Name: Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer axonale hechting meten aan substraten met piconewton-gevoeligheid via krachtspectroscopie. Deze methode gebruikt optische vallen en UV-laserpulsen om spanning in axonen te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alberto Guiggiani voor het ontwikkelen van de real-time besturingssysteem, Evelina Chieregatti en Hanako Tsushima voor inzichtelijke discussies, Giacomo Pruzzo en Alessandro Parodi voor de ontwikkeling van aangepaste elektronica en software, en Claudia Chiabrera en Marina Nanni voor hun deskundig advies en bijstand in celcultuur voorbereiding.

1. Optische Setup Het gehele optische systeem eerder 15 beschreven. In het kort wordt het optisch pincet systeem gebaseerd op een ytterbium continuous wave (CW) fiber laser die werkt bij 1064 nm (IPG Laser GmbH). Een ruimtelijke licht modulator (SLM) (LCOS-SLM, model X10468-07 - Hamamatsu) varieert de fase van het inkomende IR laserstraal om de positie van de vangst richten plek op de cultuur schotel door de computer gegenereerde hologrammen te controleren. De vrij beschikbare Blue-pincet software (weblink op apparatuur tabel) gegenereerde hologrammen geprojecteerd op de ruimtelijke licht modulator. De interferometer voor kracht-spectroscopie metingen was gebaseerd op een vier-kwadrant fotodiode (QPD, S5980 met C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) en een fotodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). De laser dissectie bron een nanoseconde gepulseerde UV Nd: YAG-laser bij 355 nm (PNV-001.525-040, Powerchip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Een akoestisch-optische modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm gesmolten silica-AA-Opto-elektronisch) gecontroleerde het vermogen van de UV laser die aan het monster. Het holografische optische pincetten en laser micro-dissector geïntegreerd op een gemodificeerde rechtopstaande microscoop (BX51 - Olympus) uitgerust met een 60x NA 0,9 water dompelen objective.The stadium van de microscoop bestaat uit een 3-assige lineaire gelijkstroommotor micro-positionering systeem (M-126.CG1, natuurkunde-instrumenten) die een aparte 3-assige piëzo-elektrische nano-positionering stage (P-733.3DD, natuurkunde-instrumenten) tot grof beweging van het monster te combineren met de sub-nanometer resolutie van de piëzo- podium. De microscoop traps systeem was uitgerust met twee regelkringen synergetisch optreden om de vangst scherpstelling plaatse handhaven op de juiste positie, afhankelijk van de geselecteerde werkmodus (positie of force clamp, statisch of dynamisch) 16. Vooral intern terugkoppellus werkt op een piëzo stadium de hiel houden een selected afstand van de val centrum. De andere uitwendige lus regelt de positie van de gemotoriseerde fase het gebied overspannen door de piëzo-actuator op een groter gebied dan de beschikbare slag 17 benutten. Wanneer het piëzo-fase de grenzen van de beschikbare slag in een richting bereikt, de externe lus verplaatst de micro fase in de tegengestelde richting, waardoor de piëzo herstelt naar zijn centrale positie, omdat het volgen van de gevangen kraal gehecht aan het monster. Wanneer het piëzo-fase de centrale positie van het natuurlijk bereik bereikt, de micro fase gestopt. Verdere details van het systeem worden gemeld in Guiggiani et al. 16,17. Een Peltier-apparaat (QE1 weerstandsverwarmingsbronnen met TC-344B dual channel zonneboiler controller - Warner Instruments) regelt de temperatuur van de celkweek onder de microscoop (37 ° C). In de cultuur, werden de pH en de luchtvochtigheid bij fysiologische omstandigheden onderhouden door beluchten van een op maat ontworpen polydimethylsiloxane (PDMS) huls (de microscoop doelstelling integreren) met bevochtigde carbogen (95% O 2, 5% CO 2). 2. Cel Cultuur Voorbereiding Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Primaire kweken werden verkregen uit hippocampus van muizen (C57BL6J, Charles River) op embryonale dag 18 (E18). <ol><li> Neuronen werden met een concentratie van 25.000 cellen / ml op glazen bodem petrischalen (P35G-0-14-C - MATEK Corporation). De lage concentratie van gekweekte cellen is nodig om de vorming van een dicht netwerk reeds in de eerste dagen in vitro te voorkomen. Bij de genoemde celconcentratie, de kans op het vinden geïsoleerde cellen met een langere neurieten niet met andere cellen is veel hoger. </li></ol> 3. Kraal Coating <ol><li> Polymere microsferen (Ø 4 micrometer, COOH-opgezegd-Bangs Laboratories, productcode PC05N/6700) werden bekleed met poly-D-lysine aanleiding van de in de Polylink Protein Koppeling Kit (Polysciences, productcode 19539) beschreven procedure. De kralen zijn bekleed met hetzelfde molecuul gebruikt voor de kweek steun en ondernemer cellen hechting omvatten. </li></ol> 4. Kies Geïsoleerde Neuron. Los Een Kraal van het Cultuur Ondergrond, Trap en Move it Naast de Neuron <ol><li> Zet de cultuur petrischaal op de microscoop podium. Na het instellen van de focus op het monster door het podium beweging, corrigeer de positie van het lichtdoorlatende doelstelling condensor aan Kohler-verlichting in te stellen. Het uitlijnen van de verlichting optiek om de conditie Kolher-belichting ingesteld is nodig om het helder veld beeldkwaliteit te verbeteren. Het gebruik van dergelijke harmonisatievoorwaarden is het ook noodzakelijk de IR laser verzamelingsrendement (via doelstelling condensor) maximaliseren van de verstrooiing gevangen sonde zijn interferometrische volgen nakoming door QPD en PD. </li><li> Pipetteer een paar ul van de beklede microsfeer voorraadoplossing inaan de cultuur schotel. Microsferen zal storten en zich houden aan de cultuur substraat. Het aantal pl geïnjecteerd in de kweekschaal afhankelijk van de microsfeer concentratie van de voorraadoplossing. De optimale mogelijkheid is om een ​​tot twee microbolletjes per beeldvorming gezichtsveld. Wanneer er te veel microsferen toegevoegd aan de kweekschaal, kunnen zij reeds willekeurig hechten aan de gekweekte neuronen. </li><li> Bewegen in de cultuur schotel, op zoek naar een geïsoleerde neuron met een langere neuriet (het axon), en sla de positie van de microscoop podium. </li><li> Bewegen en zoeken naar een kraal gehecht aan de cultuur ondersteunen. </li><li> Schakel de IR-trapping laser. In dit stadium worden geen hologrammen geprojecteerd op SLM, en de positie van de IR laser spot samenvalt met de UV laserspot positie. Stel de axiale positie van de IR spot 2-3 urn boven het steunvlak cultuur, door microscoop podium beweging. </li><li> Stel de UV laser afgegeven vermogen om het monster tot minder dan 1 μW. DeUV laser dissector eerder is gekalibreerd 14: 5-6 μW de glazen steun wordt weggenomen 4 μW een neurale verbinding volledig ontleed 2,5 μW een neuriet gedeeltelijk laesie &lt;1 μW een schokgolf wordt geproduceerd in de cultuur schotel. De optische schokgolf is sterk genoeg om de hiel los van de glazen drager. </li><li> Schakel de UV-laser, terwijl de IR laser op, en verplaats de UV plek boven de kraal gehandeld door microscoop podium beweging. De kraal loslaat van het oppervlak, en wordt gevangen door de IR laser. Schakel dan de UV-laser. </li><li> Verplaats de gevangen kraal verschillende micrometers boven het glas ondersteuning (20-30 micrometer). Opheffing van de kraal deze positie wordt voorkomen dat contact met andere cellen, terwijl deze wordt bewogen naar het eerder gekozen neuron. Breng de kraal naar de eerder opgeslagen podium positie. Stel de fase snelheid op een lage waarde (10 um / sec), zodat de luchtweerstand vloeistof kracht niet groter is dan de optische valping kracht. </li></ol> 5. Verplaats de Trap positie ten opzichte van de Laser Dissector Spot en Axon standpunt door Computer Generated Hologram, en kalibreren de optische pincet Stijfheid <ol><li> Verplaats de kraal naar de glazen steun aan de axon te visualiseren. De kraal is boven de cel gehouden om contact te vermijden met het (ongeveer 5 micrometer boven het glas ondersteuning). </li><li> Verplaats de microscooptafel de UV richten spot verplaatst op het midden van de breedte van de axon. Sla de huidige fase positie. </li><li> Verplaats de IR scherpstelling contante positie door de computer gegenereerde hologram. In deze stap wordt de stap stopgezet in de gekozen positie van de vorige stap. Als de computer gegenereerd hologram wordt geprojecteerd op de SLM wordt de gevangen kraal bewogen ten opzichte van de axon. We gaan de IR laser spot om de gevangen kraal gericht op het midden van de neurieten, met UV laser spot gecentreerd op dezelfde neurieten ook. De IR plek en dus de gevangen kraal zijn langs de neurieten5-10 um weg van de UV-spot. We gaan de positie van de IR met betrekking tot de UV spot naargelang de neurieten geometrie. Indien de optische pincet zijn niet voorzien van een SLM-systeem, kan de positie worden gevarieerd door kantelen spiegels, optische of akoestische deflectors, de IR optische pad. De IR laser spot kan worden gepositioneerd 5-10 um weg van de UV plek om optische interactie van het ontleden bundel met de gevangen sonde, die de Brownse beweging kunnen beïnvloeden en veranderen de kracht spectroscopie sporen te voorkomen. </li><li> Na het definiëren van de nieuwe IR contante positie met betrekking tot UV-spot en axon staat, zet het podium om uit de buurt van het axon positioneren de gevangen kraal en botsing met het te vermijden. Verplaats de axiale positie van de gevangen kraal tot ongeveer 2 urn boven het dekglas. </li><li> Lijn de QPD te midden van de interferentiestrepen erop: x en y QPD differentiële signalen zijn nullen als de QPD wordt gecentreerd. Verwerven 5 sec van de Brownse beweging van de gevangen kraal door de interferometer, bij 50 KHz sampling rate. Haal de stijfheid (pN / nm) en gevoeligheid (V / nm) van de optische val van het vermogensspectrum methode 18. </li></ol> 6. Bevestig de Kraal aan de Axon. Voer axotomy en Gelijktijdige Force Measurement <ol><li> Til de gevangen kraal positie ongeveer 4 micrometer boven het deksel glas, en verplaats het naar de eerder opgeslagen podium positie (zie stap 3.2). </li><li> Verplaats de gevangen kraal naar beneden richting het axon totdat hij de neuriet. De botsing tussen de gevangen kraal en axon wordt door de z QPD signaal detecteren van verplaatsing van de gevangen kraal in de axiale richting. </li><li> Wacht 10 sec met de gevangen kraal duwde tegen de axon naar zijn hechting gunst aan de neuriet membraan. </li><li> Verplaats de micro stadium de gevangen kraal uit de axon verplaatsen, en daarmee de adhesie te verifiëren op het celmembraan. Als de kraal gehandeld, het ontsnapt uit de optische val. </li><li> Terug Verplaats de laser val op de aangehouden beaden schakel de kracht-klem lus met kracht conditie gelijk aan nul. Op een dergelijke wijze, de piëzo-fase herpositioneert de kraal, aan de cel, op het optische val centrum. Als het systeem niet over een feedback loop control, kan de laser val positie verplaatst worden door de microscoop podium te centreren op de aangehechte sonde. Het centrum van de val wordt bereikt wanneer de QPD signalen hetzelfde als wanneer de hiel wordt opgesloten en niet gehecht aan de cel (x en y QPD signalen gelijk aan nul, en z QPD signaal geeft dezelfde spanning som van de vier kwadranten zoals wanneer de hiel ver is gevangen vanaf elk oppervlak). </li><li> Stel een kracht-klem staat op de z-as, het positioneren van de laser trapping iets boven het midden van de kraal (ongeveer 100 nm), een voorspanning op de gehechte gevangen probe genereren. Indien het systeem niet is uitgerust met een kracht-clamp control, kan de optische val stand worden opgewekt in de stappen van 25 nm door de microscoop podium. De z QPD signaal zorgt voor de opvolging. Gebruik daarom this signaal de positie van de laser valstrik met betrekking tot de probe gehecht. Dergelijke voorspanning nodig om de druk op het membraan na de axonale laesie en de daaruit voortvloeiende verlaging van de Brownse beweging van de probe gehecht voelen. Een vergelijkbare benadering voorgesteld om het meten van de afgifte van de spanning in een membraan ketting door video imaging 19. </li><li> Uitschakeling van de force-feedback klem om de werking op de aangehechte sonde in de stand-klem conditie (de piëzo-stadium wordt geblokkeerd) te meten. </li><li> Start gelijktijdig opnemen van de gevangen sonde posities door de interferometer (20 KHz sampling-frequentie), en de cel tijdens laser axotomy time-lapse-bright-field imaging (20 Hz beeldfrequentie). </li><li> Schakel de UV-laser om laserpulsen leveren tot een laesie zichtbaar op het beeld van de axon (gewoonlijk 200-400 optische pulsen nodig Energie per puls.: 25 nJ) wordt, dan schakelt u de UV laser. </li><li> Doorgaan met opnemen door de interferometer voor ongeveer 3 kmn, totdat de x, y en z QPD sporen vervlakken. </li></ol> 7. Kwantificeren van de Total spanningspennen <ol><li> Zet de opgenomen QPD sporen (in Volt) van de gekalibreerde gevoeligheid van de optische val, de respectieve sporen in nanometers verkrijgen. </li><li> Filter de x, y en z verplaatsing sporen door een high-pass filter met afgesneden bij 10 Hz. </li><li> Bereken de totale variantie van de gefilterde sporen die de Brownse beweging van de gevangen kraal. Bereken de variantie op 25 msec stappen voor overlappende tijdvensters van 500 msec (10.000 datapunten) 20. De hoogdoorlaatfiltering van sporen sluit de veranderingen van de Brownse beweging als gevolg van het membraan fluctuatie of corticale actine beweging. De Brownse beweging van de hiel wordt verminderd door de optische krachten en adhesie krachten op de celmembraan. Wanneer het membraan wordt gespannen door het bezorgen van spanning de viscositeit toeneemt en waardoor de Brownse beweging van de kraal, gedetecteerd onmidlijk na axotomy, begint te dalen. </li><li> Definieer t0: het begin van de daling van de Brownse beweging variantie, na de levering van UV laserenergie. Het moment t0 geeft het begin van membraan stam. </li><li> Definieer t1: het einde van de daling van de Brownse beweging variantie (als het een plateau bereikt). Het tijdsstip t1 geeft het einde van membraan stam. </li><li> Voer video volgen van puin of een kras op de cover glas ondersteuning, om eventuele drift van het monster tijdens het meten van de kracht te meten. Om het deeltje op het glas ondersteuning bijhouden, we eerst drempels gelden voor de bright-field beelden, een stapel van binaire beelden te verkrijgen met het deeltje in het wit op een zwarte achtergrond. Daarna volgen we het deeltje centrum van de massa met sub-pixel nauwkeurigheid (met behulp van de freeware software ImageJ). </li><li> Trek de gemeten drift door de verplaatsing QPD sporen. Vermenigvuldig de drift-gecorrigeerde QPD sporen door de respectieve gekalibreerde optische stijfheid (k x, k <sub&gt; y, k z) om de Fx, Fy, Fz sporen te verkrijgen in picoNewtons. </li><li> Bereken de totale kracht trace als F tot = √ (Fx ​​2 + Fy 2 + Fz 2). </li><li> Bereken de totale uitstoot van kracht tussen t0 en t1 als F vrijgegeven = F tot (t1) - F tot (t0). De gemeten kracht bij t0 worden afgetrokken omdat het door de verplaatsing van de voeler de val centrum, wanneer de hiel zich aan de neurieten. </li><li> Bereken de neuriet contactoppervlak tussen de gevangen kraal en de UV laser contante positie: op het heldere beeldveld maatregel de lange (L) en korte (D) assen van de neuriet tussen de gevangen kraal en de UV laser contante positie. Het axon contactoppervlak is een axon = L x D. </li><li> Normaliseren van de totale vrijgegeven kracht F vrijgegeven door het axon contactoppervlak Een axon. </li></ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li>
<li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+with+molecular+fluorescence+imaging+using+activatable+cell-penetrating+peptides+decreases+residual+cancer+and+improves+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).</li>
<li>Stiess, M., Maghelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+extension+occurs+independently+of+centrosomal+microtubule+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation.</a> Science. 327, 704-707 (2010).</li>
<li>Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+induced+cell+fusion+in+combination+with+optical+tweezers%3A+the+laser+cell+fusion+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap.</a> Cytometry. 12, 505-510 (1991).</li>
<li>Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+delivery+of+liposome+encapsulated+chemical+stimuli+to+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells.</a> J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).</li>
<li>Kress, H., Park, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stimulation+with+optically+manipulated+microsources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell stimulation with optically manipulated microsources.</a> Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Difato, F., Dal, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+optical+tweezers+and+laser+dissector+for+controlled+ablation+of+functional+connections+in+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).</li>
<li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>O'Toole, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stretching+in+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The role of stretching in slow axonal transport.</a> Biophys. J. 100, 351-360 (2011).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li>
<li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Optomechatronics%22%5BJournal%5D)">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li>
<li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).</li>
<li>Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuiggiani%2C+A+%223rd+Real+Time+Linux+Workshop%22">3rd Real Time Linux Workshop</a>. , (2011).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li>
<li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+mechanotransduction%3A+pathways%2C+probes%2C+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li>
<li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li>
<li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Wij rapporteren in dit werk een kwantitatieve methode om de neuriet hechting te vergelijken met de cultuur substraat, door het uitvoeren van gelijktijdige kracht spectroscopie meting tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. De gemeten afgifte van spanning gerelateerd aan de mate van hechting van de cellen aan het substraat: cellen met een hoger aantal focale adhesies zou minder spanning los. Het meten van de release van spanning in termen van picoNewtons biedt een fysieke hoeveelheid waarmee de axonale hechting in verschi...

Optische microscopie is een van de minder invasieve beeldvormingssysteem beschikbare levende cellen nemen. Bij de exploitatie van effecten zoals straling druk (zoals in optisch pincet 1) of hoge foton flux (zoals in laser dissector 2), werd deze technologie uitgebreid naar nano-manipulatie. De optische imaging-systeem levert een nauwkeurige controle te visualiseren en manipuleren sub cellulaire doelwitten 3. Tegelijkertijd, dankzij de nauwkeurige kalibratie van de geleverde laservermogen optisch gereedschap bereiken of zachte invasieve monster manipulatie met ongekende reproduceerbaarheid. Verschillende laboratoria geïntegreerd in dezelfde experimentele opstelling, optisch pincet en laser dissector om organellen 4 te versmelten 5 verschillende cellen, of cellen te stimuleren door optisch aangedreven ladingen 6,7 ablatie. Terwijl optische pincetten, na ijking van de optische stijfheid, zorgen voorde controle van de toegepaste kracht naar de cel op een piconewton schaal, kan laser dissectie systemen optische manipulatie, die varieert van membraan foto-incorporatie aan ablatie van enkele organellen of dissectie van sub-cellulaire structuren moduleren. Echter, laser dissectie kalibratie gebaseerd op kwalitatieve beoordeling van het geheel van optische manipulatie ten aanzien van de energie geleverd aan het monster, voornamelijk gebaseerd op het inzicht geeft morfologische veranderingen veroorzaakt aan het monster 8. In de gepresenteerde methode, laten we zien hoe de kracht spectroscopie metingen uit te voeren tijdens de laser axonale dissectie van een zich ontwikkelende neuron, te kwantificeren, op piconewton schaal, de kracht geproduceerd door een veranderde evenwicht in het cytoskelet structuur van een sub-cellulair compartiment 9. Gekweekte neuronen aan het substraat hechten en polariseren tijdens de ontwikkeling. De polarisatie fase optreedt gedurende de eerste vijf dagen in vitro. In fase twee van polarisatie, een van de extrudersing neurieten langer wordt, en het zal differentiëren tot het axon 10 geworden. Axonale rek in reactie op de trekkracht naar de groei kegel is eerder gemodelleerd door Dennerl&#39;s model 11. Onlangs heeft dit model uitgebreid 12 om de rol van neurieten hechting aan de extracellulaire matrix substraten omvatten. Deze biofysische model, na experimentele waarnemingen 13 voorgesteld, bleek dat trekkrachten op groeikegel, propageren langs de neuriet, gemoduleerd wordt door focale adhesies aan het substraat. Evenzo, axonale laesie produceert een lokale versie van spanning uitdragen naar de cel lichaam. Zo hebben we voorgesteld dat het meten van dergelijke uitgebracht spanning in een locatie langs de axon tussen de laesie en de cel soma biedt de mogelijkheid om de demping resultaat van onaangetast focale adhesies beoordelen. We kalibreren noodzakelijke foton-flux van de laser dissector de omvang van het aangedane axonale damag beheersene, van volledige doorsnijding tot gedeeltelijke laesie. Na de kalibratie, herhaalden we gedeeltelijke laesie axons van meerdere neuronen differentiëren en ontwikkelde protocol de spanningspennen kwantificeren, en aldus een kwantitatieve parameter voor de hechting van de axon schatten dat het substraat 14 verkregen. In dit werk hebben we in detail de ontwikkelde protocol, dat een nauwkeurige experimentele procedure te evalueren en te vergelijken met de gevoeligheid piconewton axonale hechting aan het substraat in verschillende experimentele condities, zoals chemische 14, of verschillende soorten celkweek support vertegenwoordigt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Polymeer microsferen, 4 &mu;m, COOH gecoat</td><td>Bangs laboratories</td><td>PC05N/6700</td><td></td></tr><tr><td>PolyLink Protein koppelingskit</td><td>Polyscience</td><td>19539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">UITRUSTING </td></tr><tr><td>IR laser</td><td>IPG Laser GmbH</td><td>YLM-5-SC-LP</td><td>ytterbium continuous wave (CW) fiberlaser die werkt op 1064 nm, met lineaire polarisatie</td></tr><tr><td>Ruimtelijke lichtmodulator</td><td>Hamamatsu</td><td>LCOS-SLM 10468-07</td><td></td></tr><tr><td>Blue-tweezers software</td><td>Optics group, University of Glasgow</td><td>Gratis downloadbare software</td><td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Hamamatsu</td><td>Gratis downloadbare software</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td></tr><tr><td>QPD</td><td>Thorlabs</td><td>S5980 met C5460SPL 6041 board</td><td>Vier kwadranten fotodiode om de x, y gevangen sondeverplaatsing te meten</td></tr><tr><td>PD</td><td>Teem Photonics</td><td>PDA100A-EC</td><td>Fotodiode om de z gevangen sondeverplaatsing te meten</td></tr><tr><td>Nano-Pulse UV laser</td><td>AA-optoelectronica</td><td>PNV-001525-040</td><td>Gepulseerde UVA laser, pulslengte 400 ps</td></tr><tr><td>Acoustic Optic Modulator</td><td>Olympus</td><td>MQ110-A3-UV, 355nm gefuseerd silica</td><td></td></tr><tr><td>Staande microscoop</td><td>Andor</td><td>BX51</td><td>Uitgerust met een 60, 0.9 NA, waterdompelobjectief</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Warner Instruments</td><td>V887ECSUVB EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Peltier apparaat</td><td>Physic Instruments</td><td>QE1 weerstandsverwarming met TC-344B dual kanaal verwarmingsregelaar</td><td></td></tr><tr><td>Microscooptrap: micro+piezo trap</td><td>National Instruments</td><td>Drie lineaire trappen M-126.CG1 die een aparte 3-assige piëzo-elektrische nano-positioneringstrap P-733.3DD dragen</td><td></td></tr><tr><td>Daq</td><td></td><td>NI PCI-6229</td><td>Het verzamelen van de x, y, z positie van de gevangen sonde, en het verzenden van feedback loop signalen naar de microscooptrap</td></tr><tr><td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td><td></td><td></td><td>Realtime feedback loop systeem, om de trappositie te controleren, ontwikkeld op een speciale PC desktop</td></tr></tbody></table>

meting van spanningspennen tijdens laser induced axon letsel aan axonale hechting evalueer aan de ondergrond bij piconewton en milliseconde resolutie

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

De vorming van functionele verbindingen in een ontwikkelende neurale netwerk wordt beïnvloed door extrinsieke signalen. De neuriet groei van ontwikkelingslanden neuronen de chemische en mechanische signalen, en de mechanismen die het detecteert en aan mechanische signalen worden slecht begrepen. Ophelderen van de rol van krachten in maturatiemerkers zal de inrichting van steigers die celadhesie en cytoskelet koppeling kunnen bevorderen het substraat en daarom de capaciteit van verschillende neuronale types te regenereren na letsel. Hier beschrijven we een methode om simultane kracht spectroscopie metingen gelden tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. Wij meten spanningsversie in de gedeeltelijk laesie axon door gelijktijdige interferometrische volgen van een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. Onze experimentele protocol detecteert de spanning release met piconewton gevoeligheid, en de dynamiek van de spanning vrijkomen tenmilliseconde tijdsresolutie. Daarom biedt een hoge-resolutie methode te onderzoeken hoe de mechanische koppeling tussen cellen en substraten gemoduleerd door farmacologische behandeling en / of verschillende mechanische eigenschappen van het substraat kan zijn.

De cel genereert trekkrachten op het substraat door de focale adhesies. Kracht die door cytoskeletelementen in evenwicht met de tegenwerkende kracht van het kweeksubstraat. Na laser geïnduceerde beschadiging van de neurieten, sommige van de kabels gespannen cytoskelet verstoord evenwicht en hun spanning wordt weggenomen omdat de tegenkracht van het substraat hechting wordt geëlimineerd. De spanning wordt vrijgegeven gedeeltelijk verspreid op het resterende focale adhesies en de hiel aan de celmembraan, die in een optisc...

Wij meten de spanning release in een axon die gedeeltelijk was gelaedeerde met een laser dissector door gelijktijdige krachtspectroscopie meting uitgevoerd op een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. De ontwikkelde experimentele protocol evalueert de axon hechting aan de cultuur substraat.

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Het algemene doel van deze procedure is om met piconewton-gevoeligheid de axonale adhesie aan substraten te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst lasers te gebruiken om een microsfeer vast te leggen en te positioneren naast een geïsoleerd neuron met een lang neuriet. De tweede stap is om de bol met behulp van een infraroodlaser over het axon te centreren.Vervolgens wordt de stijfheid van de optische val gekalibreerd door middel van interferometrische tracking van de Brownse beweging van het gevangen bolletje voordat dit aan het neuriet wordt bevestigd. De laatste stap is het uitvoeren van krachtmetingen tijdens het afgeven van UV-laserpulsen om het axon te lesioneren. Uiteindelijk wordt krachtspectroscopie gebruikt om de ontspanning te evalueren die wordt veroorzaakt door de axonale laesie, wat een schatting vormt van de axonale adhesie aan het substraat.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van fluoresceïnegebaseerde technieken is dat het een fysieke parameter oplevert. De kracht wordt gemeten met picco NAL-gevoeligheid, waardoor een directe vergelijking van de axiale interactie met het substraat mogelijk is onder verschillende experimentele omstandigheden, z

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse-imaging is een gevoelige methode om de effecten van mutaties in C. elegans op axonregeneratie te analyseren. Een hoogwaardig, maar goedkoop laserablatiesysteem kan eenvoudig aan de meeste microscopen worden toegevoegd. Time-lapse-imaging over een periode van 15 uur vereist een zorgvuldige immobilisatie van de worm.

De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans</em

Deze video beschrijft de methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden met behulp van twee fotonlaseraxotomie en het observeren van axonale herstel van letsel.

Twee-Foton Laser Axotomie: Een methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden en axonale herstel te observeren

The video demonstrates a method for assessing receptor forces applied by immune cells using polyethylene glycol-anchored gold nanoparticles and DNA hairpin tension probes. CD8-positive T cell interactions trigger probe unfolding, emitting fluorescence while locking strands sustain the signal for quantifying the forces applied by immune cells.

Using DNA-Based Tension Probes to Assess Receptor Forces Applied by Immune Cells

Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van DNA-gebaseerde spanningsondes om de receptorkrachten in beeld te brengen die door immuuncellen worden toegepast. Deze aanpak kan receptorkrachten &gt;4,7pN in realtime in kaart brengen en krachten in de loop van de tijd integreren.

DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Leer axonale hechting meten aan substraten met piconewton-gevoeligheid via krachtspectroscopie. Deze methode gebruikt optische vallen en UV-laserpulsen om spanning in axonen te evalueren.

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie (Video) | JoVE Journal

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie

Meer video's verkennen