Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is het meten van de elasticiteitsmodulus van levende cellen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop. Dit wordt bereikt door eerst FM-krachtspectroscopie-metingen uit te voeren op verschillende locaties op de cel. Als tweede stap wordt elke kracht-afstandscurve geanalyseerd om het punt te bepalen waarop de AFM-tip initieel contact maakt met de cel.

Vervolgens worden, beginnend bij het contactpunt, de eerste 200 tot 300 nanometer van de indentatiedata gefit aan het Hertz-model. Om de elasticiteitsmodulus te extraheren, leveren de resultaten een 2D-kaart van de celstijfheid op, verkregen door gebruik te maken van de force mapping-modus waarbij elke pixel een enkele kracht-afstandscurve vertegenwoordigt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Guen Thomas, een promovendus uit mijn laboratorium. Om met deze procedure te beginnen, reinigt u de cantileverhouder met 70% ethanol en laat u deze drogen.

Laad vervolgens een bru DNP 10 cantilever in de AFM volgens de instructies van de fabrikant. Kalibreer daarna de gevoeligheid van de inverse optische hefboom. Deze parameter beschrijft de respons van de fotodiode in volt per nanometer cantilever-uitwijking.

Om dit te bereiken, plaatst u eerst een schoon glazen objectglas op de monsterhouder. Installeer de AFM-kop en stel de laserstraal en de uitlijning in volgens de instructies van de fabrikant. Zodra de uitlijning is voltooid, brengt u de AFM-tip in contact met het glazen objectglas terwijl de P8O is teruggetrokken.

Lijn de spiegel opnieuw uit tot een fotodiodereading van min twee volt. Voer vervolgens een krachtspectroscopiemeting uit met een maximale fotodiode-respons of triggerpunt van plus twee volt. Nadat de gegevensverwerving is voltooid, zoomt u in op het gebied van vast contact van de krachtcurve en voert u een lineaire fit uit op dit gebied.

Om de helling in volt per nanometer te bepalen, moet de spiegeluitlijning vervolgens worden gereset naar een vrije doorbuiging van nul volt. Kalibreer daarna de veerconstante van de cantilever met de thermische tuningmethode beschreven door Levy en Malam. Begin hiermee door de scanner weg van de monsterhouder te bewegen, zodat er geen interacties plaatsvinden tussen de tip en het monster.

Leg vervolgens de thermische gegevens vast door de thermische vibratie van de cantileverbalk te registreren. De AFM-software analyseert een vermogensspectrum van een dergelijke thermische vibratie en plot dit in een gegevensvenster. Voer vervolgens een fit uit op het gegevenssegment dat gecentreerd is rond de laagste frequentie, ook wel de fundamentele resonantiepiek genoemd, om de veerconstante te bepalen.

Om de AFM voor de kweekplaten voor te bereiden, installeert u een schaaltjesverwarming op de AFM-tafel en stelt u de temperatuur in op 37 °C. Wacht 20 minuten tot het systeem een stabiel thermisch evenwicht heeft bereikt. Plaats na het voorverwarmen een kweekschaaltje op de AFM-tafel en zet dit vast met de klem die bij de schaaltjesverwarming is geleverd; voor metingen langer dan 30 minuten moet een CO₂-onafhankelijk medium worden gebruikt ter vervanging van het normale kweekmedium.

Breng vervolgens een kleine druppel kweekmedium van 37 °C aan op de punt van de AFM-cantilever en laat de AFM-kop zakken tot de punt net in de vloeistof is ondergedompeld. Gebruik een CCD-camera voor bovenaanzicht om de laserstraal op de cantilever opnieuw uit te lijnen. De uitlijning in vloeistof zal verschillen van die in lucht vanwege de verandering in de brekingsindex van het medium.

Zodra de uitlijning is voltooid, wordt de AFM-tip op een celvrij gebied van de kweekschaal geplaatst om de kalibratie van de gevoeligheid van de inverse optische hefboom in de vloeistofomgeving uit te voeren. Om de metingen van de mechanische eigenschappen van cellen te starten, wordt de tip van de cantilever met behulp van een optische microscoop boven het perle-ooggebied van een cel gepositioneerd. Nauwkeurige aanpassingen van de positie van de cantilever worden gerealiseerd door offsets toe te passen op de X- en Y-scanners.

Schakel vervolgens de AFM in naar de spectroscopiemodus en stel de indentatiesnelheid in op 5 µm/s, wat laag genoeg is om hydrodynamische effecten te vermijden. Stel daarna het triggerpunt voor de deflectie in op 2 nN. Pas deze waarde aan op basis van de stijfheid van het monster om beschadiging van de cellen te voorkomen.

Select daarnaast de optie voor relatieve triggering, wat eventuele drift in het deflectiesignaal zal corrigeren. Stel vervolgens de krachtafstand in op vijf micrometer om ervoor te zorgen dat de tip tussen de krachtmetingen volledig losgekoppeld is van de cel. Verzamel drie krachtcurven op verschillende locaties in het kerngebied van ten minste 30 cellen per conditie.

Hoewel het voordelig is om meerdere curves per cel op te nemen, kan het opnemen van te veel curves voor betrouwbare statistische gegevens leiden tot veranderingen in de celstijfheid door stress van de AFM-probe. Karakteriseer de distributie van de mechanische eigenschappen over een enkele cel verder met behulp van de force map-modus.

Stel in de force map-modus de scantestgrootte in op 30 micrometers, de resolutie op 32 bij 32, en hanteer voor de indentatieparameters dezelfde instellingen als die zijn geselecteerd voor enkele krachtcurves. De AFM neemt vervolgens enkele krachtcurves op bij elke pixel in het monstergebied en levert een stijfheidskaart van het gehele gebied. Analyseer vervolgens de geregistreerde krachtcurves met MATLAB om de celstijfheid te berekenen.

Begin met het toepassen van een algoritme, voor het eerst gepubliceerd door Lynette Al, dat met behulp van MATLAB zowel een lineaire fit als een Hertz-fit voor elk punt berekent. Bereken de relatieve RMS-fout van beide fits en tel deze waarden bij elk punt bij elkaar op. Het punt waarop de minimale totale fitfout wordt behaald, wordt geselecteerd als het initiële contactpunt; het lokaliseren van dit punt is cruciaal voor een nauwkeurige meting van de Young-modulus van de cellen.

Bereken vervolgens de vervorming delta van het monster. Gebruik hiervoor de volgende vergelijkingen, waarbij de vervorming gelijk is aan nul vóór het celcontact (wanneer Z kleiner is dan Z nul) en gelijk is aan het verschil tussen de doorbuiging D van de cantilever en de totale afstand Z voorbij het contactpunt. Bereken daarna de indrukkracht F met behulp van de volgende vergelijkingen, waarbij de kracht gelijk is aan nul vóór het celcontact (wanneer Z kleiner is dan Z nul) en gelijk is aan de veerconstante K van de cantilever vermenigvuldigd met de doorbuiging van de cantilever voorbij het contactpunt.

De fit van Elise square wordt vervolgens toegepast op de gegevens van monsterdeformatie versus indrukkingskracht in het post-contactgebied van het Hertz-model, om de Young-modulus van de cel te bepalen op basis van de vorm van de gebruikte tip zoals getoond. Hier zijn representatieve krachtcurves van drie T3-fibroblastcellen die zijn gekweekt op drie verschillende oppervlakken. Zoals hier te zien is, kunnen verschillende oppervlakken de stijfheid van het celcytoskelet sterk beïnvloeden.

De gemiddelde vervorming van cellen die zijn gekweekt op een hard plastic oppervlak wordt in het rood weergegeven. Cellen die zijn gegroeid op een stijve polyacrylamidegel worden in het paars weergegeven, en cellen die zijn gegroeid op een elastische polyacrylamidegel worden in het blauw weergegeven. Na een zorgvuldige identificatie van de contactpunten in de curven kunnen de indrukingskrachten als functie van de celvervorming nauwkeurig worden weergegeven.

Daarnaast kan hun Young-modulus nauwkeurig worden berekend op basis van de eerste 300 nanometers van de indentatie na contact. Hier wordt een fibroblast getoond die is getransfecteerd met menton gelabeld met groen fluorescent eiwit, een type intermediair filament. Hoe helderder het beeld, hoe meer menton er in dat gebied aanwezig is.

Dit kan gerelateerd zijn aan de stijfheid van het cytoskelet van de cel. Met de hier gepresenteerde AFM-krachtmappingtechniek is het mogelijk om een soortgelijke stijfheidskaart van een fibroblast weer te geven met een resolutie van 32 bij 32 pixels, waarbij elke pixel een celoppervlak van 2,5 bij 2,5 microns vertegenwoordigt. Na het bekijken van deze video heeft u een goed beeld van hoe u atoomkrachtmicroscopie kunt gebruiken om de elasticiteit van levende weefselcellen te meten.