Name: Tissue Engineering van een Menselijke 3D In vitro Tumor Test System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer hoe je een 3D-tumortestsystem bouwt met primaire menselijke cellen op een gedecellulariseerd biologisch BioVaSc-scaffold. Deze methode simuleert in vivo-tumoromstandigheden voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) bedanken voor zijn technische ondersteuning aan bioreactoren en de bioreactor incubator ontwikkelen.

1. Decellularisatie van de BioVaSc <ol><li> Spoel het vasculaire systeem van de varkens jejunal segment via gecannuleerd arteriële en het darmlumen met PBS -. Herhaal dit totdat het helemaal schoon is. </li><li> Bereid een diameter van 200 mm glazen bak met 4 adapters en sluit ze via silicium buizen naar de peristaltische pomp (Ismatec). De druk besturingseenheid kan via een druksensor die is verbonden met een steriele wegwerpbare koepel (zie figuur 1). </li><li> Vul het reservoir flessen met decellularisatie (DZ) oplossing en controleer de slangen systeem voor eventuele luchtbellen. </li><li> Sluit het darmlumen met kabelbinders aan de glazen aansluitingen voor luminale flow. Pomp 500 ml DZ oplossing in de rode arteriële (Figuur 1B) van het vasculaire systeem. Onderbreek de pompproces elke 15 min kort om handmatig druk uit het gehele darmkanaal. </li><li> Tijdens de decellularizatiop proces moet de druk van de bufferoplossing tussen 80-100 mm Hg, gemodelleerd naar de natuurlijke bloeddruk. </li><li> Was de BioVaSc met PBS - totdat het vrij is van celrestanten (&quot;geheel wit&quot;). </li><li> Vul het BioVaSc volledig met DZ-oplossing en incubeer onder te duiken in DZ-oplossing gedurende de nacht bij 4 ° C op rockende shaker. </li><li> Herhaal stap 1.6. </li><li> Plaats de BioVaSc in DNase oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C op rockende shaker. </li><li> Verwijder DNase oplossing en spoel af met wasbuffer. </li><li> γ-sterilisatie met 25 kGy </li></ol> 2. De verschillende celtypes 2.1 Isolatie van primaire humane dermale microvasculaire endotheelcellen (MVEC&#39;s) en fibroblasten <ol><li> Snijd huidbiopsie (bij voorkeur preputium) in reepjes van 2-3 mm breed met scalpel en spoel ze 3x met PBS - oplossing. </li><li> Bedek het weefsel met Dispase oplossing en incubeer het voor 16-18 uur bij 4 ° C. </li><li> Aparte epidermis van de dermis met 2 pincet en breng beide afzonderlijk in petrischalen gevuld met PBS +. </li><li> Rinse dermis strips 1x met Versene. </li><li> Voeg 10 ml trypsine / EDTA-oplossing aan de dermis strips en incubeer in de incubator gedurende 40 minuten. </li><li> Stop de enzym reactie onmiddellijk met 1% FCS. </li><li> Transfer huid strips om een ​​petrischaal gevuld met VascuLife en uitkrabben elke strook met de scalpel 8x elke kant, het toevoegen van een beetje druk. </li><li> Breng de geproduceerde celsuspensie via een cel zeef om een ​​centrifugebuis en spoel cel zeef 3x met VascuLife. </li><li> Centrifugeer de buis bij 1200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de cel pellet met VascuLife. </li><li> Om de fibroblasten te isoleren, chop dermis strips in kleine stukjes met behulp van de scalpel. </li><li> Voeg 10 ml collagenase oplossing dermis stukken. </li><li> Incubeer het voor 45 min in de incubator, centrifuge vervolgens en verwijder voorzichtig supernatant. </li><li> Was de pellet 1x met DMEM + 10% FCS +% Penstrep, centrifuge het en verwijder voorzichtig supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in kweekmedium en overbrengen naar een T75 kolf om cellen te groeien van het weefsel. </li></ol> 2.2 tumorcellijn S462 De tumor cellijn S462 (vriendelijk verschaft door Dr Nikola Holtkamp, ​​Charite University Medicine Berlin) werd gegenereerd uit een maligne perifere zenuw schede tumor van een vrouwelijke patiënt met de erfelijke predispositie tumor syndroom neurofibromatose type 1 9. S462 gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FCS. Medium moet worden veranderd om de 2-3 dagen. Een keer per week de cellen moeten worden gesplitst. 3. Tumor Test System: Statische kweekomstandigheden Vergeleken met Dynamic Cultuur In bioreactorsystemen <ol><li> Snijd de buisvormige SIS-Muc open aan een kant en zet het vast tussen twee metalen ringen (cel kronen, 10 mm diameter, zelf constructed). Bedek de SIS-Muc in celcultuurmedium overnachten. </li><li> Zaad geïsoleerde cellen in gedefinieerde aantal cellen (zie hieronder) aan een of beide zijden van het SIS (mono-of co-kweek opstelling). <ol><li> Seed 8000 cellen / cm 2 primaire MVEC&#39;s in een totaal volume van 100 ui op het basolaterale oppervlak van het SIS (ex serosa). De goed 3 uur later vullen met medium tot een cultuur ondergedompeld te garanderen. </li><li> Laat endotheelcellen hechten gedurende 3 dagen. Flip de statische cultuur systeem door 180 ° en overbrengen naar een 12-well plaat. </li><li> Zaad een mengsel van primaire dermale fibroblasten (8000 cellen / cm 2) en tumorcellen (15.000 cellen / cm 2) in een totaal volume van 500 pi op het apicale oppervlak van het SIS (de zijkant van de voormalige lumen). </li><li> Laat cellen om zich te houden gedurende 3 uur en vul het goed met medium (ondergedompeld cultuur, medium: 50% Vasculife + 50% DMEM aangevuld met 10% FCS). </li><li> De tumor testsysteem wordt gekweekt onder statische omstandigheden eent 37 ° C, 5% CO2 in de incubator gedurende 14 extra dagen. Wijzig kweekmedium elke 2-3 dagen. </li></ol></li><li> Voor de dynamische cultuur, bevestig de SIS-Muc tussen twee metalen ringen en zaad primaire MVEC&#39;s zoals beschreven in 3.2.1. Na 3 dagen verwijdert de SIS-Muc van de metalen ringen en steek het membraan in de stroom reactor (zie de figuren 2C en 2D). Breng de primaire dermale fibroblasten en tumorcellen met een injectiespuit en canule op de matrix in de bioreactor, en laat de cellen hechten gedurende 3 uur voor het vullen van het bioreactorsysteem kweekmedium. </li><li> De volgende dag dynamische kweekomstandigheden met een constante mediumstroom (3,8 ml / min, 37 ° C en 5% CO2) kan worden gestart. De dynamische cultuur wordt gedurende 14 dagen, wordt cultuurmedium veranderd na 7 dagen. </li><li> De dynamische test setup is gekweekt in een zelf geconstrueerde incubator die media stroom voorziet door middel van een pomp en de benodigde temperatuur en CO 2 </sub&gt; Content. </li></ol> 4. Karakterisering Methoden voor analyse 4.1 Vaststelling en paraffine-inbedding van de geplaatste collageenmatrix <ol><li> Voor (immuno-) histologische karakteriseringen verwijder het kweekmedium en bevestig het weefsel met 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder 4% paraformaldehyde en breng het SIS van de metalen een weefselverwerkingsproces cassette. Water de weefsel om de resterende fixatief te verwijderen en uitdrogen voor paraffine infiltratie. </li><li> Voordat inbedding in een paraffineblok, snijd de SIS in 2-3 plakjes en leg ze in een paraffine gevulde metalen voet schimmel, zodat de snijvlakken naar beneden wijzen. Voeg de weefselcassette bovenop de matrijs als een drager. </li><li> Snijd 5 micrometer plakjes en drijven ze op een 40 ° C waterbad voor het strekken, dan monteer slides op geschikte glasplaatjes. Ongecoat dia&#39;s worden gebruikt voor H &amp; E vlekken,-polylysine gecoate glaasjes voor immunohistologische kleuring gehechtheid te verbeteren.Laat plakjes drogen. </li><li> Smelt paraffine, verwijderen met xyleen en rehydrateren plakken voor volgende kleuring. </li></ol> 4.2 kleuring <ol><li> De gerehydrateerde plakjes kan worden gekleurd met Hematoxylin / Eosin als een gestandaardiseerd overzicht kleuring. </li><li> Voor immunhistological kleuring, de vaste paraffine en weefselcoupes geïnfiltreerd moet een antigenen ondergaan om antilichamen te herkennen en te binden aan hun specifieke epitopen. Daarom paraffine ontdaan en gerehydrateerd dia&#39;s worden in een stoomkoker gebracht met verwarmde citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 20 minuten. </li><li> Overdracht dia&#39;s te wassen buffer (0,5 M TBS-buffer + 0,5% Tween) en cirkel segmenten met een PAP pen om het gewenste volume voor het kleuren oplossingen minimaliseren. </li><li> Plaats de dia in een vocht kamer. Een specifiek mierikswortelperoxidase gemedieerde visualisatie van antigeen-antilichaam-binding te bereiken, noodzakelijk het endogene peroxidase verzadigd met 3% waterstofperoxide. </li><li> Primaire ANTIBody verdunningen worden toegepast op de schijfjes 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur en voorzichtig afgespoeld met wasbuffer. </li><li> Voor detectie van antigeen-antilichaam binding de UltraVision Quanto Detectiesysteem HRP DAB (Thermo Scientific) wordt volgens het aanbevolen protocol. </li><li> Kernen zijn tegengekleurd met hematoxyline gedurende 1 minuut. </li><li> Dia bevestigd met een waterig medium, gedroogd en gescand met behulp van een omgekeerde microscoop. </li></ol>

<ol><li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li>
<li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li>
<li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularised+human+tissue+models%3A+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li>
<li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLanza%2C+R+%22Principles+of+tissue+engineering%22">Principles of tissue engineering</a>. , 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li>
<li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li>
<li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li>
<li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li>
<li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li>
<li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li>
<li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering%3A+matrix+preparation%2C+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Bij vergelijking van 2D en 3D kweeksystemen in tumoronderzoek, 3D systemen, ondanks de duurdere benadering hebben bewezen de omstandigheden biologische micromilieu beter nabootsen. Het kan worden aangetoond dat sommige tumorcellen groeien in een 3D kweek veel trager dan in een gewone 2D cultuur 12, die in overeenstemming met de situatie in een echte tumor. Bissell en medewerkers toonden in hun werk dat het gedrag van kankerverwekkende borstcellen geeft de in vivo situatie, waaronder celmorfologie en signalering, nauwkeuriger wanneer een 3D-kweek in een matrix biedt cel-ECM interacties. Bovendien benadrukte ze het belang van de extracellulaire omgeving in 3D door aan te tonen dat veranderingen in het milieu interacties leidde tot de terugkeer van de kwaadaardige cellen een normaal fenotype. Daarnaast en vooral, deze resultaten kunnen ook worden bevestigd in in vivo diermodellen 10,11. NHOUD &quot;&gt; De directe vergelijking van in vivo dierproeven en in vitro weefselmodellen openbaart en nadelen van beide systemen. Een voordeel van in vitro modellen toestemming van een veel betere real-time of vaste beeldvormend microscopie. Een beperking is dat ze nabootsen statische of korte termijn omstandigheden, terwijl in vivo systemen vaak vooruitgang. Het huidige gebrek aan vaatstelsel en normale transport van kleine moleculen, gastheer immuunreacties en andere cel-cel interacties zijn verdere nadelen van in vitro modellen 12. Daarom 3D in vitro systemen zoals gepresenteerd in deze studie bieden een veelbelovende aanvulling op dierproeven. Zij bieden een betere vergelijkbaarheid voor het menselijk organisme en dus het minimaliseren van experimentele misinterpretaties. Biomimetic in vivo modelsystemen zullen dus meer relevant om te bestuderen hoe kanker en metastatische verspreiding afhankelijk is geworden op microenvironmental voorwaarden die tumorig regulerenenesis 11. Onze studie toont aan dat de 3D-omgeving die de SIS-Muc leidt tot een tumor-achtig weefsel vorming van cellen, die niet wordt waargenomen in de gemeenschappelijke 2D celkweek (zie figuur 3A). Bovendien is het gebruik van primaire cellen afkomstig van tumor biopsies is een zeer belangrijke stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde, een discipline die zich richt op het identificeren van de beste behandeling, afhankelijk van de individuele behoeften van een patiënt. Integratie van primaire patiënt-specifieke tumorcellen geïsoleerd uit biopsie materiaal zal in vitro testen van therapeutische strategieën. Deze testsystemen maakt het mogelijk om verschillende geneesmiddelen en combinaties daarvan te onderzoeken in een tijd-en kostenbesparende high-throughput screening. Bovendien is de integratie van tumor geassocieerde bindweefselcellen zoals in deze studie is belangrijk voor de individuele benadering, aangezien micro invloeden een tumor tumorprogressie 13 en kunnen blijken als suitable therapeutisch doel. Als alternatief voor een persoonlijke benadering, kunnen onze tumormodel worden gemodificeerd om te dienen als een algemeen tumor testsysteem door vermenging met gevestigde tumorigene cellijnen. Dit is een veelbelovende aanpassing voor fundamenteel onderzoek. Voor beide dopingcontrole zal de aanwezigheid van een vasculaire structuur vereist om de verspreiding en toepassing van therapeutische substanties getest. De SIS-Muc matrix kan de basolaterale zaaien met primaire MVEC voor barrière opname studies, zal het opnieuw plannen van de bewaarde vasculaire structuren van de BioVaSc verdere verbetering van de studie van de drug delivery. Om weefselmodellen maken, kan een 3D biologisch afbreekbare matrix gebruikt als raamwerk voor een co-kweek van verschillende celtypen 14. Het gebruik van dergelijke 3D matrices wordt vaak beperkt door het ontbreken van een functioneel vascularisatie. Dit probleem kan worden opgelost door het gebruik van de BioVaSc, die bewaard bloedvat Str biedtuctures, die kan worden ingezaaid met endotheelcellen. Voorts voorziet de BioVaSc extracellulaire componenten die de hechting van de cellen te waarborgen en weefseldifferentiatie vergemakkelijken. Het maakt het ook de lange-termijn weefsel specifieke functie van bioartificial 3D weefsels 7,8,15. De voorwaarde voor de engineering van functionele vasculaire substituten is het nabootsen van menselijke fysiologische en biomechanische voorwaarden. Daarom bioreactor systemen, die aan deze eisen kunnen implementeren in vitro, zijn van extreem belang voor het creëren van biologische tumor modellen. De combinatie van de BioVaSc de bioreactor technologie en co-kweken van verschillende celtypen is een veelbelovende methode om gevasculariseerde tumor weefsels, die de studie van mechanismen die relevant zijn voor de progressie van kanker, zoals angiogenese en metastase zal genereren. We zien zoals tumor modellen als een veelbelovende aanpak ter aanvulling dierproeven door middel van een gelijkwaardigede humane tumor fysiologie.

Nieuwe geneesmiddelen moeten worden gevalideerd met betrekking tot hun kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid voor toelating op de markt. Tot op heden, dierproeven zijn de standaard methode voor drug het testen en valideren. Vanwege soortspecifieke verschillen dierproeven vaak niet volledig het effect van de verbindingen bij mensen 1 evalueren. Daarom is het belangrijk menselijk weefsel modellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro testen van nieuwe geneesmiddelen en stoffen te verkrijgen. Een van de speerpunten van onze groep is het creëren van in vitro testmodellen met onze biologische gevasculariseerde steiger (BioVaSc) 2,3. De BioVaSc kan worden gebruikt als een statische of dynamische 3D matrixsysteem. Voor statische cultuur, wordt de gedecellulariseerde varkens jejunal segment (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc) geplaatst in een metalen inzetstuk voor cel opnieuw plannen. Verschillende cellen, zoals kanker en endotheliale cellen kunnen worden gekweekt op het schavot. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Voor dynamische cultuur, wordt de BioVaSc een bioreactorsysteem die stroom geldt voor de gehele vaatstelsel of over het oppervlak van de steiger bevestigd. Voor bioreactoren voeren biologische, mechanische of elektrische stimuli die inwerken op de differentiatie of proliferatie van cellen 4. Voor bioreactoren op het gebied van weefselengineering het basisconcept is het simuleren van de omstandigheden in het menselijk lichaam. Waarin worden cellen voorzien natuurlijke omgeving waarin ze kunnen communiceren met elkaar en de omliggende extracellulaire matrix. Voor de productie van in vitro testsystemen of transplantaties, de mogelijkheid om de natuurlijke omgeving van cellen nabootsen met een geschikte draagstructuur en bioreactorsysteem kritisch 5. Daarom moeten complexer en technisch veeleisende apparaten ontwikkeld om deze taken te vervullen 6. Het is verder mogelijk om onze steiger gebruiken voor de opriishment van een gevasculariseerde model vanwege de bewaarde buisvormige structuren, die het voederen slagader, ader, en het verbinden van capillaire bed te nemen. Alle varkens cellen moeten worden verwijderd door chemische, mechanische en enzymatische ontcelling en de steiger-gamma-gesteriliseerd. De herstelde buisvormige vasculaire structuren kunnen vervolgens worden ingezaaid met menselijke microvasculaire endotheelcellen met een recirculatiesysteem perfusie bioreactor 7, waarbij de biomechanische en / of biochemische parameters zoals pH, temperatuur, druk, nutriënt en afvalverwijdering 6 nabootst. De re-endothelialisatie van de buisvormige structuren creëert een menselijke equivalent bloedvat in de collagene steiger 3,7. In de volgende stap, kan het oppervlak van de voormalige lumen (mucosa) worden geënt met primaire humane cellen co-kweken 3,7,8 stellen. In deze studie een 3D tumor testsysteem is opgezet door co-kweken van een tumor cellijn met primaire stromal cellen onder statische en dynamische omstandigheden op de SIS-Muc.

<table><tbody><tr><td>Collagenase-oplossing</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>(500 U/ml)</td></tr><tr><td>Dispase-oplossing</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>(2,0 U/ml)</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg opgelost in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td></tr><tr><td>DZ-oplossing</td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34 g natriumdesoxychelaat, in 1 L ultrapuur water</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>medische druktransducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaal muis anti-humaan Von Willebrand-factor</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>Clone F8/86 0,12 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>muis monoklonaal anti-humaan p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>Clone DO-7 klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>peristaltiekpomp</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steriele wegwerpkoepel</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine / EDTA-oplossing</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-Mv)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering van een menselijke 3d<em&gt; in vitro</em&gt; tumor test system

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Kanker is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Huidige therapeutische strategieën worden voornamelijk ontwikkeld in 2D cultuur systemen, die onvoldoende weerspiegelen fysiologische condities in vivo. Biologische 3D matrices cellen een omgeving waarin cellen kunnen zelf organiseren, zodat de studie van weefselorganisatie en celdifferentiatie. Dergelijke draagstructuren kunnen worden geënt met een mengsel van verschillende celtypes om direct 3D cel-cel-interacties te bestuderen. Om het 3D complexiteit van kanker tumoren na te bootsen, heeft onze groep een 3D in vitro tumor testsysteem ontwikkeld. Onze 3D weefsel testsysteem modellen de in vivo situatie van maligne perifere zenuw schede tumoren (MPNSTs), die we gelegd met onze gedecellulariseerde varkens jejunal segment afgeleid biologische gevasculariseerde steiger (BioVaSc). In ons voorbeeld hebben we een gemodificeerde reseeded BioVaSc matrix met primaire fibroblasten, microvasculaire endotheelcellen (MVEC&#39;s) en de S462 tumorcellijn. Voor statische cultuur, wordt de vasculaire structuur van de BioVaSc verwijderd en de resterende steiger opengesneden aan een zijde (dunne darm Submucosa SIS-Muc). De resulterende matrix wordt vervolgens gefixeerd tussen twee metalen ringen (cel kronen). Een andere optie is om de cel kweek geplaatste SIS-Muc in een stroom bioreactor systeem dat de cellen bloot schuifspanning. Hier wordt de bioreactor verbonden met een peristaltische pomp in een zelf vervaardigd incubator. Een computer regelt de arteriële zuurstof en voedingsstoffen leveren via parameters zoals bloeddruk, temperatuur en debiet. Deze opstelling zorgt voor een dynamische cultuur met ofwel druk geregeld pulserende of constante stroom. In deze studie konden wij met succes zowel statische als dynamische 3D kweeksysteem voor MPNSTs stellen. De mogelijkheid om tumoren modelleren in een meer natuurlijke 3D-omgeving zal de ontdekking, het testen en valideren van de staattoekomstige geneesmiddelen in een mens-achtig model.

Zoals getoond in figuur 1B, we ontceld varkens jejunum segment (ongeveer 2 meter lang en 20 mm in diameter) met bewaarde buisvormige structuren van het capillaire netwerk. Na chemische, enzymatische en mechanische decellularization, verkregen wij een collageen I / III scaffold, die kan worden gebruikt voor 3D celcultuur. Een Feulgen test werd uitgevoerd om de zuiverheid (geen DNA resten) van de matrix (gegevens niet getoond) tonen. Figuren 2A en 2B tonen de statische kweek van SIS-Muc beveiligd door cel kronen. We vaste SIS-Muc in een in-huis ontworpen bioreactor (figuur 2C) voor dynamische cultuur. Figuur 2D illustreert de gesimuleerde dynamische stroom door de kamer van de bioreactor. De bioreactor wordt in een zelf vervaardigd incubator systeem verbonden met een peristaltische pomp. Deze opstelling laat een dynamische cultuur met ofwel druk geregeld pulserende stroom of c<html> onstant stroom. Figuur 3 geeft een overzicht van de statisch gekweekte S462 tumorcellijn in 2D monocultuur (figuur 3A) en in 3D coculture (figuren 3B-3D). Figuur 3B toont de drievoudige cultuur van tumorcellen S462 en primaire fibroblasten aan de apicale kant van SIS -Muc (voormalig binnenlumen kant) en MVEC aan de basolaterale zijde (voormalige serosa kant). De identificatie van verschillende celtypes kan door kleuring celtype specifieke markers, zoals von Willebrand factor MVEC (figuur 3C) label. De p53-positieve cellen S462 kan worden onderscheiden van de p53-negatieve primaire fibroblasten (Figuur 3D) en de 3D ​​verdeling van cellen kunnen worden geanalyseerd. Figuur 4 toont kleuringen gelijk aan figuur 3 van de dynamisch gekweekte drievoudige cultuur. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Decellularisatie set-up. (A) Bioreactor en pomp set-up voor decellularizing de BioVaSc, gecontroleerd door een PC. (B) gedecellulariseerde BioVaSc in glazen bak. Het lumen en de arteriële inlaat verbonden met de adapters. . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figuur 2. Over mening van de andere cultuur set-ups. (A) CAD doorsnede van statische cultuur systeem in microtiterputje plaat, (B) metalen inzetstukken voor statische cultuur, (C) medium stromingssimulatie (snelheidsveld [m / s]) voor dynamische cultuur van de bovenste deksel van de stroom bioreactor , (D) stroom bioreactor voor dynamische cultuur verbonden met de peristaltische pomp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figuur 3. Overzicht van de immunohistologische karakterisering van de statische 3D tumor model. (A) Hematoxylin vlek van het statisch gekweekte 2D mono cultuur van S462 cellen op een Permanox glijbaan, (B) H &amp; E kleuring van het statisch gekweekte 3D triple cultuur, pijlen geven endotheelcellen, (C) immunohistologische kleuring voor von Willebrand factor, (D ) immunohistologische kleuring voor p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figuur 4. Overzicht van de immunohistologische karakterisering van de dynamische 3D-tumor model. (A) H &amp; E kleuring van de dynamisch gekweekte 3D triple cultuur, pijlen geven endotheelcellen, (B) immunohistologische kleuring voor von Willebrand factor, (C) immunohistologische kleuring voor p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van een 3D-tumortestsysteem met primaire cellen op een gedecellulariseerd biologisch steunstructuur. Dit wordt bereikt door eerst de steunstructuur voor te bereidenen middels een decellularisatieproces waarbij een porciën aortasegment wordt gepompt met een decellularisatie-oplossing. De tweede stap is het isoleren van primaire menselijke cellen uit een biopsie van een patiënt met behulp van een standaard isolatieprotocol.Stel vervolgens het tumor-testsysteem op door de tubulaire submucosa van de dunne darm aan één zijde open te snijden, deze te fixeren tussen twee metalen ringen en te bezaaien met tumorcellen en bijbehorende stromale cellen in gedefinieerde celdichtheden. De laatste stap is het kweken van het met cellen beladen construct in een geschikte opstelling onder statische of dynamische omstandigheden. Ten slotte wordt immunohistochemische microscopie gebruikt om de kenmerken van de tumorgroei te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals TT-tumortestsystemen, is dat het met deze methode mogelijk is om 3D-weefselmodellen te creëren die de in vivo-omstandigheden van een tumor nauwkeuriger simuleren dan gangbare 2D-modellen. Het voordeel van de dynamische kweek is dat celspecifieke kenmerken behouden blijven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het veld van de tumornbiologie, zoals de wijze waarop kankercellen cel-cel- en cel-matrixinteracties vormen in een 3D-omgeving, wat zal helpen bij het verhelderen van kankergerelateerde processen zoals tumorprogressie en metastase.Het biologische gevasculariseerde steunstructuur (scaffold) of biova dat in dit tumortestsysteem wordt gebruikt, is afgeleid van een varkensjejunumsegment. Spoel het vasculaire systeem van het varkensjejunumsegment en het darmlumen met PBS via gecannuleerde arteriële toegang. Herhaal dit proces totdat het volledig schoon is.Bereid een glazen tank met een diameter van 200 millimeter voor met vier adapters en verbind deze via siliconen slangen met de peristaltische pomp. De drukregelingseenheid kan worden gemonitord via een druksensor die is verbonden met een steriele wegwerpkoepel. Vul de reservoirflessen met decellularisatie- of DZ-oplossing.Controleer het buizensysteem op eventuele luchtbellen. Verbind het lumen van de darm met kabelbinders aan de glazen connectoren voor de luminale stroom. Pomp 500 milliliter DZ-oplossing in de rode arteriële toegang van het vasculair systeem.Onderbreek het pompproces elke 15 minuten kortstondig om het volledige lumen van de darm handmatig leeg te drukken. Het is belangrijk om de druk van de bufferoplossing tijdens het decellularisatieproces te bewaken. De druk moet tussen de 80 en 100 millimeter kwik liggen, gemodelleerd naar de natuurlijke bloeddruk.Was de biova met PBS totdat deze vrij is van celresten en de vasculaire structuur volledig wit van kleur is. Begin deze procedure door het huidbiopsaat met een scalpel in stroken van twee tot drie millimeter breed te snijden en deze drie keer te spoelen met PBS-oplossing. Scheid na incubatie van het weefsel in disbe-oplossing de epidermis van de dermis met behulp van twee pincetten.Breng beide afzonderlijk over in Petrischalen gevuld met PBS om primaire dermale microvasculaire endotheelcellen of MV eecs te isoleren. Spoel de dermisstrips één keer met ene, voeg 10 milliliters trips in EDTA-oplossing toe aan de dermisstrips en incubeer bij 37 °C gedurende 40 minuten. Stop de enzymreactie met 1% FCS en breng de huidstrips over naar een Petrischaal gevuld met vascu life. Schraap elke strip acht keer aan beide zijden uit met het scalpel, waarbij een lichte druk wordt uitgeoefend om een celsuspensie te verkrijgen.Centrifugeer vervolgens de celsuspensie en resuspendeer de celpellet in VascuLife. Om fibroblasten te isoleren, worden de dermisstrips eerst met een scalpel in kleine stukjes gesneden.Breng de dermisstukken over naar een Falcon-buis en voeg 10 milliliters collagenase-oplossing toe, geïncubeerd bij 37 degrees Celsius gedurende 45 minuten. Centrifugeer vervolgens de oplossing en verwijder voorzichtig het supernatant. Was het pellet met DMEM plus 10%FCS plus 1%pen strep.Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant, resuspendeer de pellet in kweekmedium en breng dit over naar een T 75-kweekfles om de cellen uit het weefsel te laten uitgroeien; incubeer onder statische omstandigheden. Om eerst het tumortestsysteem op te zetten, snijd dan de tubulaire submucosa van de dunne darm of SIS muc, aan één zijde open en fixeer deze tussen twee metalen ringen. Deze zelfgeconstrueerde celkruinen hebben een diameter van 10 millimeter.Bedek de SIS mu in celkweekmedium gedurende de nacht; zaai de volgende dag primaire MVE CS op het basale laterale oppervlak van de SIS, de voormalige CI. Incubeer bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende drie uur. Vul na drie uur de put met medium om een ondergedompelde kweek te waarborgen en plaats deze terug in de incubator. Laat de endotheelcellen drie dagen hechten; na drie dagen.Draai het statische culturesysteem 180 graden en breng het over naar een plaat met 12 wells. Plaats vervolgens een mengsel van primaire dermale fibroblasten en tumorcellen op het apicale oppervlak van de SIS, aan de zijde van het voormalige lumen.Laat de cellen drie uur lang hechten. Vul de put met medium om de cultuur onder te dompelen; houd het tumortestsysteem onder statische condities bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende nog eens 14 dagen, waarbij het cultuurmedium elke twee tot drie dagen wordt ververst voor de dynamische cultuur. Fixeer de SIS mu tussen twee metalen ringen en zaai primaire MV eecs zoals eerder gedemonstreerd.Verwijder na drie dagen de SIS mu uit de metalen ringen en breng het membraan met een spuit en canule in de flowreactor aan. Breng de primaire dermale fibroblasten en tumorcellen aan op de matrix in de bioreactor. Laat de cellen drie uur hechten voordat het bioreactorsysteem de volgende dag met kweekmedium wordt gevuld; plaats de bioreactor vervolgens in een zelfgeconstrueerd incubatiesysteem en sluit deze aan op een peristaltische pomp.Deze opstelling maakt dynamische cultuur mogelijk met ofwel drukgecontroleerde pulserende stroming of een constante stroming. In dit experiment wordt een constante mediumstroom van 3,8 milliliters per minuut gebruikt. Handhaaf de dynamische cultuur gedurende 14 dagen en vervang het cultuurmedium na zeven dagen.Na voltooiing van de experimenten worden de weefsels gefixeerd, in paraffine ingebed, gekleurd en vervolgens gefotografeerd met een omgekeerde microscoop. Hier worden representatieve resultaten getoond. Paneel A geeft een overzicht van de statisch gekweekte S 4 62 tumorcellijn in 2D-monocultuur, gekleurd met hematoxyline en eosine.De 3D co-cultuur wordt getoond in panelen B, C en D. Deze H&amp;E-gekleurde afbeelding toont de triple cultuur van tumorcellen S 4 62 en primaire fibroblasten op de apicale zijde van de SIS MU en MVEC. Aan de basolaterale zijde markeren de pijlen de endotheelcellen. Verschillende celtypen kunnen worden geïdentificeerd door celtypspecifieke markers te kleuren, zoals von Willebrand-factor om MVEC te labelen, getoond in paneel C, en P 53, getoond in paneel D. De P 53-positieve S 4 62-cellen kunnen worden onderscheiden van de P 53-negatieve primaire fibroblasten, en de 3D-distributie van cellen kan op dezelfde manier worden geanalyseerd.Verschillende celtypen kunnen worden geïdentificeerd in het dynamisch gekweekte triple-cultuurpaneel; paneel A is een H&amp;E-gekleurde afbeelding waarbij de pijlen de endotheelcellen markeren. Paneel B toont immunohistochemische kleuring voor von Willebrand-factor, en paneel C toont kleuring voor P53. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals medicamententests, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het vinden van nieuwe kankertherapieën of de analyse van belangrijke signaleringsroutes bij tumorgenese.Daarnaast kunnen primaire cellen worden gebruikt om de beste gepersonaliseerde behandeling voor individuele patiënten te bepalen.

tissue-engineering-of-a-human-3d-in-vitro-tumor-test-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we generate microtumors from patient-derived tumor cells using 3D human biogel. These microtumors closely resemble the in vivo tumor microenvironment and serve as potential platforms for drug testing.

Generation of Microtumors: An In Vitro Culture Technique to Culture 3D Microtumors to Analyze Response to Drug Treatment

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

Van patiënten afgeleide xenografts van glioblastoma multiforme kunnen worden geminiaturiseerd tot levende microtumoren met behulp van een 3D-menselijke biogel-kweeksysteem. Deze in vivo-achtige 3D-tumortest is geschikt voor het testen van de reactie op geneesmiddelen en moleculair profileren, inclusief kinoomanalyse.

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Het doel van dit protocol is om borsteptheelcellen rechtstreeks bioprinten als meercellige sferoïden op voorgevormde endotheelnetwerken om snel 3D-borst-endotheel co-cultuurmodellen te creëren die kunnen worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningsstudies.

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Leer hoe je een 3D-tumortestsystem bouwt met primaire menselijke cellen op een gedecellulariseerd biologisch BioVaSc-scaffold. Deze methode simuleert in vivo-tumoromstandigheden voor kankeronderzoek.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D

Meer video's verkennen