Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Het algemene doel van het volgende experiment is om methicilline-resistente of MRSA en methicilline-gevoelige of MSSA stammen van staphylococcus aureus te onderscheiden door middel van speciaal geselecteerde anti-gemodificeerde lytische bacteriënfag. Wanneer bacteriën zijn bevestigd aan de lange flexibele staarten van de lytische faag, is de afstand tussen de bevestigde cellen en het sensoroppervlak groter dan de penetratie van de akoestische golf van de QC m. Daarom wordt het signaal van het bindingsevenement niet gegenereerd.

Door de intacte faag te vervangen door sferoïde resulteert dit in volledig functionele fagen met korte staarten, die de bacteriën binnen de penetratiediepte van de akoestische golf van de QC m binden, en dus bijdragen aan de frequentie- en dissipatie-veranderingen wanneer faagsteroïden worden afgezet op een A-Q-C-M-D kristal en worden blootgesteld aan de gemengde bacteriesuspensie, binden ze zowel de MRSA als de MSSA stammen van staphylococcus aureus, maar niet andere bacteriën die de staphylococcus aureus scheiden van de andere bacteriën op het kristaloppervlak. Ten slotte, wanneer er specifieke PPP twee A antilichaam gebonden korrels voor Mr.RSA worden toegevoegd, wordt er een signaal gegenereerd in de aanwezigheid van Mr.RSA stammen van staphylococcus aureus. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals PCR, zijn dat deze methode geen DNA-extractie vereist en niet gevoelig is voor empirica.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de screening en desinfectie van staphylococcus orus, kan deze ook worden toegepast op andere antibioticaresistente bacteriën. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de fabricage van biosensoren precisie, nauwkeurigheid en geduld vereist. Begin met het reinigen van goudgecodeerde kwartsstukken door plasma-etsen in Argonne gedurende 10 minuten, en steriliseer vervolgens de stukken gedurende zes uur onder UV-licht in een steriele kast. Na sterilisatie, voeg 50 microliters van een faagsuspensie toe aan het goudoppervlak van elk stuk in een steriele petrischaal, en incubeer vervolgens de stukken een nacht in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, verwijder de resterende faagsuspensie voor titratie, en was vervolgens elk kwartsstuk met gebonden faag vijf keer met PBS om eventuele ongebonden fagen te verwijderen.

Om de infectiviteit van geïmmobiliseerde fagen op een droge oppervlakte te testen, verspreidt u eerst een nachtelijke cultuur van staphylococcus aureus op een NZY eRate en laat u de suspensie drogen. Plaats vervolgens een met geïmmobiliseerde fagen bedekte goudlaag van kwarts met de fagen naar beneden op de plaat. Na 12 uur bij 37 graden Celsius kan een zone van lysis die infectiviteit aangeeft worden waargenomen om de lytische activiteit van vrije fagen in vloeistof te testen.

Voeg eerst een nachtelijke bacteriecultuur van staphylococcus aureus toe aan 10 milliliter NZY in elk van de vier 300 milliliter zijarmkolven. Voeg vervolgens twee keer 10 tot zes PFU per milliliter van vrije fagen toe aan twee van de kolven. Bewaak nu de tijdsverloop van de lysis van staphylococcus cellen gedurende 570 minuten door optische dichtheidsmeting met tussenpozen van 30 minuten voor elke kolf, met een laatste meting na 24 uur.

Om de lytische activiteit van gebonden fagen in vloeistof te testen, herhaalt u de zojuist aangetoonde stappen, maar voegt u in plaats van vrije fagen goudstukken met gebonden fagen toe aan de experimentele kolven. Om faagsteroïden te bereiden, combineert u eerst 400 microliters van een stamfaag 1 2600 suspensie met een gelijk volume van spectra fotometrisch kwaliteit chloroform in een 1 milliliter flesje bij kamertemperatuur. Vorm vervolgens voorzichtig de faag-chloroform suspensie vijf tot zes keer met tussenpozen van vijf seconden gedurende een minuut.

Laat de suspensie 30 seconden stabiliseren, verzamel vervolgens de bovenste fractie die de steroïde suspensie bevat. Breng een paar microliters van de steroïde suspensie over in een 500 microliter flesje voor transmissie en scanning elektronenmicroscopie. Bewaar de resterende steroïde suspensie in een 1 milliliter flesje voor biosensorfabricage.

Om de biosensor voor te bereiden, reinig eerst de QCMD sensoren door plasma-etsen in argon gedurende 10 minuten in een plasma cleaner. Spoel vervolgens de sensoren met hexaan om eventuele organische onzuiverheden te verwijderen. Reinig vervolgens een trog van de filmbalans zoals eerder beschreven door Olson Etal in het Journal of Microbiological Methods.

Door een LB trog te vullen met een sub fase oplossing en deze te reinigen met een trogbarrière. Stabiliseer vervolgens de trog gedurende 10 minuten bij 20 graden Celsius. Maak nu een faagmonolayer op de LB sub fase oplossing door voorzichtig een 300 microliter Eloqua van een faag 1 2600 waterige suspensie te druppelen op een schuin geplaatste eetbare glazen staaf die gedeeltelijk ondergedompeld is in de SOPH fase. Laat de monolaag 10 minuten stabiliseren, en comprimeer vervolgens de monolaag met een snelheid van 30 millimeter per minuut tot een constante druk van 19 newton per meter is bereikt.

De verticale filmdepositie is het lastigste deel van deze procedure. Om succes te garanderen, moet u ervoor zorgen dat alle componenten van deze procedure schoon zijn en dat de parameters voor de monolaagdeposition ook geoptimaliseerd zijn. Dompel de sensor nu zeven keer achtereenvolgens in en uit de monolaag met een snelheid van 4,5 millimeter per minuut om een verticale filmdeposition uit te voeren.

Op de loodrecht geplaatste QCMD sensor. Verticale filmdeposition bindt de intacte fagen aan het biosensoroppervlak. Gebruik ten slotte gefabriceerde faagbiosensoren voor MRSA detectie, elektronenmicroscopie en el optometrie van zowel de vrije als de gebonden fagen.

Begin met deze stap door baselines, resonantiefrequentie en energiedissipatie van de QCM sensor in water vast te stellen met behulp van qof T software. Trek na ongeveer 30 minuten een suspensie van levende methicilline-gevoelige staphylococcus aureus of MSSA bacteriecellen in water door de testcel. De blauwe lijn geeft de frequentiewaarde weer, terwijl de rode lijn