Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy
27 juni 2013
Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).
Het algemene doel van het volgende experiment is om de elastische modulus van levende cellen te meten met behulp van een atoomkrachtmicroscoop. Dit wordt bereikt door eerst een FM-krachtspectroscopiemeting uit te voeren op verschillende locaties op de cel. Als tweede stap wordt elke gedwongen afstandscurve geanalyseerd om het punt te bepalen waarop de A FM-tip voor het eerst contact maakt met de cel.
Vervolgens, beginnend bij het contactpunt, worden de eerste 200 tot 300 nanometer indrukgevingsgegevens aangepast aan het hertz-model. Om de elastische modulus te extraheren, leveren de resultaten een 2D-kaart van de celstijfheid op verkregen door de krachtmappingmodus te gebruiken waarbij elk pixel een enkele gedwongen afstandscurve vertegenwoordigt. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedaan door Guen Thomas, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, maakt u de cantileverhouder schoon met 70% ethanol en laat deze drogen.
Laad vervolgens een bru DNP 10 cantilever in de A FM volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens kalibreer de inverse optische hefboomgevoeligheid. Deze parameter beschrijft de hoeveelheid fotodioderespons in volt per nanometer van de cantileverafbuiging.
Om dit te bereiken, laadt u eerst een schone glazen plaat op de monsterstandaard. Installeer de a FM-kop en pas de laserstraal en uitlijning aan volgens de instructies van de fabrikant. Eenmaal uitgelijnd, zet de A FM-tip op de glazen plaat met de P acht O teruggetrokken.
Lijn de spiegel opnieuw uit naar een fotodiode-aflezing van min twee volt. Voer vervolgens een krachtspectroscopiemeting uit met een maximale fotodioderespons of triggerpunt van positief twee volt. Nadat de gegevensverzameling voltooid is, zoom in op het vaste contactgebied van de krachtcurve en voer een lineaire aanpassing uit voor dit gebied.
Om de helling in volt per nanometer te vinden, stelt u de spiegeluitlijning vervolgens terug naar een vrije afbuiging van nul volt. Vervolgens kalibreert u de veerconstante van de cantilever met behulp van de thermische afstemmingsmethode beschreven door Levy en Malam. Om te beginnen, heft u de scanner op van de monsterstandaard zodat er geen interacties zijn tussen de tip en het monster.
Vervolgens vangt u de thermische gegevens op door de thermische trilling van de cantileverbalk op te nemen. De A FM-software analyseert een vermogensspectrum van zo'n thermische trilling en geeft het weer in een datavenster. Voer vervolgens een aanpassing uit op het datasegment gecentreerd op de laagste frequentie, ook bekend als de fundamentele resonantiepiek om de veerconstante te bepalen.
Om de a FM voor te bereiden op de kweekplaten, installeert u een schotelverwarmingsaccessoire op de a FM-standaard en stelt u de temperatuur in op 37 graden Celsius. Wacht 20 minuten tot het systeem een stabiel thermisch evenwicht heeft bereikt. Eenmaal voorverwarmd, plaatst u een kweekschotel op de a FM-standaard en bevestigt u deze met behulp van de klem die bij de schotelverwarming wordt geleverd voor metingen langer dan 30 minuten, koolstofdioxide onafhankelijk medium moet worden gebruikt om het normale kweekmedium te vervangen.
Breng vervolgens een kleine druppel kweekmedium van 37 graden Celsius aan op de tip van de A FM-cantilever en laat de a FM-kop zakken tot de tip net ondergedompeld is in vloeistof. Gebruik een CCD-camera met bovenuitzicht om de laserstraal op de cantilever opnieuw uit te lijnen. De uitlijning in vloeistof zal anders zijn dan in de lucht vanwege de verandering in de brekingsindex van het medium.
Eenmaal uitgelijnd, zet de A FM-tip op een celvrije zone van de kweekschotel en voer de kalibratie van de inverse optische hefboomgevoeligheid in de vloeistofomgeving uit. Om mechanische eigenschapsmetingen van cellen te beginnen, plaatst u de cantilevertip boven het perle-ooggebied van een cel met behulp van een optische microscoop. Nauwkeurige aanpassingen van de cantileverpositie worden bereikt door offsets toe te passen op de X- en Y-scanners.
Schakel vervolgens de a FM in de vier-spectroscopiemodus en stel de indruksnelheid in op vijf micrometer per seconde, wat laag genoeg is om hydrodynamische effecten te voorkomen. Stel vervolgens het triggerpunt van de uitwijking in op twee nanonewton. Om schade aan de cellen te voorkomen, pas deze waarde aan volgens de stijfheid van het monster.
Selecteer bovendien de relatieve triggeroptie, die corrigeert voor eventuele drift in het uitwijkingssignaal. Stel vervolgens de krachtafstand in op vijf micrometer om ervoor te zorgen dat de tip volledig loskomt van de cel tussen krachtmetingen. Verzamel drie krachtcurven op verschillende locaties in de kernregio van minstens 30 cellen voor elke conditie.
Hoewel het voordelig is om meerdere curven op elke cel te nemen. Voor betrouwbare statistische gegevens kan het nemen van te veel leiden tot veranderingen in de celstijfheid tot stress van de A FM-sonde. Karakteriseer verder de verdeling van mechanische eigenschappen door een enkele cel met behulp van de krachtmappingmodus.
In de krachtmappingmodus, stelt u de scangrootte in op 30 micrometer de resolutie op 32 bij 32, en de indrukparameters zijn dezelfde als die geselecteerd voor enkele krachtcurven. De A FM neemt vervolgens enkele krachtcurven op elk pixel in het monsterstuk en biedt een stijfheidskaart van het hele gebied. Analyseer vervolgens de opgenomen krachtcurven met behulp van MATLAB om de celstijfheid te berekenen.
Begin met het adopteren van een algoritme dat voor het eerst is gepubliceerd door Lynette Al, dat zowel een lineaire fit als hertz-fit berekent van elk punt met behulp van matlab. Bereken de relatieve RMS-fout van beide fits en som deze waarden op elk punt. Het punt dat het minimale totale aanpassingsfout bereikt, wordt geselecteerd als het initiële contactpunt. Het lokaliseren van dit punt is cruciaal voor nauwkeurige meting van de young's modulus van de cel.
Bereken vervolgens de monsterdeformatie delta. Gebruik de volgende vergelijkingen waarbij de vervorming gelijk is aan nul vóór celcontact waar Z kleiner is dan Z nul en gelijk is aan het verschil tussen de cantileverafbuiging D en de totale afstand Z voorbij het contactpunt. Bereken vervolgens
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit document demonstreert een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van micro-indentatie met behulp van een Atomic Force Microscope (AFM). De studie richt zich op het meten van de elastische modulus van levende cellen door middel van krachtspectroscopie en data-analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celmechanica
- Biofysica
- Atomic Force Microscopy
Achtergrond
- Het begrijpen van de mechanische eigenschappen van cellen is cruciaal voor verschillende biologische toepassingen.
- Atomic Force Microscopy (AFM) maakt hoge resolutie metingen van celstijfheid mogelijk.
- Elastische modulus is een sleutelparameter bij het beoordelen van mechanische eigenschappen van cellen.
- Krachtmapping kan gedetailleerde inzichten geven in de ruimtelijke variatie van celstijfheid.
Doel van de studie
- Om de elastische modulus van levende cellen te meten met behulp van AFM.
- Om een protocol te ontwikkelen voor het karakteriseren van mechanische eigenschappen van cellen.
- Om een 2D kaart van celstijfheid te creëren op basis van krachtmapping data.
Gebruikte methoden
- FM krachtspectroscopie metingen op verschillende locaties op de cel.
- Analyse van geforceerde afstandcurves om contactpunten te bepalen.
- Aanpassen van indentatiedata aan het Hertz model voor extractie van elastische modulus.
- Krachtmapping modus om een 2D kaart van de celstijfheid te genereren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van de elastische modulus van levende cellen.
- Creatie van een gedetailleerde 2D kaart die variaties in celstijfheid toont.
- Demonstratie van het protocol door een afstudeerstudent.
- Etablissement van een betrouwbare methode voor het karakteriseren van mechanische eigenschappen van cellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die celmechanica bestuderen.
- AFM-gebaseerde metingen kunnen het begrip van cellulair gedrag verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bestuderen van ziektetoestanden en cellulaire reacties omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of cell mechanical properties using atomic force microscopy (AFM) enables biopharma teams to assess cellular responses to microenvironmental changes, supporting early discovery and target validation. Reliable stiffness mapping informs mechanistic de-risking and predictive confidence in disease-relevant systems, directly impacting portfolio triage and translational research. Integrating AFM-based elasticity measurements strengthens decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell stiffness as a functional biomarker for physiological or pathological states.
- Supports mechanistic de-risking by correlating cytoskeletal changes with disease models or compound effects.
- Facilitates hypothesis testing regarding cellular responses to substrate or genetic perturbations.
- Provides quantitative endpoints for target validation in cell-based assays.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative force curves and stiffness maps for assay standardization.
- Enables high-content screening of mechanical phenotypes across multiple cell conditions.
- Supports development of robust, scalable assays for compound evaluation targeting cell mechanics.
- Improves assay readiness by integrating force mapping with automated data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical property measurements with disease-relevant phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking cell mechanics to functional outcomes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, physiologically relevant data.
- Supports predictive de-risking in preclinical models by mapping mechanical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based cell stiffness measurement fits within the early discovery to preclinical continuum, providing a bridge between mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative force mapping clarifies cellular responses and de-risks biological hypotheses.
- Screening: Standardized force spectroscopy outputs enable reproducible comparison across conditions and compounds.
- Analytics: MATLAB-based analysis yields quantitative Young's modulus values and spatial stiffness maps for robust data interpretation.
- Translational Research: Mechanical phenotyping aligns with disease models and supports biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: AFM protocols and analysis routines are adaptable across cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based models.
- Operational Value: Standardizes mechanical property measurement and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on functional cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, force spectroscopy, and quantitative data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and compatible analysis software (e.g., MATLAB routines).
- Necessitates cross-team standardization of calibration, measurement, and analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and substrates with careful adjustment of indentation parameters.
- Potential limitations include probe-induced cell stress and the need for careful contact point identification.
