Name: Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Leer een biosensormethode voor het onderscheiden van MRSA en MSSA stammen van Staphylococcus aureus met behulp van lytische fagen op een kwartskristalmicrobalanssensor. Deze techniek elimineert de noodzaak van DNA-extractie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk hierin gemeld werd ondersteund door subsidies van Auburn University AUDFS en USAF CRADA 07-277-60MDG-01. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet de officiële beleid of standpunt van de United States Air Force, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering.

1. Instellen van het podium <ol><li> Verkrijgen type stam S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicilline-resistente stammen van S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; De lytische faag 12.600. </li><li> Verkrijgen PBP 2a antilichaam geconjugeerd latexparels. </li><li> Bereid NZY medium zoals beschreven 21. </li><li> Verkrijgen fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Bereid gedemineraliseerd water als subfase voor Langmuir-Blodgett (LB) monolaag depositie. </li></ol> 2. Bacteriofaag Voortplanting en titratie <ol><li> Incubeer 5 ml overnacht cultuur van S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml) met 500 ul van faag (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; PFU / ml) in 500 ml NZY medium in 2 L Flack on shaker-incubator bij 37 ° C geïncubeerd. </li><li> Centrifugeer cultuur bij 4424 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Re-gecentrifugeerde supernatant bij 11.325 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Filter supernatant door een 0,22 urn Millipore filter. </li><li> Centrifugeer het filtraat bij 75.395 xg gedurende 1,5 uur. </li><li> Los pellet in 100 pl gedestilleerd water. </li><li> Bereid 10-voudige verdunningen van faagsuspensie in NZY medium. </li><li> Plaat 1 ml overnachting (ON) cultuur van S. aureus ATCC 12600 op elk van 2 platen met NZY agar om ervoor te zorgen dat alle oppervlak is bedekt. Verwijder de overmaat aan cultuur en laat het oppervlak drogen gedurende 30 minuten. </li><li> Spot een monster (10 ui) van faag passende verdunning op het oppervlak van de plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 18-24 uur. </li><li> Onderzoekt de vorming van plaques en bereken de faag titer. Bacteriofaag titers (T) worden geschat op basis van het aantal pLaques (N) gevormd per 10 ul volume (v) van faagsuspensie en de verdunningsfactor (F). De titer werd berekend met de formule:. T = N / (VXF) Voor bijvoorbeeld het aantal plaques 75 bij een verdunning 10 -7 en volume 10 pi (10 x 10 -3 ml), de titer gelijk 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 plaque vormende eenheden (PFU) per ml suspensie. </li></ol> 3. Goud-geïmmobiliseerde faag <ol><li> Schoon goud gecoate kwarts stukken (60 mm 2) van plasma-etsen in argon gedurende 10 min en vervolgens steriliseren gedurende 6 uur onder UV-licht in een steriele kast. </li><li> Voeg 50 microliter van 1 x 10 9 PFU / ml faagsuspensie het goud oppervlak van elk stuk in een steriele petrischaal, en incubeer overnacht in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder titreren de resterende faagsuspensie. </li><li> Wassen stukken met gebonden faag 5 maal met PBS om ongebonden te verwijderenfaag. </li></ol> 4. Testen van geïmmobiliseerde faag infectiviteit op een droog oppervlak <ol><li> Verspreid een O / N cultuur van S. Aureus ATCC 12600 op een NZY agar plaat en laat het drogen. </li><li> Plaats een goudstuk met geïmmobiliseerde faag op de plaat naar beneden. </li><li> Neem een ​​zone van lysis na 12 uur incubatie bij 37 ° C aangeeft dat infectiviteit. </li><li> Met goud bedekt stukken zonder faag in controle-experimenten. </li></ol> 5. Testen van lytische activiteit van vrije en gebonden faag in Liquid <ol><li> Voeg een ON cultuur van S. aureus ATCC 12.600-10 ml NZY in elk van vier 300 ml kolven zijarm (6 x 10 6 CFU / ml in elke kolf). </li><li> Voeg toe op twee kolven 2 x 10 6 PFU / ml gratis faag. </li><li> Gebruik de beide andere kolven als controles. </li><li> Bewaak het tijdsverloop van S. aureus cellysis voor 570 min door optische dichtheid meting (OD 600) op 30 min. intervallen voor alle kolven.</li><li> Neem een ​​laatste meting op 24 uur. </li><li> Herhaal de stappen 5,1-5,5, maar gebruik goudstukken met gebonden fagen in plaats van vrij fagen, en goudstukken zonder faag in control kolven. </li></ol> 6. Verlies van gebonden fagen Tijdens Incubation <ol><li> Voeg 50 ul van 1 x 10 9 PFU / ml faag aan het oppervlak van steriele goudstuk in een petrischaal die wordt geplaatst in een vochtige kamer gedurende de nacht bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de ophanging met ongebonden faag uit de gouden oppervlak en titer. </li><li> Was de gouden stuk met gebonden faag 5 maal met PBS en in 1 ml NZY oplossing in 15 ml buis shaker-incubator bij 37 ° C gedurende 8 uur. </li><li> Bepaal de titer van de vrijstaande faag zoals beschreven in 2. </li></ol> 7. Faag Sferoïden Voorbereiding <ol><li> Combineren 400 pl stock faag 12600 suspensie (10 11 PFU / ml) met een gelijk volume chloroform spectrofotometrische graad in 1 ml flaconbij kamertemperatuur. </li><li> Voorzichtig vortex de faag-chloroform ophanging 5-6 keer (5 sec interval) meer dan een minuut duren. </li><li> Mag de schorsing te stabiliseren gedurende 30 seconden en vervolgens pipet van de bovenste fase die spheroids afgepipetteerd voor monolaag voorbereiding. </li><li> Neem een ​​paar microliter van de sferoïden suspensie voor de transmissie en scanning elektronenmicroscopie. </li><li> Gebruik een resterende spheroïde suspensie voor biosensor productie. </li></ol> 8. Biosensor Voorbereiding <ol><li> Clean QCM-D sensors plasma etsen in argon gedurende 10 min PDC-32G Harrick plasma cleaner. </li><li> Spoel de sensor met hexaan om eventuele organische verontreinigingen te verwijderen. </li><li> Bereiden en schoon een dieptepunt van de film evenwicht zoals beschreven in 22. </li><li> Vul LB trog met een subfase oplossing en reinig deze met een trog barrière en stabiliseren de trog bij 20 ± 0,1 ° C </li><li> Verspreid 300 pi aliquot van faag 12.600 in waterige suspension (10 11 PFU / ml) op LB subfase. </li><li> Bereid faag monolaag op LB subfase oplossing doordat 300 pi aliquot van faag 12.600 waterige suspensie (10 11 PFU / ml) te lopen naar beneden een hellend bevochtigbaar glazen staaf die gedeeltelijk wordt ondergedompeld in de subfase 22,23. </li><li> Stabiliseer de bereide monolaag gedurende 10 min, en vervolgens te comprimeren met een snelheid van 30 mm / min (45 cm 2 / min), totdat een constante druk 19 N / m wordt bereikt. </li><li> Voer een verticale film depositie op loodrecht QCM-D sensor met een snelheid van 4,5 mm / min door achtereenvolgens dompelen sensor in en uit de monolaag zeven keer. Elektronenmicroscopie van neergeslagen faag monolagen vóór blootstelling aan bacteriële monsters bleek dat de lagen werden continu, homogeen en uniform (gegevens niet getoond). </li><li> Herhaal stappen 4,5-4,8 met een faag sferoïde suspensie die wordt bereid in 3. </li><li> Gebruik gefabriceerd faag biosensoren voor MRSA-detectie, elektronmicroscopie en ellipsometrie. </li></ol> 9. Biosensor testen, Discriminatie van Methicilline Resistente en gevoelige Staphylococcus Bacteriën <ol><li> In dit protocol zijn biosensoren met ongemodificeerde en gemodificeerde faag en faag spheroids voorbereid. Een kwartskristalmicrobalans met vier sensor stromingskamers wordt gebruikt om toezicht te houden binding van bacteriën aan de fagen geïmmobiliseerd op QCM sensoroppervlak. PBP 2a geconjugeerd latex korrels worden gebruikt om tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige Staphylococcus bacteriën. Alle metingen worden uitgevoerd in de stroom-modus (50 ul / min) en 5 MHz. </li><li> Een basis lijn resonantiefrequentie van de QCM sensor in water (~ 30 min). </li><li> Teken een schorsing van levende methicilline gevoelige Staphylococcus bacteriële cellen in water (10 9 CFU / ml) door de test cel. </li><li> Voortdurend veranderingen in de sensoren resonantiefrequentie en energie dissipatie monitor voor de eerste boventoon, USIng van de Q-Soft-software. </li><li> Als de veranderingen in de resonantiefrequentie sensoren en afbraak bereikt verzadigingsniveaus, voeg de suspensie van PBP geconjugeerd latex korrels (6,77 x10 10 parels / ml) om de stroming tijdens de continue monitoring van de frequentie en dissipatie. </li><li> Herhaal de stappen 9,2-9,5 voor methicilline resistente staphylococcus bacteriële cellen (MRSA). </li><li> Definieer een frequentie verandering door de massale verandering als gevolg van bacteriën, door de Sauerbrey vergelijking 24,25 = Af-Δm xn / C, waarbij C de massa gevoeligheid constante (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 bij 5 MHz ), m is massa en n het getal boventoon (n = 1). </li><li> Definieer een energie dissipatie verandering (Δ D) uit de opname van de exponentieel verval van de trilling (frequentie en amplitude demping, die kwantificering van de energie afgevoerd en opgeslagen gedurende een periode van trilling toegestaan,E verdreven en E opgeslagen, respectievelijk: Δ D = E afgevoerd / 2 πE opgeslagen. Δ D wordt gemeten in dissipatie eenheden (DU), een DU = 10 -6 relatieve eenheden). </li></ol>

<ol><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+methicillin+resistant+and+sensitive+strains+of+Staphylococcus+aureus+using+tandem+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements.</a> J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Langmuir+monolayers+and+Langmuir-Blodgett+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces%2C+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films.</a> Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).</li>
<li>Barie, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-resistant+gram-positive+cocci%3A+implications+for+surgical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22World.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice.</a> World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).</li>
<li>Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiologic+analysis+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens.</a> J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).</li>
<li>Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+of+Staphylococcus+aureus+from+lower+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yiyuanganranxue+Zazhi%22%5BJournal%5D)">Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract.</a> Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).</li>
<li>Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistant%27+Staphylococcus+aureus+infections+during+1978-79%3A+clinical+and+bacteriologic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations.</a> J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).</li>
<li>Knopf, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+caused+by+multiresistant+pathogens.+Clinical+management+exemplified+by+multiresistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Urologe+A%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus.</a> Urologe A. 36, 248-254 (1997).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+differential+inoculum+disk+diffusion+method+and+Vitek+GPS-SA+card+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).</li>
<li>Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapid+ATB+Staph+for+5-hour+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).</li>
<li>Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MicroScan+rapid+gram-positive+panels+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+BBL+crystal+MRSA+ID+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of BBL crystal MRSA ID system.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).</li>
<li>Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+Crystal+MRSA+ID+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).</li>
<li>Zambardi, G., Fleurette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+multicentre+evaluation+of+a+commercial+system+for+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).</li>
<li>Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistance+in+staphylococci%3A+molecular+and+biochemical+basis+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).</li>
<li>Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+laboratory+diagnosis+and+susceptibility+testing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).</li>
<li>Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+conventional+susceptibility+tests+with+direct+detection+of+penicillin-binding+protein+2a+in+borderline+oxacillin-resistant+strains+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+%26+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).</li>
<li>Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+phage+as+a+specific+and+selective+probe+for+detection+of+Staphylococcus+aureus-A+surface+plasmon+resonance+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).</li>
<li>Popham, D. L., Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+penicillin-binding+proteins+in+bacterial+cell+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis.</a> Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).</li>
<li>Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+shape+determination+by+the+Bacillus+subtilis+class+B+penicillin-binding+proteins+encoded+by+pbpA+and+pbpH%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH.</a> J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).</li>
<li>Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+filamentous+phage+yield+during+computer-controlled+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).</li>
<li>Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+selective+biosensor+for+Salmonella+and+its+detection+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment.</a> J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).</li>
<li>Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+biosensor+for+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive biosensor for Salmonella.</a> Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).</li>
<li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quartz+oscillators+for+weighing+thin+layers+and+for+microweighing%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Phys%22%5BJournal%5D)">The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing.</a> Z. Phys. 155, 206-222 (1959).</li>
<li>Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Dissipation+Kinetics+for+Protein+and+Antibody-Antigen+Adsorption+under+Shear+Oscillation+on+a+Quartz+Crystal+Microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance.</a> Langmuir. 14, 729-734 (1998).</li>
<li>Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+bacteriophage+contract+into+hollow+spherical+particles+upon+exposure+to+a+chloroform-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface.</a> Cell. 23, 747-753 (1981).</li>
<li>Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Capture+Efficiency+and+Antimicrobial+Activity+of+Phage-Functionalized+Model+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces.</a> Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent%27+Reporter+Phage+for+the+Detection+of+Category+A+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. (53), e2740(2011).</li>
<li>Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+mass%22+effect+in+biosensor%27s+QCM+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Missing mass" effect in biosensor's QCM applications.</a> Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).</li>
<li>Gervals, L., Gel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+biotinylated+bacteriophages+on+biosensor+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces.</a> Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).</li>
<li>Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+as+a+molecular+recognition+element+in+biosensors+immobilized+by+physical+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).</li>
<li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het is bekend dat fagen kunnen worden gebruikt als biosensor probes voor bacteriële pathogenen 28. Het is aangetoond dat dit werk faag met PBP 2a antilichamen kunnen worden gebruikt om het oude probleem: snelle discriminatie antibiotica resistente en gevoelige stammen. Het bleek echter deze normale ongewijzigde Staphylococcus fagen zijn niet geschikt voor detectie met bacteriën QCM apparaten, hoewel ze bacteriën binden. De faag staart is zo lang dat akoestische golven niet kunnen ...

Methicilline resistente stammen van Staphylococcus aureus zijn gesuggereerd als een factor in essentiële infecties en nosocomiale uitbraken 4-8. Voorkomende manieren van de erkenning van methicilline resistentie, zoals de disk diffusie oxacillin agar screentest, of bouillon microverdunnings, vertrouwen op maat kweekomstandigheden om de uitdrukking van de weerstand te verbeteren. Veranderingen omvatten het gebruik van oxacilline, incubatie bij 30 of 35 ° C in plaats van 37 ° C, en de toevoeging van NaCl aan het groeimedium. Verder is het voor juiste detectie bij dit soort technieken, een lange incubatietijd van 24 uur in plaats van 16 tot 18 uur vereist. Snelle technieken met de juiste (&gt; 96%) niveau van gevoeligheid voor de identificatie van meticillineresistentie omvatten geautomatiseerde microverdunningsplaten technieken zoals het Vitek GPS-SA-kaart, de Rapid ATB Staphylococcus-systeem, en de Rapid Microscan Panel systeem dat resultaten opleveren na 3-11 uur 9-11. De Crystal MRSA ID systeem is een snelle methode, gebaseerd op de erkenning van de groei van S. aureus in aanwezigheid van 2% NaCl en 4 mg oxacilline per liter met een zuurstof-gevoelige fluorescentie sensor. Beweerde gevoeligheden variëren tussen 91 tot 100% na 4 uur incubatie 12-14. Deze fenotypische methoden zijn beperkt in hun nauwkeurigheid door de impact van de heersende stammen die heterogene weerstand uiten. Daarom is de beste algemeen aanvaarde methoden voor de erkenning van methicilline resistentie is PCR of DNA hybridisatie van het mecA gen 15. Deze techniek vereist echter gezuiverd DNA en is zeer gevoelig voor verschillende hulpstoffen (verontreinigingen) die celresten 16 omvatten. Bovendien zijn deze technieken hebben een lange tijd uit te voeren. Strategieën voor de herkenning van het mecA genproduct eiwit PBP 2a, kunnen worden gebruikt om resistentie te bepalen en kan betrouwbaarder vergelijking met standaard testtechnieken 17. Staphylococcus aureus stammen inbegrip van die met meticillineresistentie 1,2,18. In dit werk een nieuwe techniek in de specifieke herkenning en detectie van MRSA, zoals de herkenning van bacteriën met conformatie van MRSA in real time wij voorgesteld. Daarvoor speciaal een S. aureus bacteriofaag met een breed spectrum van systemen (waaronder MRSA) in combinatie met monoklonale antilichamen tegen eiwit (PBP 2a) gebruikt. PBP 2a is een celwand-eiwit en is de oorzaak van antibiotische weerstand van MRSA. Echter PBP 2a antilichaam niet specifiek voor S. aureus omdat sommige andere bacteriën hebben antibiotische bindende eiwitten met sequentie-overeenkomst aan PBP 2a 19,20. Dus ook in dit werk, S. aureus bacteriofagen en antilichamen tegen PBP 2a eiwit zijn gebruikt. Om een ​​biosensor ontwikkelen specificatisch detecteren en identificeren MRSA een apparaat met een twee stappen is gebruikt. De eerste stap die een S. aureus bacteriofaag monolaag als sensor probe, terwijl de tweede stap gebruikt PBP 2a specifieke antilichamen. Daarom is de eerste stap zal S. herkennen aureus bacteriën, zoals de andere zal gevoelig zijn voor het antibioticum-bindend eiwit. Bij ontvangst van twee stappen signalen positief, duidt de specifieke detectie van MRSA.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometric-grade chloroform </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>154733</td><td>(99.8% A.C.S.) </td></tr><tr><td>Hexane-Anhydrous </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>29609-0</td><td>(95%)</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol </td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT</td><td>64-17-5</td><td>190 Proof</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td><td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td><td>The MRSA-Screen test</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051 van </td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 </td><td>The culture collection of Auburn University, Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge </td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K Ultra Centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LB film balance</td><td>KSV Chemicals, Finland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope optical system </td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope (SEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL-7000F SEM</td><td></td></tr><tr><td>Transmitting electron microscopy (TEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL, JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup, voorgesteriliseerde</td><td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 µm, GP Express PLUS membraan</td></tr><tr><td>Bio-Assay schaal</td><td>NUNC A/S, Denmark</td><td>240835</td><td>Afmetingen(mm), 245 x 245 x 25</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Gilson, Pipetman, Frankrijk</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, CT</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Gouden gecoate kwarts stukken</td><td>Auburn University, AL</td><td></td><td>Zelfgemaakt</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Brand, VS</td><td>0875713</td><td>100 mmX15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Cultuur groeikolven</td><td>Corning Incorporated, NY</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Erlenmeyer kolven </td></tr><tr><td>Optical Spectrometer</td><td>Genesys 20. Thermo Spectronic, VS.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma, VS</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Millipore waterzuiveringssysteem</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Ellipsometer</td><td>Accurion, VS</td><td>nanofilm_ep3se</td><td></td></tr><tr><td>Software </td><td>Q-Sense AB, Sweden</td><td>QSoft, QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

biosensor voor de detectie van antibiotica resistente staphylococcus bacteriën

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Een structureel getransformeerd lytische bacteriofagen met een breed gastheerbereik van Staphylococcus aureus-stammen en een penicilline-bindende eiwitten (PBP 2a) antilichaam geconjugeerd latex kralen zijn gebruikt om een biosensor ontwikkeld voor discriminatie van methicilline resistente (MRSA) en gevoelige (MSSA) S creëren . aureus soorten 1,2. De lytische fagen zijn omgebouwd tot faag spheroids door contact met water-chloroform-interface. Faag spheroïde monolagen werden op een biosensor oppervlak bewogen door Langmuir-Blodgett (LB) techniek 3. De gecreëerde biosensoren werden onderzocht door een kwartskristalmicrobalans met dissipatie tracking (QCM-D) om bacteriën-faag interacties te evalueren. Bacterie-spheroïde interacties leidden tot lagere resonantiefrequentie en een stijging van de dissipatie energie voor zowel MRSA en MSSA-stammen. Nadat het bacteriële bleken deze sensoren verder blootgesteld aan de penicilline-bindende eiwit antilichaam latex bolletjes. Sensoren geanalyseerd met MRSA gereageerd 2a antilichaam kralen PBP; hoewel sensoren geïnspecteerd met MSSA gaf geen antwoord. Deze experimentele onderscheid bepaalt een ondubbelzinnig onderscheid tussen methicilline resistente en gevoelige S. aureus-stammen. Evenzeer gebonden en ongebonden bacteriofagen onderdrukken de groei van bacteriën op oppervlakken en in het water schorsingen. Zodra lytische fagen worden veranderd in bolletjes, ze behouden hun sterke lytische activiteit en vertonen een hoge bacteriële capture-mogelijkheid. De faag en faag sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen en sterilisatie van antibioticaresistente micro-organismen. Andere toepassingen kunnen het gebruik in bacteriofaagtherapie en antimicrobiële oppervlakken.

De faag gedemonstreerd lytische activiteit tegen alle geteste stammen van S. aureus, waaronder MRSA-stammen, zoals aangegeven door de faag spot test. Plaque groottes algemeen varieerden van 5 tot 15 mm. Geen activiteit werd gevonden tegen andere test kweken (tabel 1). Een normale groei van S. aureus ATCC 12600 in NZY middelgrote on shaker-incubator bij 37 ° C is weergegeven in figuur 1A (een curve gemerkt met lege cirkels). Het aantal bacte...

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het onderscheiden van methicilline-resistente (MRSA) en methicilline-gevoelige (MSSA) stammen van Staphylococcus aureus met behulp van speciaal geselecteerde, gemodificeerde lytische bacteriofagen. Wanneer bacteriën zich hechten aan de lange, flexibele staarten van de lytische faag, is de afstand tussen de gehechte cellen en het sensoroppervlak groter dan de penetratiediepte van de akoestische golf van de QC m. Hierdoor wordt er geen signaal van het bindingsproces gegenereerd.Het vervangen van de intacte faag door een sferoïde resulteert in een volledig functionele faag met korte staarten, die de bacteriën binden binnen de penetratiediepte van de akoestische golf van de QCM, waardoor ze bijdragen aan de frequentie- en dissipatieveranderingen wanneer faagsferoïden op het A-Q-C-M-D-kristal worden afgezet en worden blootgesteld aan de gemengde bacteriële suspensie; ze binden zowel de MRSA- als MSSA-stammen van Staphylococcus aureus, maar geen andere bacteriën, waardoor Staphylococcus aureus van andere bacteriën op het kristaloppervlak wordt gescheiden. Ten slotte wordt er een signaal gegenereerd in de aanwezigheid van MRSA-stammen van S

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het ontwerp van een eenvoudige een-dag workflow regeling voor bacteriële pathogenen diagnostiek maakt het mogelijk snelle herkenning van infecties in het bloed. Het opnemen van acht klinisch relevante bacteriële doelen en de resistentie tegen antibiotica profielen biedt de arts een eerste inzicht op dezelfde dag, wat kan leiden tot meer adequate therapie.

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Source: Zhang, M. et. al., Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the application of stimulated Raman scattering microscopy to assess susceptibility to antibiotics by tracking deuterium-labeled metabolic activity. By monitoring carbon–deuterium signals, the method enables rapid detection of resistant and susceptible bacterial populations.

Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande...

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Leer een biosensormethode voor het onderscheiden van MRSA en MSSA stammen van Staphylococcus aureus met behulp van lytische fagen op een kwartskristalmicrobalanssensor. Deze techniek elimineert de noodzaak van DNA-extractie.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Meer video's verkennen