Name: Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer embryonale ventriculaire endotheelcellen isoleren uit transgene muizen voor cardiovasculair onderzoek. Deze methode gebruikt antilichaam-gekoppelde magnetische scheiding voor zuivere celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Andrea Portbury bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript, de microscoop Dienst Laboratorium van UNC voor hulp bij de time-lapse imaging, en de NIH (subsidie ​​# R01HL061656) voor financiële steun.

1. Bereid antilichaam-geconjugeerd Beads <ol><li> Een dag voor dissectie, combineren het antilichaam van keuze van de geschikte Dynabeads (bijvoorbeeld rat IgG Dynabeads een antilichaam opgewekt in rat, 4 x 10 8 kralen / ml) volgens de instructies van de fabrikant. Voor de BD rat anti-CD31-antilichaam (0,5 ug / ul, gebruikt om endotheelcellen te isoleren), 3 gl antilichaam wordt toegevoegd per 25 ul kralen, voor een uiteindelijke concentratie van 1,5 ug anti-CD31 antilichaam en 1 x 10 7 kralen / 25 pi buffer. </li><li> Incubeer kralen en antilichaam overnacht bij 4 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiden van de Collageen Plate <ol><li> Geïsoleerde cellen vormen tubuli sneller wanneer gegroeid op een collageengel in tegenstelling tot slechts een collageen-gecoate plaat. Daarom zijn collageen gels die de avond voor de dissectie, zoals beschreven in 6. Op ijs in een weefselkweek kap, combineren de volgende reagentia (genoeg voor 19 putten): 206,4 pi steriel H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 ul collageen type I (4,08 mg / ml), 38,4 gl 10x M199 en 1,15 pl 5 M NaOH. </li><li> Pipetteer 20 ul van dit collageen gel in de putjes van een 384-well weefselkweek platen. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 80 ul DMEM aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Verwijder het kweekmedium en herhaal twee keer meer. </li><li> Na de laatste spoeling, voeg 80 ul 10% FBS / DMEM aan elk putje en incubeer overnacht bij 37 ° C. Verwijder het kweekmedium voorafgaand aan het toevoegen van de geïsoleerde cellen. </li></ol> 3. Accijnzen en Digest het Hart <ol><li> Euthanaseren een timed-zwangere muis op de gewenste embryonale dag met behulp van een goedgekeurde euthanasie techniek. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. </li><li> Met de muis in rugligging, royaal spuiten de ventrale zijde van de vrouw met 70% ethanol voorafgaand aandissectie. Met behulp van een tang om de onderbuik huid en spieren weg te tillen van de inwendige organen, opengesneden lagere buikholte van het vrouwtje om de interne organen te visualiseren. </li><li> Houd de cervix met een tang, knip voorzichtig caudaal van de forceps en beginnen heffen de uterushoorn van de buikholte. Terwijl het opheffen van de baarmoeder hoorn, weggesneden eventuele bindweefsel dat de hoorn op zijn plaats houdt. Om te eindigen uitsnijden van de baarmoeder hoorn, snijd de kruising van de baarmoeder hoorn met de eileider naar de baarmoeder hoorn bevrijden. </li><li> Plaats de baarmoeder hoorn in een petrischaal met koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spoelen indien nodig. Knip de baarmoedertak via de middellijn naar de bijgevoegde embryonale zakken bloot. </li><li> Knip een embryonale zak op de kruising van de placenta en het embryo te voorkomen dat per ongeluk het snijden van het embryo en halen een embryo. Plaats de embryo in een tweede petrischaal met koude PBS. Terug de petrischaal met de baarmoedertak om ijs. </li><li> Decapitate de embryo toegang tot de borstwand verbeteren. Als genotypering is nodig, snijd de staart om het te verwijderen en op te slaan in een Eppendorf buis op ijs geplaatst. </li><li> Met het embryo op zijn rug, opengesneden de borstwand naar het hart en de longen te visualiseren. Om te vermijden dat het hart, maak een verticale snede langs de kant van de ribbenkast, in de buurt van een voorpoot, gevolgd door een horizontale snede over de bodem van de ribben, dan, trek de borstwand omhoog en uit de weg. Omhoog door ongeveer embryonale dag 13,5, de borstwand is transparant, hulp in de visualisatie. </li><li> Til het hart met behulp van een tang en snijd onder de schepen. Vervolgens snijd boven de grote vaten naar het hart te bevrijden. Indien de longvaten niet worden gesneden, kunnen de longen worden verwijderd met het hart. Zo verwijdert vreemde weefsels, zoals de longen, indien nodig. </li><li> Scheiden en gooi de atria en de grote vaten van de ventrikels. Met een schaar, gehakt de ventrikels in kleine stukjes (ca. 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) en plaats in ongeveer 500 pi collagenase (1 mg / ml in steriele PBS). Blijf monsters op ijs totdat alle ventrikels zijn gehakt en geplaatst in collagenase. </li><li> Herhaal de vorige stappen totdat de ventrikels zijn uitgesneden uit alle embryo&#39;s, het verzamelen van elk hart in een aparte Eppendorf buis. Als alle embryo&#39;s hebben hetzelfde genotype, kan harten worden samengevoegd in een enkele Eppendorf buis. Het aantal verwerkte in een keer monsters kan worden beperkt op basis van de magneet gebruikt voor isolatie, de DynaMag (123-21D) die hier kan maximaal 16 Eppendorf buizen. </li><li> Plaats gehakt ventrikels bij 37 ° C gedurende 45 minuten schommelen. Elke 15 min, verwijder voorzichtig de monsters en pipet op en neer om mechanisch scheiden van de cellen. </li></ol> 4. Het isoleren van de endotheelcellen <ol><li> Voorbij het ventrikel-collagenase oplossing door een 70 um filter om resterende groepjes van cellen te verwijderen. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 minuten. Afdankende supernatant vervangen ongeveer 200 pi 10% FBS in DMEM en pipet op en neer om de cellen dissociëren. </li><li> Eenmaal herhalen de vorige stap. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 minuten na de tweede 10% FBS / DMEM wassen. Resuspendeer de cellen in 50 ui 10% FBS / DMEM. </li><li> Tijdens de laatste centrifugatie stap bereiden de kralen. <ol><li> Plaats de Eppendorf buis met het antilichaam en kralen op een magneet gedurende 1 minuut. </li><li> Met de buis op zijn plaats op de magneet, de bovenstaande vloeistof. Haal de buis uit de magneet en voeg ongeveer 100 ul 10% FBS / DMEM. </li><li> Plaats de buis op de magneet gedurende 1 minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof en opnieuw wassen met 10% FBS / DMEM. Herhalen voor een totaal van 3 wasbehandelingen. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de antilichaam-geconjugeerde kralen in 10% FBS / DMEM (5 ul per monster). </li></ol></li><li> Aan elk celmonster, voeg 5 ul van het antilichaam-geconjugeerde kralen. Plaats de kraal-celsuspensies bij 4 ° C met schudden for 30 min. </li><li> In een laminaire stroming kap, plaats de Eppendorf buizen met cellen en antilichaam-geconjugeerde kralen op de magneet gedurende 1 minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof, verwijder de buizen van de magneet, en was met ongeveer 100 ul 10% FBS / DMEM. Herhaal dit voor 5 wasbeurten. </li><li> Na de laatste wasbeurt, plaatst de buizen op de magneet gedurende 1 min., de bovenstaande vloeistof, en verwijder de buizen van de magneet. Voeg ongeveer 100 ul DMEM. </li><li> Plaats de buizen op de magneet gedurende 1 min., de bovenstaande vloeistof, en verwijder de buizen van de magneet. 100-200 voeg ul voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA. Incubeer de monsters bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats de buizen op de magneet gedurende 2 minuten. Overdracht van de cel-bevattende supernatant voorzichtig om verse Eppendorf buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. </li><li> Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 80-100 pi groeimedium en de plaat in een 96 - of 384-goed behandeld kweekschaal, afhankelijk van de verwachte opbrengst(Circa 450-600 cellen van de ventrikels van E14.5-E16.5 embryo&#39;s). Voor endotheelcellen, gebruiken endothelial growth kweekmedium (hieronder gedefinieerd). </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
<li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16%28INK4a%29+during+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endothelium%3A+an+emphasis+on+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li>
<li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li>
<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Werken met primaire embryonale cellen stelt nieuwe experimenten aan te pakken in vitro kritische stappen van de ontwikkeling. De isolatie moet niet triviaal. Kritische stappen voor het isoleren van elk type cellen onder meer in dat de cellen goed worden gescheiden op collagenase spijsvertering en dan dat ze goed zijn opgehangen tijdens het wassen stappen. Mechanische dissectie door pipetteren enorm helpt scheiden de cellen tijdens de collagenase stap, en het filteren stap verwijdert groepjes van cellen. Deze st...

De komst van onsterfelijk gemaakte cellijnen heeft een revolutie fundamentele celbiologie 1. De momenteel beschikbare cellijnen zijn afgeleid van een groot aantal organen en omvatten alle belangrijke celtypes. Echter, gevestigde cellijnen hebben een aantal beperkingen. Werkwijze immortalisatie verandert duidelijk het gedrag van de cellen, in het bijzonder met betrekking tot levensduur en proliferatie, maar kan ook invloed op de expressie van onverwachte eiwitten, zoals cytoskeleteiwitten 2. Bovendien, hoewel vele verschillende cellijnen zijn er aanzienlijke verschillen tussen zelfs een celtype van een compleet organisme. Endotheelcellen in bepaalde show diverse gedragingen op basis van of ze online slagaders of aders en wat voor soort stroom is aanwezig in het vat 3. Nog dringender vanuit een ontwikkelingsperspectief is echter dat de meeste van de beschikbare cellijnen zijn afgeleid van volwassen weefsel (zie bijvoorbeeld tHij collectie verkrijgbaar via ATCC). Deze volwassen cellijnen waarschijnlijk niet herhalen de dynamiek van de embryonale voorlopers. De snel veranderende spatiotemporele genexpressiepatronen waargenomen tijdens de ontwikkeling suggereren ook dat een endotheelcel van het ene orgaan op een bepaald ontwikkelingsstadium kan niet op dezelfde manier gedragen als een endotheel cel die hetzelfde orgaan in een ander ontwikkelingsstadium. Als alternatief voor het gebruik commercieel beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, primaire cellen kunnen worden geïsoleerd uit het specifieke weefsel van belang. Onder de voordelen van deze techniek, kunnen deze primaire cellen worden geïsoleerd uit een specifiek orgaan of deel van een orgaan op specifieke ontwikkelingsfase. Verder kunnen deze primaire cellen worden geïsoleerd uit de grote verscheidenheid aan beschikbare transgene dieren, waarbij de in vitro studie van gen knockout en knock-in terwijl het vermijden andere problemen zoals transfectie efficiëntie. Niet verrassend, veeltechnieken zijn gepubliceerd die uitleggen hoe je isoleren specifieke celtypen 4,5. In het algemeen omvatten het verzamelen van deze technieken het gebied van belang, het dissociëren van de cellen, tagging het specifieke celtype van belang, en het isoleren van deze cellen voor verdere analyse. Een vroege embryonale populatie van coronaire endotheelcellen bestuderen we verkleind een eerder gepubliceerde techniek 4 voor gebruik met een kleinere orgel. Met deze verkleinde procedure, kunnen we isoleren de coronaire endotheelcellen van het embryonale hart op specifieke embryonale stadia. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in de traditionele endotheliale assays, zoals migratie analyse. Tot de vroege embryonale cellijnen steeds vaker, het werken met de primaire cellen is een onschatbare techniek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-pregnant mice</td><td></td><td></td><td>Te worden gedissecteerd in de embryonale fase van belang</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel groeimedium</td><td>(gemaakt in lab zoals beschreven in de notities)</td><td></td><td>DMEM bevattend 20% FBS, 5 &mu;M &#946;-mercapt&#8211;thanol, 50 &mu;g/ml ECG, en 1x penicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Biomedical Technologies, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-well cultuurplaat</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Plaat werd voorbereid met een dunne collageen gel, zoals beschreven in 6; werkoppervlak 10 mm2</td></tr><tr><td>Collageen type I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Gebruikt zoals aangegeven in 13 </td></tr><tr><td colspan="4">UITRUSTING</td></tr><tr><td>Stereoscopische microscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur incubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Tabel centrifuge</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Celcultuur is sterk verbeterd ons vermogen om individuele populaties van cellen te analyseren onder talloze kweekomstandigheden. Terwijl geïmmortaliseerde cellijnen bieden aanzienlijke voordelen voor hun gebruiksgemak, deze cellijnen zijn beschikbaar voor alle mogelijke celtypes. Door het isoleren van primaire cellen uit een bepaalde regio van belang zijn uit een transgene muis, kan genuanceerder studies worden uitgevoerd. De basistechniek behelst het ontleden van de orgaan-of gedeeltelijke orgaan van belang (bijvoorbeeld het hart of een bepaalde regio van het hart) en dissociëren het orgel om enkele cellen. Deze cellen worden vervolgens geïncubeerd met magnetische beads geconjugeerd met een antilichaam dat het celtype herkent. De cellen plaats kan vervolgens worden geïsoleerd met behulp van een magneet met een korte trypsine incubatie dissociëren van de cellen van de bolletjes. De geïsoleerde cellen kunnen daarna worden gekweekt en geanalyseerd zoals gewenst. Deze techniek werd oorspronkelijk ontworpen voor volwassen muis orgels maar kan eenvoudig naar beneden worden geschaald voor gebruik met embryonale organen, zoals hierin aangetoond. Omdat ons belang in de coronaire vasculatuur, wilden wij deze populatie van cellen te bestuderen tijdens specifieke embryonale stadia. Dus het oorspronkelijke protocol moesten worden aangepast verenigbaar met de kleine omvang van de embryonale ventrikels en de lage potentiële opbrengst van endotheelcellen in deze ontwikkelingsstadia zijn. Gebruik makend van deze verkleinde aanpak, hebben we coronaire plexus remodeling beoordeeld in transgene embryonale ventriculaire endotheelcellen.

Met behulp van een endotheel-specifieke antilichaam dat CD31 herkent, werden endotheelcellen geïsoleerd uit de ventrikels van embryonale (E) 13.5 (figuur 1A) en 18,5 (figuren 1B-1D) embryo. Wanneer gekweekt op een onbehandelde cultuur schotel, deze cellen blijven afgerond en zou een geplaveide patroon te vormen indien in de buurt samenvloeiing (Figuur 1A). Verdun collageen is ook gebruikt voor het bekleden van de putjes, en terwijl de endotheliale cellen aan houden <str...

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo&#39;s op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van embryonale ventriculaire endotheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst een embryo te verkrijgen voor dissectie. Vervolgens wordt het hart uitgesneden.De atria worden verwijderd en de fijngehakte ventrikels worden overgebracht naar een collageenoplossing. De suspensie van enkelvoudige cellen wordt vervolgens geïncubeerd met een antilichaam dat de endotheelcellen herkent. Ten slotte wordt een magneet gebruikt om de antilichaamgebonden endotheelcellen te isoleren.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de vorming van endotheelketens aantonen via lichtveldmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de cardiovasculaire ontwikkeling, zoals welke factoren de migratie van het coronaire endotheel bevorderen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het gedrag van endotheelcellen, kan zij ook worden toegepast op andere celtypen, zoals myocyten en fibroblasten. Op de dag vóór de dissectie combineert u in een weefselkweekkast het gekozen antilichaam met de juiste dyna beads, volgens de instructies van de fabrikant voor het hier gebruikte rat anti CD 31 antilichaam.Voeg 3 µL antilichaam toe aan 25 µL beads voor een eindconcentratie van 1,5 µg per 10⁷ beads. Incubeer de beads overnacht in het antilichaam bij 4 °C. Bereid in een weefselkweekkast op ijs collageengels voor de snelle tubulusvorming van geïsoleerde cellen. Combineer collageen type I, steriel water, 10X M199 en 5 M natriumhydroxide. Pipetteer volgens het tekstprotocol 20 µL van de collageengel in de wells van een 384-wells weefselkweekplaat.Plaats de plaat gedurende 30 minuten in een weefselkweekincubator bij 37 °C. Voeg 80 µL DMM toe aan elke well en incubeer 15 minuten bij 37 °C. Verwijder het kweekmedium en herhaal de wasstap nog twee keer; voeg na de laatste spoeling 80 µL 10% FBS DM toe aan elke well en incubeer dit overnight bij 37 °C.Na het euthanaseren van een tijdgebonden zwangere muis op de gewenste embryonale dag, wordt de uterine hoorn volgens het tekstprotocol met een goedgekeurde techniek verwijderd en in een Petrischaal met XPBS geplaatst om deze te spoelen. Zodra de embryonale zakken zijn blootgesteld via een midline-incisie op het kruispunt van de placenta en een embryo, wordt een embryonale zak opengesneden om het embryo te onttrekken.Plaats het embryo in een tweede Petrischaal met koude PBS en leg de uterine horn terug op ijs om de toegang tot de borstwand te verbeteren om het embryo te decapiteren. Indien er genotypering plaatsvindt, knip dan de staart af en bewaar deze in een buisje op ijs. Snijd terwijl het embryo op zijn rug ligt.Open de borstkas om het hart en de longen zichtbaar te maken om te voorkomen dat het hart wordt doorgesneden. Maak een verticale snede langs de zijkant van de ribbenkast nabij een ledemaat, gevolgd door een horizontale snede over de onderkant van de ribben. Trek vervolgens de borstwand voorzichtig omhoog en opzij tot ongeveer embryonale dag 13.5.De borstwand is transparant, wat de visualisatie vergemakkelijkt. Til het hart voorzichtig op met een pincet en knip de vaten eronder door. Indien gewenst kan het hart worden overgebracht naar een schoon schaaltje om het hart te scheiden van de longen door boven de grote vaten door te knippen.Scheid vervolgens de atria en de grote vaten van de ventrikels en gooi deze weg. Hak de ventrikels daarna met een schaar in kleine stukjes en plaats ze in ongeveer 500 microliters collagenase op ijs. Exciteer en verwerk de ventrikels van de overige embryo's, waarbij elk hart in een aparte buis wordt verzameld.Plaats de fijngehakte ventrikels bij 37 °C met schuddende bewegingen gedurende 45 minuten. Verwijder elke 15 minuten voorzichtig de monsters en pipetteer deze op en neer om de cellen mechanisch te dissociëren. Haal na de incubatie de collagenase-oplossing van de ventrikels door een 70 µm filter om resterende celklonten te verwijderen, centrifugeer de cellen bij 400 G gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en vervang dit door ongeveer 200 µL 10% FBS in DMEM. Pipetteer op en neer om de cellen opnieuw te suspenderen, centrifugeer de cellen opnieuw en voer vervolgens een tweede wasbeurt en centrifugatie uit. Suspendeer de cellen tot slot opnieuw in 50 µL 10% FBS in DMEM.Bereid vervolgens de beads voor door de buis met antilichaam en beads gedurende één minuut op een magneet te plaatsen en het supernatant af te zuigen. Haal de buis daarna van de magneet en voeg ongeveer 100 µL 10% FBS in dmm toe. Plaats de buis opnieuw één minuut op de magneet en verwijder vervolgens het supernatant.Herhaal het wassen in totaal drie keer na de laatste wasbeurt. Resuspendeer de antilichaam-geconjugeerde beads in 10% FBS in DMM bij elk celmonster en voeg vijf µL van de antilichaam-geconjugeerde beads toe. Plaats de bead-cel-suspensies gedurende 30 minuten bij vier °C onder schudden in een laminaire flowkast, plaats de monsters gedurende één minuut op de magneet en aspireer het supernatant.Verwijder de buisjes uit de magneet en was deze met ongeveer 100 µL 10% FPS en dm. Herhaal dit voor een totaal van vijf wasbeurten na de laatste wasstap. Suspendeer de beads in ongeveer 100 µL DMEM.Plaats de buisjes gedurende één minuut op de magneet. Verwijder het medium en voeg vervolgens 100 tot 200 µL voorverwarmde 0,25%trypsine in EDTA toe; incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 37 °C en 5% CO2. Plaats de buisjes gedurende twee minuten op de magneet.Breng vervolgens het supernatant dat de cellen bevat zorgvuldig over naar nieuwe buisjes en centrifugeer deze vijf minuten bij 400 G. Resuspendeer de cellen tenslotte, na het verwijderen van het supernatant, in 80 tot 100 µL endotheliaal groeimedium en zaai deze uit in een behandelde kweekplaat met 96 of 384 wells, afhankelijk van de verwachte opbrengst. Elk paar ventrikels van embryo's van E 14.5 tot E 16.5 levert gewoonlijk 450 tot 600 cellen op, zoals hier aangetoond met een endotheel-specifiek antilichaam dat CD 31 herkent. Endotheelcellen werden geïsoleerd uit de ventrikels van embryo's van dag E 13.5.Wanneer ze worden gekweekt op een onbehandelde kweekschaal, blijven deze cellen rond en vormen ze een kasseipatroon wanneer ze bijna confluent zijn. Hoewel de cellen hechten aan platen die zijn gecoat met verdund collageen, vormen deze cellen, geïsoleerd uit ventricels van E 18.5, minder ketens dan wanneer ze op een collageengel worden gecoat. Daarnaast vormen de cellen sneller cel-celinteracties en ketens op de collageengel vergeleken met de collageen-gecoate plaat, wat dient als verificatie van hun identiteit.De cellen in deze figuur vertonen een positieve kleuring voor de endotheliale marker ISO-selectine. Daarnaast, zoals hier getoond, vertoonden endotheliale cellen geïsoleerd uit E 18.5 ventrikels een positieve kleuring voor de endotheliale markers PAM en flick one. Deze figuur toont endotheliale cellen die zijn geïsoleerd uit de ventrikels van een E 14.5 embryo en zijn gelabeld met de endothelspecifieke kleurstof cyto.16 geïsoleerde cellen overleven tot één week in kweek, maar zijn resistent tegen ionisatie en zijn daarom het meest geschikt voor terminale experimenten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer drie en een halve uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere assays, zoals buisvormingsassays en transwell-migratieassays, worden uitgevoerd om te bepalen hoe deze geïsoleerde cellen in vitro zich gedragen.

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video protocol illustreert de isolatie en de cultuur van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) van menselijke navelstreng. Eenmaal geïsoleerd deze cellen kunnen worden gebruikt voor in-vitro angiogenese assays, zoals de Optimized fibrinegel Bead Assay ook aangetoond door de Hughes lab.

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen...

Isolatie en Cultuur van Aviaire Embryonic Valvulaire Progenitor Cellen

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

De mogelijkheid om endotheelcellen van hartkleppen (VEC's) te isoleren, is van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van klepontwikkeling, onderhoud en ziekte.  Hier beschrijven we de isolatie van VEC's van embryonale en volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van FACS, wat studies mogelijk maakt om de bijdrage van VEC's in ontwikkelings- en ziekteprocessen te bepalen.

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

We presenteren een protocol voor de isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen uit rattenharten door sequentiële weefselvertering in een spijsverteringsbuffer, celverzameling uit terugkerende centrifugecycli en celzuivering met behulp van antiratten-CD31 microbeads.

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.

Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters

Leer embryonale ventriculaire endotheelcellen isoleren uit transgene muizen voor cardiovasculair onderzoek. Deze methode gebruikt antilichaam-gekoppelde magnetische scheiding voor zuivere celpopulaties.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Meer video's verkennen