Name: Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer hoe huidstamcellen van pasgeboren muizen worden gedifferentieerd naar oocytachtige cellen in vitro. Deze methode ondersteunt onderzoek naar kiemcelvorming en voortplantingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PWD wordt ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research fellowship (CIHR) en een CIHR subsidie ​​aan Gerald M. Kidder bij Western University. De auteur wil ook Julang Li erkennen aan de Universiteit van Guelph voor hulp bij de ontwikkeling van het protocol hier gepresenteerd.

1. Mediavoorbereiding <ol><li> Bereid media 2-3 uur van tevoren van het gebruik en de plaats met een los kapje in de celkweek incubator waar het experiment zullen plaatsvinden. Media gebruikt in het huidige protocol: <ol><li> Bereid stam celmedium bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met 1 x B27, 40 ng / ml bFGF en 20 ng / ml EGF. </li><li> Bereid kiemcellen differentiatiemedium bestaande uit m199 gesupplementeerd met 0,05 IU FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 ui / ml ITS, 0,23 mM natrium pyruvaat, 1 mg / ml fetuïne en 1 ng / ml EGF. Een basismedium namelijk alle additieven maar zonder FSH, LH en EGF kan worden bereid en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li></ol></li></ol> 2. Stem Cell Culture Voorbereiding <ol><li> Isoleren stamcellen uit pasgeboren muizen pups zoals eerder beschreven 12. Maken gebruik van stamcellen bij passage 2-4 voor in vitro kiem celdifferentiatie. De efficiëntie vanOLC vorming is direct gerelateerd aan de kwaliteit van het uitgangsmateriaal stamcellen. Het beste is om de differentiatie starten zodra de bevolking wordt schone en gezonde die in het algemeen rond passage 2. Verder kweken van de stamcellen laatste passage 2 nadelige invloed op de vorming OLC efficiency (ongepubliceerde resultaten). </li><li> 48 uur voorafgaand aan de start differentiatie sub-cultuur van de stamcellen. Verwijder al het geschorste bolvormige cel aggregaten en bracht media uit de cultuur schotel, met behulp van een serologische pipet, en plaats in een 15 ml buis. Het is belangrijk om alleen de zwevende bolvormige aggregaten van cellen en niet de cellen aan de bodem van de schaal die spontaan differentiëren verzamelen. </li><li> Pellet de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten., Verwijder het supernatant en resuspendeer in 500 ul vers medium stamcel verwarmd tot 37 ° C. Voorzichtig pipet de aggregaten naar de cellen gedeeltelijk distantiëren. Niet agressief de cel pipets omdat dit cellevensvatbaarheid verminderen. Was de gedeeltelijk gedissocieerde cellen in 9,5 ml vers voorverwarmde stamcel medium op een lage bevestiging 10 cm celkweekschaal. </li><li> De cellen terug naar een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 48 uur voorafgaand aan de differentiatie. </li></ol> 3. OLC Differentiatie <ol><li> Met behulp van een serologische pipet verwijder de stamcellen van de cultuur schotel en plaats in een 15 ml buis, achter elke aangehechte cellen. Pellet de cellen bij 500 xg en resuspendeer in 500 pi steriel PBS. Krachtige pipet de cellen met behulp van een breed boring 1000 ul tip in groepjes niet groter dan 10-20 cellen. Periodiek verwijderen van een kleine hoeveelheid cellen, tijdens dissociatie, en kijk onder een wit licht microscoop te bevestigen geaggregeerde cellen zijn in groepjes van 10-20 individuele cellen. Over dissociatie leidt tot verminderde cellevensvatbaarheid. </li><li> Voeg 9,5 ml PBS aan de gedissocieerde cellen en voeg 15 pi van deze celsuspensie een hemocytometer voor celtelling. Pellet de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1.32X10 6 cellen / ml in differentiatiemedium. </li><li> Het bord van de cellen door het toevoegen van 500 ul per putje in een vlakke bodem 24 goed schorsing gerecht. </li><li> Plaats de 24 putjes in een cel incubator bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48 uur. Verwijder 250 ul medium uit elk putje en doe dit in een overeenkomstig gelabeld 1,5 ml buis. Voeg 250 ul vers differentiatiemedium aan elk putje. Centrifugeer het verbruikte medium bij 500 xg gedurende 5 minuten. en gooi het supernatant. Resuspendeer elke pellet cellen in 50 ul vers differentiatiemedium en terug in het overeenkomstige cultuur goed op de differentiatie plaat. </li><li> Elke 48 uur verandert de helft van de middelgrote tot dag 12 van differentiatie. </li></ol>

<ol><li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth%2C+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li>
<li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li>
<li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li>
<li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li>
<li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li>
<li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27(2012).</li>
<li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li>
<li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li>
<li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li>
<li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+porcine+multipotent+stem%2Fstromal+cells+derived+from+skin%2C+adipose%2C+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339(2011).</li>
<li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263(2009).</li>
<li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Tot op heden functionele OLC niet zijn ontwikkeld met behulp van een volledig in vitro assay. Onlangs is een studie door Hayashi et al.. Kon nageslacht van PGC-achtige cellen gevormd in vitro en in vivo overgebracht voor verdere ontwikkeling 14. Beginnend met ES-cellen of geïnduceerde pluripotente cellen konden ze PGC vormen als cellen die, wanneer hersteld na in vivo transplantatie konden worden gerijpt, bevrucht, en gebruikt voor het nageslacht 14 gene...

Tijdens de vroege embryogenese, gametogenese gebeurt door een reeks stappen, waaronder primordiale kiemcellen (PGC) vorming, migratie, en tenslotte kolonisatie van de gonadale richels. Gedurende deze tijd PGC ondergaan proliferatie en differentiatie in steeds meer volwassen gameten 1. Dat PGC migreren vanaf de basis van de allantois in de embryo hindgut en tenslotte langs de dorsale wand uiteindelijk kolonisatie van de gonadale richels maakt ze zeer moeilijk te bestuderen 2. Ondanks de vooruitgang in het veld, hebben studies probeert PGC vorming en differentiatie begrijpen werden belemmerd door hun beperkte aantal, de locatie en migrerende natuur 3,4. De laatste jaren embryonale stamcellen is aangetoond dat het potentieel kiemcellen vorming in vitro 5,6 hebben. Zo hebben verschillende somatische stamcellen ook aangetoond dat het potentieel voor het vormen kiemcellen hebben evgevolg in vitro kweken 7-11. Onlangs stamcellen geïsoleerd uit pasgeboren muizen huid werden gedifferentieerd in vitro in kiem-achtige cellen en vroegtijdig oöcyten 12. Tijdens de differentiatie deelverzameling van de stamcellen tot expressie Oct4 toegenomen en structuren lijken cumulus-eicel complexen werden gevormd. De eicel-achtige cellen (OLC) kan worden opgehaald van de culturen en in vergelijking met natuurlijke eicellen. Met behulp van deze kweekmethode OLC meten van 40-45 micrometer worden verkregen die uitdrukken soortgelijke markers om eicellen zoals Gdf9b, VASA, en DAZL. Tot op heden is de resulterende OLC er nog steeds niet te rijpen of worden bevrucht 12. Hoewel de OLC nog niet functioneert het protocol gebruikt om deze OLC vormen nog steeds bruikbaar zijn als een test om de vorming en ontwikkeling van eerder kiemcellen bestuderen in een gesloten systeem in vitro. De oorspronkelijke publicatie bespreken van de vorming van OLC van zomatic stamcellen gebruikt foetale varkens huid als een stamcel bron 8. Uitbreiden op dat onderzoek de PGC-achtige cellen vroeg tijdens geïnduceerde differentiatie gevormd werden getoond aan de voorlopers aan de OLC en uitdrukkelijke zoals PGC markers zoals OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, en DAZL 13. Deze gegevens ondersteunt het potentieel van het gebruik van dit systeem om de kiemcellen vorming en differentiatie in vitro te bestuderen. Het protocol gebruikt om OLC van pasgeboren muizen huid te vormen zal worden gedemonstreerd in deze video artikel. Het protocol biedt een in vitro model voor kiemcelontwikkeling die een middel om belangrijke factoren toelichten voor hun proliferatie en differentiatie kunnen voorzien bestuderen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie van pasgeboren muis skin afgeleide stamcellen in germ-achtige cellen<em&gt; in vitro</em

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studeren kiemcellen vorming en differentiatie is van oudsher zeer moeilijk geweest vanwege de lage cel aantallen en hun locatie diep in de ontwikkeling van embryo&#39;s. De beschikbaarheid van een &quot;gesloten&quot; in vitro systeem zou van onschatbare waarde voor ons begrip van gametogenese. De vorming van de eicel-achtige cellen (OLC) van somatische stamcellen, geïsoleerd uit pasgeboren muizen huid, is aangetoond en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol zijn. De resulterende OLC uiten verschillende markeringen in overeenstemming met eicellen, zoals Oct4, Vasa, Bmp15 en Scp3. Maar ze blijven niet in staat om de rijping of bevruchting te wijten aan een gebrek aan meiose voltooien ondergaan. Dit protocol zal een systeem dat bruikbaar is voor het bestuderen van de vroege fase vorming en differentiatie van kiemcellen in meer volwassen gameten. Tijdens de vroege differentiatie het aantal cellen die Oct4 (potentiële ziektekiemen achtige cellen) bereikt ~ 5% echter nog de formatie van OLC blijft relatief inefficiënt. Het protocol is relatief ongecompliceerd al speciale zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen de start celpopulatie is gezond en in een vroeg passage.

Aanvankelijk was de cellen hechten aan de cultuur schotel bodem en verspreid. Op 42-72 uur in differentiatie vormen kleine zwevende OCT4 positieve cellen en zich vermenigvuldigen (Figuur 1A). Kort na de visualisatie van deze cellen de meerderheid zal verdwijnen en de aangehechte cellen ontstaat een dichte kolonie aggregaten te vormen over de cultuur bodem. Na een paar dagen deze aggregaten losmaken van het kweekoppervlak. In sommige van deze aggregaten een grote cel worden waargenomen (figuur 1b...

In de afgelopen jaren de vorming van kiemcellen middels in vitro kweekmethoden is aangetoond met behulp van verschillende soorten van somatische stamcellen. Dit artikel zal visueel presenteren de differentiatie van pasgeboren muizen afgeleide stamcellen om vroeg eicel-achtige cellen.

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het vormen van oocyt-achtige cellen met behulp van somatische, uit de huid afgeleide stamcellen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van zuivere, ongedifferentieerde stamcellen afgeleid van de huid van pasgeboren muizen. In een tweede stap worden de stamcellen gedissocieerd, wat ze voorbereidt op differentiatie.Vervolgens worden de stamcellen uitgeplaat in een gedefinieerd differentiatiemedium. Om de vorming van kiemcellen te induceren, worden resultaten verkregen die de expressie van oocytspecifieke markers aantonen op basis van semi-kwantitatieve real-time PCR. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de reproductieve biologie.Door het bieden van een gesloten systeem waarin kiemcelvorming en -ontwikkeling bestudeerd kunnen worden, moeten alle voor het protocol benodigde media twee tot drie uur voor gebruik worden bereid en met een losgedraaide dop in de celkweekincubator worden geplaatst waar het experiment zal plaatsvinden. De twee gebruikte media zijn stamcelmedium bestaande uit D-M-A-M-F 12, aangevuld met B 27 BFGF en EGF, en kiemceldifferentiatiemedium bestaande uit M1 99 aangevuld met FSH LH B-S-A-I-T-S, natriumpyruvaat, tuin en EGF stamcellen geïsoleerd uit pasgeboren muizen.Pups worden gebruikt voor in vitro kiemceldifferentiatie bij passage twee tot vier. Omdat de efficiëntie van de vorming van cyte-achtige cellen of OLC's direct gerelateerd is aan de kwaliteit van de startstamcellen, is het optimaal om de differentiatie te starten zodra de populatie schoon en gezond oogt, wat over het algemeen rond passage 2 is. Subcultiveer 48 uur vóór de start van de differentiatie de stamcellen met behulp van een serologische pipette; verwijder alle gesuspendeerde sferische celaggregaten en het gebruikte medium uit de kweekschaal en breng deze over in een buis van 15 milliliter. Het is belangrijk om alleen de gesuspendeerde sferische celaggregaten te verzamelen en niet de cellen die aan de bodem van de schaal gehecht zijn en spontaan differentiëren.Centrifugeer de cellen bij 500 ×g gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL vers stamcelmedium. Warm dit op tot 37 °C. Pipetteer de aggregaten voorzichtig om de cellen gedeeltelijk te dissociëren.Pipetteer de cellen niet te agressief, omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen vermindert. Was de gedeeltelijk gedissocieerde cellen in 9,5 milliliters vers voorverwarm stamcelmedium op een 10 centimeter cellenkweekschaal met lage aanhechting. Plaats de cellen gedurende 48 uur terug in een cellenkweekincubator op 37 degrees Celsius en 5%CO2.Om de procedure voor OLC-differentiatie te starten, gebruikt u een serologische pipette om de stamcellen uit de kweekschaal te verwijderen en in een buis van 15 milliliter te plaatsen. Laat eventuele gehechte cellen achter. Pelleteer de cellen bij 500 ×g gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL steriele PBS; pipetteer de cellen krachtig met een wide-bore 1000 µL tip tot klontjes van niet meer dan 10 tot 20 cellen.Voor het succes van dit protocol is het cruciaal om het niveau van dissociatie regelmatig te controleren, zodat tijdens de dissociatie het juiste niveau wordt bereikt. Verwijder periodiek een kleine hoeveelheid cellen en controleer deze onder een witlichtmicroscoop om te bevestigen dat de geaggregeerde cellen in klonten van 10 tot 20 individuele cellen aanwezig zijn. Voer de dissociatie van de cellen niet te ver door, aangezien dit zal leiden tot een verminderde celviabiliteit.Voeg vervolgens 9,5 milliliters PBS toe aan de gedissocieerde cellen en breng 15 microliters van deze cel-suspensie over naar een hemocytometer voor het tellen van de cellen. Pelletiseer de cellen bij 500 times G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in differentiatiemedium tot een concentratie van 1,32 times 10 to the sixth cellen per milliliter.Zaai de cellen uit door 500 µL per putje toe te voegen aan een 24-wells suspensieschaal met platte bodem. Plaats de 24-wells schaal in een celkweekincubator bij 37 °C in 5% CO2 voor 48 uur. Verwijder na 48 uur 250 µL medium uit elk putje en breng dit over in een overeenkomstig gelabelde buis van 1,5 mL.Voeg 250 µL vers differentiatiemedium toe aan elke well, centrifugeer het gebruikte medium 5 minuten bij 500 ×g, verwijder het supernatant en resuspendeer eventuele gecentrifugeerde cellen in 50 µL vers differentiatiemedium. Breng de celsuspensie terug naar de overeenkomstige kweekwell in de differentiatieplaat. Vervang elke 48 uur tot dag 12 van de differentiatie de helft van het medium op dezelfde wijze.Tijdens de vroege fase van differentiatie zullen de cellen zich hechten aan de bodem van de kweekschaal en zich uitspreiden. Deze representatieve afbeelding toont cellen na 42 tot 72 uur differentiatie die positief zijn voor OCT four. Een marker voor ongedifferentieerde stamcellen is in het groen aangegeven; kernen zijn tegengekleurd met hirst en in het blauw aangegeven.Naarmate de differentiatie vordert, zullen sommige celaggregaten zichtbaar worden met OCT four-positieve cellen gemarkeerd in het groen, omringd door OCT four-negatieve cellen. De schaalbalk voor deze afbeelding is 100 microns. Deze figuur toont een witlichtafbeelding van een follikelachtige structuur na loskoppeling van het cultivoppervlak; de schaalbalk representeert 40 microns.Bij voortgezette kweek zullen de LCS groeien tot een diameter van ongeveer 45 microns. De schaalbalk in deze afbeelding staat voor 10 microns. Grote OCT4-positieve LCS zijn te zien, ofwel omringd door cellen of enkelvoudig binnen de kweek.Deze LCS kunnen worden verzameld met ondersteuningscellen of door trypsinisatie om LCS te verkrijgen zonder andere gehechte cellen. Om te bevestigen dat de LCS vergelijkbare transcripten tot expressie brachten als natuurlijke ol-sites, werden de LCS verzameld en getest op de expressie van algemene OO-site-markers zoals Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15 en vasa. Deze figuur toont de transcriptniveaus van deze markers in 10 LCS relatief aan 10 pasgeboren muis-cyten.De resultaten laten zien dat de LCS minder ZPC tot expressie brengen dan cytes. Aangezien ZPC een component is van de CYTE-specifieke zop lucidum-membraanstructuur, kan dit de fragiele aard en het dunnere zita-membraan van lcs verklaren. De expressie van het meiose-eiwit SCP three is hoger in de LCS vergeleken met natuurlijke cytes.Een andere meiose-marker, CMOs, wordt echter op een lager niveau tot expressie gebracht. Dit verschil in expressieniveaus kan mogelijk mede verklaren waarom LCS momenteel de meiose niet voltooid. Andere markers, zoals BMP 15 en vasa, vertonen geen significant verschil tussen LCS- en O-locaties.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gezondheid van de startpopulatie stamcellen cruciaal is voor het succes ervan.

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

We beschrijven de dissectie en ex vivo cultuur van muis embryonale huid. De cultuur systeem houdt een lucht-vloeistof-interface over het weefsel oppervlak en maakt beeldvorming op een omgekeerde microscoop. Melanoblasten, een component van de ontwikkeling huid, worden fluorescerend gemerkte waardoor hun gedrag wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie.

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Epidermale keratinocyten vormen een functionele huidbarrière en worden gepositioneerd in de voorste lijn van de gastheerverdediging tegen externe milieubeledigingen. Hier beschrijven we methoden voor isolatie en primaire cultuur van epidermale keratinocyten van neonatale en volwassen muishuid, en inductie van terminale differentiatie en UVB-geactiveerde ontstekingsrespons van keratinocyten.

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Leer hoe huidstamcellen van pasgeboren muizen worden gedifferentieerd naar oocytachtige cellen in vitro. Deze methode ondersteunt onderzoek naar kiemcelvorming en voortplantingsbiologie.

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen

Meer video's verkennen