Name: Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer een semi-intacte preparatie van muis vestibulair sensorisch epitheel voor elektrofysiologie en twee-foton microscopie. Deze methode behoudt fysiologische omstandigheden voor onderzoek naar haarcelmembraaneigenschappen en calciumsignalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit werk werd geleverd door een Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation Project subsidie ​​aan R. Lim en AJ Kamp.

1. Dieren <ol><li> Muizen werden verkregen van de Australische Knaagdieren Centre (ARC, Perth, Australië) en hield aan de Universiteit van Sydney Bosch Animal Facility op een normale 12-uur licht / donker cyclus met het milieu verrijking. Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Universiteit van Sydney Animal Ethics Committee. </li><li> Mannelijke en vrouwelijke muizen (C57/Bl6) werden gebruikt voor alle experimenten aangezien deze stam wordt gebruikt als achtergrond voor genetische manipulatie, en gelijkwaardige wildtype 8-9 kan worden beschouwd. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding <ol><li> Bereid 300 ml van een glycerol-based kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bestaande uit (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucose, 250 glycerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 1,2 MgCl2, CaCl2 en 2.5. Voorafgaand aan de toevoeging van CaCl2, gas de oplossing met carbogeen (95% O2 en 5% CO2) om vast apH van 7,4 en voorkomen dat calcium neerslag (troebeling). Bevries de oplossing in een -80 ° C vriezer gedurende 45 min zodat een ijs slurrie wordt gevormd. </li><li> Diep verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australië) via een intraperitoneale injectie. </li><li> Zodra achterste ledematen snuifje reflexen zijn afwezig decapitate muizen met scherp roestvrij stalen schaar en maak een sagittale incisie in de huid met behulp van een scheermesje (afgerond # 22) om de schedel bloot te leggen. Op dit punt en het hele stappen 2,3-2,8 de neurocranium, hersenen, en de onderliggende vestibulum zo koel mogelijk door regelmatige toepassing van ijskoude ACSF over het weefsel moeten worden gehouden. </li><li> Met behulp van de puntige arm van standaard patroon schaar (FST, North Vancouver, Canada) maakt een kleine incisie in de schedel bij Lambda en snijd langs de pijlnaad. Zorg ervoor dat de hersenen niet &quot;gesleept&quot; door de schaarblad tijdens deze stap. </li><li> Zorgvuldig verwijderen van de pariëtale botten weg lateraal en de occipitale bot posteriorly behulp van ondiepe bocht pearson rongeurs (FST). </li><li> Een kleine roestvrijstalen spatel wordt vervolgens gebruikt om de hersenen til van het oppervlak van de middelste en achterste craniale fossae, en de blootgestelde vestibulocochlea zenuw (CNVIII) snijden halverwege tussen het binnenoor en de hersenstam met een paar fijne iris schaar. Snijden deze zenuw minimaliseert onnodige spanning op axonen van de primaire afferenten en hun connecties met haarcellen. </li><li> Na doorsnijding van GN VIII de hersenen wordt verwijderd in toto. </li><li> Het vestibulaire labyrint is nu duidelijk zichtbaar in het midden craniale fossa, met het slakkenhuis wijzen anteromedially. Rongeur weerszijden van de vestibulaire labyrint voordat zachtjes weg te snijden door het vastgrijpen van de voorste halfronde gracht en lateraal trekken. </li><li> Dompel de weggesneden labyrinten (figuur 1) in een dissectie schotel met de ijskoude, voortdurend vergast ACSF in paragraaf 2.1 beschreven. Onder een stereomicroscoop, houdt het labyrint tede bodem van de schotel door het vastgrijpen van de cochlea. Gebruik fijn pincet om weg te krassen op het bot bovenop de voorste halfronde gracht ampul. Zodra een klein gaatje in het bot wordt bereikt begint te flick het bot weg van de ampul. Voorzichtigheid is geboden niet aan de tang duwen door het bot, want dit kan schade aan de onderliggende membraneuze labyrint en sensorische epitheel veroorzaken. Ga door met deze procedure totdat zowel de voorste en de aangrenzende horizontale halfronde membraneuze leidingen en ampullen worden blootgesteld (Figuur 2). </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Figuur 1. De geïsoleerde muis vestibulaire labyrint. A. Linkerpaneel) Schematische weergave van de geïsoleerde muis vestibulaire labyrint. Belangrijke referentiepunten voor de toegang tot de vestibulaire sensorische epitheel, het slakkenhuis, anterior, en horizontale halfcirkelvormige kanalen zijn labeLED. Sterretjes geven de halfronde gracht ampul met daarin de vestibulaire sensorische epitheel. B. Rechter paneel) Photomicrograph van de geïsoleerde vestibulaire labyrint van een 1-maand-oude muis. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Figuur 2. Blootstelling van de membraneuze vestibulaire labyrint. Het bot bovenop de voorste en horizontale halfcirkelvormige kanaal ampullen zijn gekrast weg naar de zwart / bruin-gespikkelde membraneuze ampullen en bijbehorende ampullaire zenuwen (CNVIII) te onthullen. Het schema in het onderste paneel geeft de structuren in het gemarkeerde gebied van de microfoto toont en de relatie van de booggang afvoersystemen naar ampullen en CNVIII. <ol start="10"><li> Met behulp van fijne tang, til de ampullen en de bijbehorende utricle weg van het benige labyrint, ervoor te zorgen dat de centrale regio van de ampullen (containing de sensorische epitheel) niet wordt beschadigd. In sommige gevallen moet het proximale deel van de halfronde membraneuze kanaal te snijden met een schaar om de iris ampullen vrij uit het bot. </li><li> Breng de triade met de twee ampullen en utricle in een petrischaal gevuld met Leibovitz L-15 kweekmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Gebruik een glasvezel naar &quot;backlight&quot; het weefsel. Dit maakt duidelijke visualisatie van de crista met de sensorische epitheel binnen de ampullen. </li><li> Maak voorzichtig een incisie in de gespikkelde &quot;dak&quot; van de utricle met de fijne iris schaar. Ga door met deze incisie door het dak van de voorste en vervolgens de horizontale ampullen. Maak de insnijding zo dicht bij de rand van het sensorische epitheel mogelijk zonder in aanraking te brengen (Figuur 3A). Zorg ervoor dat er geen stukjes membraan bovenop de sensorische epitheel (figuur 3B) </li><li> Breng de geïsoleerde semi intact voorbereiding op een klein glass-bodem opname kamer gevuld met L-15 media. Verzwaren van de bereiding met behulp van een raster van fijne nylon vezels bevestigd aan een afgeplatte U-vormige platina draad (Figuur 3B). Idealiter zou de vezels van het rooster niet bedekken de sensorische epitheel, maar in sommige gevallen meer stabiel moet een enkele vezel doorsnijden het sensorische epithelium misschien voorkeur. </li></ol><img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Figuur 3. De semi-geïsoleerde intacte voorbereiding van het vestibulaire sensorische epithelium. A. Schematische weergave van de semi-intacte voorbereiding en elektrodenconfiguratie. De ampul bovenop de crista heeft &quot;de dak&quot; aan het oppervlak van het sensorische epitheel (groen) blootgesteld geweest. B. Microfoto van de semi-intacte &quot;triade&quot; preparaat met de voorste (ac) en horizontale (hc) crista (utricle verduisterd wordenachterpoten ac). Let op de nylonvezels wordt bij het bevestigen aan de basis van de opname kamer. Schaalbalk:. 100 micrometer C. Een registratie-elektrode geplaatst op individuele vestibulaire haar cel. Schaalbalk: 15 micrometer. 3. Elektrofysiologie <ol><li> Perfuseren de semi-intacte voorbereiding met continu zuurstof L-15 medium. Het medium bevat een pH indicator (fenolrood) en de kleur van het medium in de opnames worden gecontroleerd. De pH met zuurstof moet 7,3-7,4 en overeenkomen met een rode kleur. </li><li> Bereid opname pipetten van 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilicaatglas met een tweestaps protocol (warmte stap 1: 72, en warmte stap 2: 50) op een micropipet trekker (Narishige, Japan, model PP-830) te komen tot een uiteindelijke impedantie van 3-4 MQ. </li><li> Vul de schacht van de pipet met 3-4 mm van kalium-fluoride gebaseerde interne oplossing bevattende (in mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glucose, 2 en Na-ATP, pH 7,4 met KOH. </li><li> Wikkel de schacht van de pipet 2-3 keer en zo ver tot de top mogelijk met een dunne strook van parafilm op de elektrode isoleert en vermindering pipet capaciteit. </li><li> Plaats de pipet over de sensorische epitheel onder lage vermogen vergroting (5X) op een rechtopstaande microscoop (Olympus BX51). Schakel over naar een hoog vermogen (40x) en individuele vestibulaire haarcellen met een bijgevoegd CCD-camera te visualiseren. </li><li> Positie pipet op het membraan van een gevisualiseerd haarcel (figuur 3C) met een micromanipulator (Sutter Instruments, California, USA). Zodra een gigaohm afdichting wordt bereikt, breken de celmembraan met een kleine hoeveelheid negatieve druk uitgeoefend via een aanzuigopening van de pipet houder. </li><li> Voeg whole-cell voltage clamp middels standaardtechnieken 8-9. </li></ol> 4. Twee-foton microscopie <ol><li> Bereid een 0,9% zoutoplossing met 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium zout, Invitrogen, Duitsland). </li><li> Hoewel nog steeds onder water, plaats de &quot;de-dak&quot; semi-intacte triade voorbereiding op een klein stukje filtreerpapier (4x4 mm, 0,8 micrometer dik; Millipore, Duitsland) ervoor te zorgen dat de sensorische epitheel is vrij van boven. </li><li> Breng het filtreerpapier en voorbereiding op de zoutoplossing behandeld base platina-elektrode (7 ui) van een electroporator bestaande uit de combinatie van een pulsgenerator en een breedbandige versterker en deksel met een verdere 5 ui 5 mM oplossing van de synthetische calcium indicatorkleurstof Oregon Green 488 BAPTA-1 (Figuur 4). </li></ol><img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Figuur 4. Bulk elektroporatie. A. schematisch weergegeven dwarsdoorsnede van elektroporatie configuratie. De semi-intacte preparaat (*) is geplaatst op een stuk filtreerpapier gedompeld in calcium dye (Oregon Green 488 BAPTA-1) en stroom aangelegd tussen 2 platina elektroden. Aangepast van Briggman en Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Breng de bovenste platina-elektrode parallel met de basis-elektrode op een afstand van ongeveer 2 mm, voorzichtig de oriëntatie van het preparaat niet te verstoren bij contact met de Oregon Green 488 BAPTA-1 oplossing wordt bereid. </li><li> Passeren een korte stroomstoot over de voorbereiding (Parameters voor de huidige, 13 V, 10 msec pulsbreedte, 1 Hz, 10 blokvormige pulsen) 10-11. </li><li> Op de bodem van een glazen bodem opname kamer gevuld met L-15 medium, zet een klein beetje siliconenolie en plaats de semi-intacte voorbereiding op het, zorgt op de sensorische epitheel is vrij van boven. Om stabiliteit in het hele beeldvorming zorgen, vervang dan de nylon raster over het preparaat zoals hierboven beschreven (zie punt 2.13). </li><li> Met behulp van de twee-foton microscoop maakt optische opnames van spontanetane calcium activiteit in het sensorische epitheel (Figuur 7) met standaard beeldvormingsprotocollen 10-11. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De mechanismen die ten grondslag liggen aan onze evenwichtsgevoel hebben weinig aandacht gekregen in vergelijking met andere sensorische systemen, zoals de visuele en auditieve systemen. Van de studies die veranderingen in vestibulaire of balans functie hebben onderzocht, de meeste zijn gericht op gedragsmaatregelen waaronder de vestibulo-oculaire reflex, met onvolledige kennis van de fundamentele bouwstenen van de balans-de vestibulaire haarcellen zelf. De studies die hebben zich geconcentreerd op de haarcelle...

Ondanks de belangrijke bijdrage van het evenwichtsorgaan aan ons dagelijks leven, een duidelijk begrip van de processen die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen achteruitgang van vestibulaire functie met de leeftijd blijven ongrijpbaar. Een reden voor dit gebrek aan kennis is dat daling van vestibulaire functie is vrijwel uitsluitend werd onderzocht met behulp van gedrags-assays, waaronder de vestibulo-oculaire reflex (VOR), een nauwkeurige indicator van extrinsieke vestibulaire functie, maar biedt beperkte inzicht in de veranderingen van de intrinsieke componenten . Dit is een belangrijke belemmering voor ons begrip van vestibulaire haar cel functie in gezondheid, ziekte of veroudering. Hoewel er veel studies van individuele vestibulaire haarcellen zijn, is een ernstige tekortkoming is de afhankelijkheid van acute haarcel preparaten die haarcellen en zelfs kelk afferente terminals uit hun normale omgeving worden verwijderd door mechanische en / of enzymatische behandeling. Dergelijke benaderingen onvermijdelijkebly verstoren de delicate microarchitectuur tussen haar cel en kelk, en haar cel en ondersteunende cel. Met de ontwikkeling van semi-intacte preparaten 1-5 en een geïsoleerde muis labyrint bereiding 6, is er nu een mogelijkheid om de verschillende vormen van synaptische communicatie bestuderen onder omstandigheden die sterker lijken op die in vivo. Inderdaad, Lim et al.. (2011) toonde duidelijke verschillen in gehele cellen stromen opgenomen met acuut geïsoleerde type I vestibulaire haarcellen vergelijking met die welke bleven ingebed in de neuroepithelium. Concreet wordt gedacht aan kalium ophopen in de intercellulaire ruimte, tussen de haren cel en kelk afferente en aanzienlijk veranderen haar cel respons 7. Dit soort informatie zou onmogelijk te verkrijgen zonder dat de semi-intacte voorbereiding van de vestibulaire sensorische epitheel hier beschreven zijn. We tonen de semi-intacte voorbereiding van de muis crista 3, En tonen representatieve resultaten van whole-cell patch elektrofysiologie, en twee-foton calcium beeldvorming.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF Forceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH A-D converter</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>multiclamp amplifier</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition software (electrophysiology)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td><td>Max Planck innovation</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

een geÃ ¯ soleerde semi-intacte voorbereiding van de muis vestibulaire sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Inzicht vestibulaire haarcellen functioneren onder normale omstandigheden, of hoe trauma, ziekte en veroudering deze te verstoren is een essentiële stap in de ontwikkeling van preventieve benaderingen en / of nieuwe therapeutische strategieën. Toch hebben de meeste studies kijken naar abnormale vestibulaire functie niet op cellulair niveau geweest, maar vooral gericht op gedrags-assays van vestibulaire disfunctie, zoals gang analyses en vestibulo-oculaire reflex prestaties. Hoewel dit werk heeft waardevolle gegevens over wat er gebeurt als er iets misgaat opgeleverd, is weinig informatie die verkregen wordt met betrekking tot de onderliggende oorzaken van disfunctioneren. Van de studies die zich richten op de cellulaire en subcellulaire processen die vestibulaire functie ten grondslag liggen, de meeste hebben zich op acuut geïsoleerd haarcellen, verstoken van hun synaptische verbindingen en ondersteunende cel milieu. Daarom is een grote technische uitdaging toegang tot de uiterst gevoelig vestibulaire haarcellen geweest in een prepreiding, dat is tenminste verstoord, fysiologisch. Hier laten we zien een semi-intacte voorbereiding van de muis vestibulaire sensorische epitheel dat de lokale micro-omgeving behoudt waaronder haarcel / primaire afferente complexen.

De elektrofysiologische eigenschappen van vestibulaire haarcellen afhankelijk complex microarchitectuur waarin ze ingebed 7. Figuur 5 toont dat de semi-intacte vestibulaire epitheel preparaat kan worden gebruikt om onderscheid tussen type I haarcellen (figuur 5A), type II haarcellen (figuur 5B) en de kelk primaire afferente (figuur 5C) gebaseerd op eigenschappen gehele cel geleidingen. Deze kenmerken zijn een uitgesproken &quot;sag&quot; tijd...

Analyse van vestibulaire haar celfunctie wordt bemoeilijkt door hun locatie diep in het moeilijkste deel van de schedel, de petrous temporale bot. Meest functionele haarcellen studies hebben acuut gebruikt geïsoleerde haarcellen. Hier beschrijven we een semi-intacte bereiding van muis vestibulaire epitheel voor elektrofysiologische en twee-foton microscopie studies.

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Het algemene doel van deze procedure is om een nagenoeg normale preparatie van het vestibulaire sensorische epitheel van de muis te verkrijgen, die gebruikt kan worden om de fundamentele cellulaire en subcellulaire processen van vestibulaire haarcellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het benige vestibulaire labyrint uit de schedelholte te isoleren. De tweede stap is om het benige labyrint voorzichtig weg te krabben met fijne pincetten om het onderliggende vliezige labyrint bloot te leggen voordat dit volledig uit de benige omhulling wordt verwijderd.Vervolgens wordt het vestibulaire sensorische epitheel blootgesteld door het bovenliggende membraan weg te knippen met fijne irisscharen. De laatste stap is het monteren van de semi-intacte preparatie van het sensorische epitheel op een kamer met een glazen bodem en het stabiliseren hiervan met een verzwaard nylon net. Ten slotte worden patchclamp-elektrofysiologie en tweefotonmicroscopie gebruikt om respectievelijk de intrinsieke membraaneigenschappen en het calciumsignaleringsprofiel te karakteriseren van elk type vestibulaire haarcel en/of primaire afferent.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, waaronder preparaten van geïsoleerde haarcellen, zijn dat we in staat zijn de rangschikking van de haarcellen en hun primaire afferente neuronen in omstandigheden die zo dicht mogelijk bij de normale situatie liggen te behouden. Dit betekent dat we metingen kunnen verrichten onder nagenoeg fysiologische omstandigheden en dat we deze metingen gelijktijdig kunnen uitvoeren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel omdat de dissectie zeer moeilijk aan te leren is, voornamelijk omdat het vestibulaire apparaat diep in het slaapbeen van de schedel is ingebed en omdat het sensorische epitheel zelf zeer klein is en gemakkelijk beschadigd raakt tijdens de dissectie.Stefano DeMarco, een collega die in mijn laboratorium werkt, zal de electroporatie en de tweefotonprocedures demonstreren. Nadat een C 57 black six muis volgens de lokale institutionele en overheidsrichtlijnen diep is geanestheseerd en onthoofd, en de schedel is blootgelegd, wordt er een kleine incisie in de schedel gemaakt bij Lambda en wordt er langs de sagittale naad gesneden. Zorg ervoor dat het brein niet wordt meegesleurd door het schaarblad.Breng tijdens deze stap ijskoud A CSF aan op de hersenen om het weefsel te koelen en pel vervolgens voorzichtig de pariëtale beenderen zijdelings en het occipitale bot posterieur af met ondiepe Pearson-instrumenten; breng opnieuw ijskoud A CSF aan. Gebruik daarna een kleine roestvrijstalen spatel om de hersenen voorzichtig op te tillen van het oppervlak van de middelste en posterieure schedelput. Het vestibulaire labyrint is nu duidelijk zichtbaar in de middelste schedelput, met de cochlea in beeld.Voeg mediaal ijskoude A CSF toe en spoel beide zijden van het vestibulaire labyrint. Exciteer vervolgens voorzichtig het vestibulaire labyrint door het voorste halfcirkelvormige kanaal vast te pakken en dit lateraal weg te trekken. Dompel de geëxciteerde labyrinten onder in een dissectieschaal met ijskoude vloeistof.Continu an gegasst A CSF geplaatst onder een stereomicroscoop. Dit diagram toont het uitgesneden labyrint in detail. Pak vervolgens, terwijl u onder de stereomicroscoop werkt, de cochlea vast met fijne pincetten en houd het labyrint tegen de bodem van de schaal.Gebruik een tweede pincet om het bot boven de ampulla van het voorste halvcirkelvormige kanaal weg te schrapen. Zodra er een klein gaatje in het bot is gemaakt, kan het bot voorzichtig van de ampulla worden weggetikt. Let erop dat u het pincet niet door het bot duwt, omdat dit schade kan toebrengen aan het onderliggende membraanvormige labyrint en het sensorische epitheel.Zet deze procedure voort totdat zowel de anterieure als de aangrenzende horizontale halvcirkelvormige membranen, gangen en puli zijn blootgelegd, zoals hier getoond. Til nu met een fijne pincet de pul en de bijbehorende utriculus voorzichtig van het benige labyrint af, waarbij u erop let dat het centrale deel van de puli dat het sensorische epitheel bevat, niet beschadigd raakt. Overbreng de triade bestaande uit de twee puli en de utriculus naar een petrischaal gevuld met Lebovitz L 15 kweekmedium.Gebruik een glasvezelkabel om het weefsel van achteren te belichten, zodat de crista met het sensorische epitheel in de pul duidelijk zichtbaar is. Gebruik nu de fijne iris-schaar om voorzichtig een incisie te maken in het gespikkelde dak van de amp. Maak de incisie zo dicht mogelijk bij de rand van het sensorische epitheel zonder dit aan te raken.Zoals hier getoond, dient men ervoor te zorgen dat er geen stukken membraan over het sensorisch epitheel liggen. Dit schema toont de vorm van de uiteindelijke preparatie en de plaatsing van de registratie-elektrode; breng de geïsoleerde, semi-intacte preparatie over naar een kleine registratiekamer met glazen bodem die is gevuld met L 15-medium en fixeer de preparatie met een rooster van fijne nylonvezels dat is bevestigd aan een afgeplatte U-vormige platina draad. Het weefsel is nu gereed voor elektrofysiologische registraties.Perfuseer de semi-intacte preparatie met continu geoxygeneerd L 15-medium. Zorg ervoor dat het medium rood blijft, wat duidt op een pH met zuurstof van 7,3 tot 7,4. Bereid gedurende de procedure registratiepipetten voor van 1,5 millimeter met een binnendiameter van 1,19 millimeter.Trek siliciumglas met een tweestaps-protocol op een micropipette-trekker om een uiteindelijke impedantie van drie tot vier mega te bereiken. Vul de schacht van de pipette met drie tot vier millimeter interne oplossing op basis van kaliumfluoride. Wikkel vervolgens de schacht van de pipette twee tot drie keer, zo ver mogelijk naar de punt toe, met een dunne strip Parafilm om de elektrode te isoleren en de pipette-capaciteit te verminderen.Positioneer de pipet boven het sensorisch epitheel bij een lage vergroting van vijf x op een rechtopstaande microscoop. Schakel over naar een hogere vergroting van 40 x en visualiseer individuele vestibulaire haarcellen met een aangesloten CCD-camera. Gebruik de micromanipulator om de pipet op het membraan van een gevisualiseerde haarcel te positioneren.Zodra een giga-ohm seal is bereikt, wordt het celmembraan geruptureerd door een kleine hoeveelheid negatieve druk aan te brengen via een zuigpoort op de pipethouder, waarna whole-cell voltage clamp opnames worden uitgevoerd met standaardtechnieken voor tweefotonmicroscopie. Houd de de-deroofing semi-intact. Dompel de preparatie onder en breng deze over op een klein stukje filterpapier.Zorg ervoor dat het sensorische epitheel van bovenaf niet belemmerd wordt. Plaats het filterpapier en het preparaat op de met zoutoplossing bedekte basisplatina-elektrode van een electroporator. Breng de bovenste platina-elektrode parallel aan de basiselektrode op een afstand van ongeveer twee millimeter, terwijl u er zorgvuldig op let dat de oriëntatie van het preparaat niet wordt verstoord.Wanneer er contact is met de Oregon Green 4 88 bafta, wordt er één oplossing gemaakt, zoals te zien is in deze afbeelding. Zet een korte stroompuls op de preparatie. Breng een kleine hoeveelheid siliconenolie aan op de bodem van een glazen opnamekamer die gevuld is met L 15 medium.Plaats vervolgens de semi-intacte preparatie er opnieuw op, waarbij u ervoor zorgt dat het sensorische epitheel van bovenaf onbelemmerd is. Om stabiliteit tijdens de beeldvorming te garanderen, plaatst u het nylon rooster opnieuw over de preparatie. Maak vervolgens met de tweefotonenmicroscoop optische opnames van de spontane calciumactiviteit in het sensorische epitheel met behulp van standaard beeldvormingsprotocollen.Deze afbeelding toont hele celstroommetingen vastgelegd bij een vestibulaire haarcel van type één, gekenmerkt door grote instortende staartstromen, hier aangegeven met de pijl. Hele celstromen werden vastgelegd bij een vestibulaire haarcel van type twee. Let op de afwezigheid van staartstromen.Deze afbeelding toont een whole-cell registratie van een primaire afferent van de calyx, gekenmerkt door transiënte natriumgemedieerde stromen, zoals aangegeven door de pijl na depolarisatie vanuit een negatieve rustpotentiaal van -120 millivolt. Alle cellen werden vastgehouden op -60 millivolt. Deze figuur toont de IV-relaties voor type 2 haarcellen geregistreerd van jonge en oudere muizen als reactie op een toenemende depolarisatieduur.Deze histogrammen tonen de gemiddelde conductantie en een activeringsratio van type twee haarcellen in jonge en oude muizen, gebaseerd op de 100 milliseconde IV-curven. Deze tweefoton-micrografieën tonen BAFTA one Oregon green calciumactivatie als reactie op normale L 15 PERFU eight in het bovenste paneel of L 15 bevattend 100 millimol kaliumchloride in het onderste paneel. De pijlen geven dezelfde individuele haarcel aan voor en na de toevoeging van kaliumchloride.Deze grafiek toont het calciumfluorescentieprofiel van de individuele cel die door de pijl in de vorige afbeelding wordt aangegeven. Deze tweefoton-micrografie van het sensorische epitheel toont de Oregon Green 488 bta-1 belading van individuele haarcellen. Het inzetstuk toont de subcellulaire lokalisatie van calcium in het cytoplasma van de type 1 haarcel, aangegeven door de pijl, of de calyx primaire afferent die een type 1 haarcel omringt, aangegeven door de dubbele pijlen.Zodra de techniek onder de knie is, kan de dissectie minder dan 10 minuten duren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u het vestibulaire sensorische epitheel isoleert, hoe u dit intact houdt en hoe u de levensvatbaarheid ervan behoudt voor elektrofysiologische opnames en twee-foton calcium-imaging.

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

This video outlines the isolation of a mouse vomeronasal organ (VNO) and tissue preparation for vibratome sectioning. Sections are used to characterize the biophysical and physiological attributes of a specific group of sensory neurons.

Preparation of Mouse Vomeronasal Organ for Vibratome Sectioning

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

Source: Van Wonterghem, E., et al. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the preparation and imaging of choroid plexus tissue from a mouse brain using scanning electron microscopy (SEM). The process includes tissue fixation, dehydration, and coating with a conductive platinum layer to stabilize and prepare the sample for imaging. SEM captures detailed images of epithelial cells with...

Visualization of a Mouse Brain Choroid Plexus Using Scanning Electron Microscopy

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Leer een semi-intacte preparatie van muis vestibulair sensorisch epitheel voor elektrofysiologie en twee-foton microscopie. Deze methode behoudt fysiologische omstandigheden voor onderzoek naar haarcelmembraaneigenschappen en calciumsignalering.

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie (Video) | JoVE Journal

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

Meer video's verkennen