatput en de stroom vanuit cellaadput acht uit bij 6 PSI in pulsen van vijf seconden. Verplaats de tafel om in de kweekkamer naar cellen te zoeken.Verhoog de doorstroomtijd en druk bij het laden totdat de gewenste celdichtheid is bereikt, maar voorkom overbelasting en verstopping van de meest linkse barrière waar het verse medium de kamer binnenstroomt. Begin met het laten stromen vanuit de mediuminlaatput die het startmedium bevat bij zes PSI. In Metamorph of andere software voor microscopieautomatisering en -besturing.Stel een multidimensionale acquisitie in om meerdere beelden op meerdere objecttafelposities over een bepaalde tijd op te nemen. Stel het aantal tijdspunten en het interval daartussen in. Selecteer vervolgens verschillende objecttafelposities met ongeveer 10 cellen per positie.Stel de acquisitie zo in dat het programma bij elke positie van de tafel en elk tijdspunt scherpstelt op het brightfield-transmissiebeeld met behulp van de ingebouwde autofocusmethode van MetaMorph, waarbij de autofocus aan het begin van elke tafelpositie wordt uitgevoerd als een custom written journal. De positie zorgt voor een grotere controle over de focusnauwkeurigheid. Stel het programma daarnaast zo in dat het brightfield-beeld wordt opgenomen op plus één micron ten opzichte van het brandvlak en dat er een out-of-focus brightfield-beeld wordt opgenomen op minus vier microns ten opzichte van het brandvlak.Gebruik op maat geschreven journals om de focus indien nodig tussen beelden aan te passen. Stel vervolgens het programma in. Neem voor elke fluorescente reporter één grijswaardenbeeld op in het brandvlak.Gebruik instellingen die zijn geoptimaliseerd voor snelle acquisitie met minimale fotobleking. Stel het flowprogramma voor het experiment in de Onyx-besturingssoftware samen. Start vervolgens gelijktijdig het acquisitieprogramma in Metamorph en het flowprogramma in de Onyx-besturingssoftware.Voer het format data M-bestand uit in MATLAB om de grafische gebruikersinterface (GUI) voor de data-invoer te openen. Specificeer bovenaan de map met de afbeeldingsbestanden of blader ernaartoe om de datadirectory in te stellen, en gebruik vervolgens de GUI om de datatypen en afbeeldingsbestanden aan te geven die tijdens het experiment zijn geregistreerd. Selecteer vervolgens de segmentatieparameters zoals beschreven in het tekstprotocol.Het kiezen van de juiste parameters voor de segmentatie van brightfield-beelden kan moeilijk zijn en heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de resulterende tijdreeksgegevens. We richten ons op het identificeren van alle celgebieden, waarbij de voorkeur wordt gegeven aan oversegmentatie boven ondersegmentatie van gebieden. Tijdens de visuele inspectie van de gegevens kunnen overgesegmenteerde gebieden worden samengevoegd tot volledige celgebieden, maar ondergesegmenteerde gebieden kunnen achteraf niet meer worden gesplitst.Stel de verschillende segmentatieparameters in en test de segmentatiekwaliteit door op test te klikken. Succesvol gesegmenteerde regio's worden groen met magenta randen. Gebruik de schuifregelaar om meerdere tijdspunten in de film te controleren wanneer de segmentatie naar behoren is.Selecteer 'done' om terug te keren naar de segmentatieparameters in de format data gui. Nadat de kleurparameters zijn geselecteerd zoals beschreven in de tekst, druk op de auto threshold-knop om de drempelwaarde automatisch te bepalen. Met behulp van de methode van Tzu worden de gebieden boven de drempelwaarde in de afbeelding gemarkeerd.De drempelwaarde kan handmatig worden aangepast via het bewerkingsveld. Gebruik de schuifbalk om te bevestigen dat de drempelwaarde geschikt is voor alle tijdspunten. Klik op 'done' zodra u tevreden bent.Om de drempelwaarde terug te brengen naar de format data gui, druk op add en segment. Om het kleurenmasker te maken, druk op format data om de beeldbestanden te lezen, de gegevens te verwerken en een dot mat-bestand te maken in de opgegeven map. Dit bestand dient als invoer voor de process time series gui.Voer het proces tijdreeks M-bestand uit in MATLAB om de tracking-GUI te openen. Stel na het openen van de GUI eerst de kamerhoogte in. Dit geeft de hoogte aan van de kamer waarin de cellen zijn gevangen.Dit wordt gebruikt als beperking bij het benaderen van het celvolume als een 3D-ellipsoïde op basis van de hoofdas en de nevenas van het celgebied. Stel vervolgens de micrometers per pixel in. Dit is de conversiefactor die wordt gebruikt om de pixel-tot-micrometer-afstand in de beelden te kalibreren, zodat de dwarsdoorsnede en het volume respectievelijk kunnen worden gekalibreerd in vierkante micrometers en kubieke micrometers.Gebruik vervolgens het filterpaneel om de minimum- en maximumparameters in te stellen om ongewenste regio's in het masker weg te filteren. 'Area' is de oppervlakte van de regio in pixels. 'ECC' is de excentriciteitsfactor, waarbij een waarde die dichter bij nul ligt wijst op een meer cirkelvormige vorm.En SF is de vormfactor; hoe dichter de waarde bij één ligt, hoe cirkelvormiger het object. Klik op de afbeeldingen in het invoer-uitvoerpaneel en select la selecteer het gewenste .dot.mat-databestand dat is gegenereerd door de format data GUI. Het regio-masker wordt op elk kleurkanaal toegepast en er worden verschillende metingen uitgevoerd. Het databestand wordt vervolgens opgeslagen na het selecteren van de parameter track cells, zoals beschreven in de tekst.Klik op de track-cellen om regio's van het ene frame naar het volgende te volgen met behulp van de regio-OID's om lineages toe te wijzen aan nieuw verschijnende knoppen en om de gegevens op te slaan; pas indien nodig de parameters in de pop-upvensters aan. Lineages worden automatisch toegewezen door de afstanden tussen vermeende knoppen en potentiële moeders in elk frame te minimaliseren.Klik op de knop boven het informatiepaneel van de geselecteerde cel en cureer slecht gesegmenteerde regio's en fouten in ID- of lineage-toewijzingen met behulp van de verschillende gooey-tools of sneltoetsen die in het tekstprotocol worden beschreven om de gegevens correct te cureren. Voeg overgesegmenteerde regio's samen, verwijder alle regio's die niet de gehele cel vatten en zorg ervoor dat moeder-bud-relaties correct zijn toegewezen. Elimineer daarnaast alle groene ID's door regio's samen te voegen.Het id vaststellen, de regio aan een moeder toewijzen, geen moeder toewijzen of de regio verwijderen. Aangezien bud-gegevens tijdens de uiteindelijke analyse aan die van de moeder worden toegevoegd, mag een bud-regio niet worden samengevoegd met de moeder.Inspecteer de gegevens voor elk frame visueel tot aan het laatste tijdstip van belang. Het is niet nodig om de gehele tijdreeks te controleren. Indien de latere frames niet worden gebruikt, zorg er dan voor dat de wijzigingen worden opgeslagen zodra alle celregio's over de relevante tijdsspanne zijn geïnspecteerd, zodat de gegevens voor alle fluorescentiekanalen en de manier waarop deze in de loop van de tijd veranderen, klaar zijn voor output.Voer de tijdreeksanalyse uit om de tijdreeks voor hele cellen over de tijd te analyseren. Bereken informatie over de celcyclus en bepaal de afgeleiden. Er opent een venster waarin de relevante metingen kunnen worden geselecteerd en de analyseparameters kunnen worden ingevoerd. Voer het laatste tijdstip in dat in de GUI is gecureerd.De standaardparameters voor afvlakking en celcyclusassignatie werken goed voor haploïde en diploïde stammen die in intervallen van vijf minuten zijn afgebeeld, maar deze moeten mogelijk worden aangepast voor optimale resultaten. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, selecteer dan 'analyze' om tijdreeksgegevens van individuele cellen te exporteren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Een succesvol uitgevoerd en geanalyseerd experiment zal voornamelijk continue tijdreeksen opleveren voor individuele hele cellen met realistisch toegewezen ontstaan- en delingstijden voor een haploïde giststam die een geïntegreerde kopie van een fluorescent eiwit of CFP tot expressie brengt, onder controle van de constitutieve DH1-promotor. Metingen van de hele cel over tijd werden verkregen uit de tijdreeksanalyse.De brightfield-beelden tonen de gesegmenteerde moedercel in het blauw en de knoppen in het groen. Met de aaneengesloten gehele cel in het rood omlijnd, wordt een afhankelijkheid van de celcyclus zichtbaar voor zowel het volume als de expressie. Hier tonen de gearceerde gebieden wanneer de cel zich in SG2 M bevindt en een knop heeft; het knoppen begint bij de overgang van G1 naar S, van wit naar grijs.Schaduwvorming en celdeling treden op bij de overgang van M naar G1, waarbij de schaduw na knopvorming verandert van grijs naar wit. Het totale gecombineerde volume neemt sneller toe dan voorheen, maar de emergentie terwijl de proteïneconcentratie of gemiddelde intensiteit licht afneemt. De stijging in het gecombineerde geïntegreerde proteïne versnelt na knopvorming in vergelijking met alleen de regio van de moedercel.Deze resultaten tonen het belang aan van het correct meenemen van de bijdrage van knoppen bij de meting van de gehele cel en benadrukken de noodzaak voor een juiste toewijzing van de tijdstippen van knopvorming en deling. De gedifferentieerde tijdreeks kan worden gebruikt om een onmiddellijk relatief mRNA-niveau en een transcriptiesnelheid te berekenen, die beide ook toenemen na het knoppen om een stabiele tijd te genereren. Afgeleiden van tijdreeksen van metingen zijn daarnaast gunstig voor kinetische studies met gebruik van het schakelbare expressiesysteem dat in het tekstprotocol wordt beschreven.Een tijdreeksanalyse laat zien wanneer de transcriptiefactor in de nucleus gelokaliseerd is en wanneer het doelgen start en stopt. De transcriptie die hier wordt getoond, bestaat uit micrografen van de vier aangegeven acquisitiekanalen voor een cel met een schakelbare YFP-gefuseerde PHO vier Tet R transactivator. De transactivator lokaliseert naar de RFP-gemarkeerde nucleus als reactie op een laag fosfaatgehalte en stimuleert de expressie van een zeven X Tet O promoter CFP-reporter.De afgeleide transcriptiesnelheid verandert gemiddeld en op enkelcelniveau naar gelang de lokalisatie. Na deze procedure kunnen andere analyses van de multidimensionale tijdreeksgegevens op enkelcelniveau worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, waaronder hoe de expressie in de loop van de tijd binnen de populatie varieert en of de effecten van extrinsieke fluctuaties over meerdere generaties worden overgeërfd.Veranderen de kinetieken van genactivatie bij reactivatie? Speelt de celcyclus een rol en zijn er veel andere vragen die antwoorden vereisen over de groei van genexpressie en de afstammingsbanen van individuele cellen.

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer hoe je fluorescentie-tijdsverloopfilms maakt van gistcellen en enkelceldynamiek analyseert met behulp van microfluïdische kamers en geautomatiseerde software. Deze methode helpt onderzoekers transcriptieveranderingen gedurende de celcyclus bestuderen.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Meer video's verkennen