Cellen passeren
Passaging, of subcultiveren, van cellen, is een veelvoorkomende procedure waarbij cellen uit een bepaalde cultuur worden verdeeld, of “gesplitst”, in nieuwe culturen en gevoed met vers medium om verdere uitbreiding te vergemakkelijken. Hoewel het concept zelf relatief eenvoudig is, zullen we in deze video enkele van de belangrijkste stappen bespreken voor het succesvol onderhoud en de uitbreiding van cellijnen.
Toxische metabolieten accumuleren in celcultuurmedia in de loop van de tijd. Bij het uitbreiden van cellen is het vooral belangrijk om het medium regelmatig te verversen om de celgezondheid te behouden en om de celuitbreiding te controleren om celovergroei te voorkomen.
Over het algemeen worden twee hoofdtypen cellen gesubcultiveerd: geïmmortaliseerde cellijnen en stamcellenijnen
Geïmmortaliseerde cellijnen zijn cellen die zijn afgeleid van meercellige organismen die een soort mutatie hebben ondergaan die hun celcyclusregulatie beïnvloedt, waardoor ze zich oneindig kunnen vermenigvuldigen. Misschien wel de bekendste geïmmortaliseerde cellijn is de HeLa-cellijn, die werd afgeleid van een cervicaal carcinoom gevonden op een biopsie genomen van mevrouw Henrietta Lacks in 1951.
In tegenstelling tot door kanker geïmmortaliseerde cellijnen, worden stamcellenijnen gegenereerd door het isoleren van zelfvernieuwende en multipotente cellen uit een verscheidenheid aan weefsels, zowel uit volwassen als embryonale weefsels. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze cellen, zoals de menselijke embryonale stamcellen die u hier ziet, oneindig in cultuur worden bewaard.
Cellen worden ofwel optimaal in suspensie gekweekt, zoals geïmmortaliseerde cellen geïsoleerd uit bloed, of ze groeien het beste wanneer ze zich hechten aan een oppervlak, zoals het geval is voor veel weefsel-afgeleide cellen.
De groei van deze adherende cellen moet nauwlettend worden gecontroleerd om de celgezondheid te waarborgen. Afhankelijk van het celtype moeten de meeste adherende cellen worden gepasseerd wanneer ze 70-90% confluent zijn, dat wil zeggen wanneer ze 70-90% van het oppervlak van de cultuurcontainer bedekken.
Houd er rekening mee dat cellijnen veel kenmerken van de oorspronkelijke celcultuur behouden, maar met elke opeenvolgende passage kunnen ze ook kenmerken beginnen te verwerven die uniek zijn voor de uitgebreide cultuur. Overweeg daarom om het aantal keren te beperken dat u een individuele celcultuur blijft passeren.
Bij het passeren van cellen is het belangrijk om een steriele techniek en de juiste reagentia en apparatuur te gebruiken.
Het is essentieel om het juiste medium te gebruiken voor de optimale groei en uitbreiding van uw cellijn. Elke cellijn heeft een specifiek groeisuppletiecocktail nodig, maar de meeste cellijnen hebben minimaal de volgende suppletie nodig: Serum, zoals foetaal bovien serum, dat moet worden warmtebehandeld om het boviene complement te inactiveren en dat vitale groeifactoren voor de cellen levert, antibiotica, zoals penicilline en streptomycine, die helpen bij het beperken van verontreinigende groei in de cultuur, en andere groeifactoren, zoals fibroblastgroeifactor, om de groei en uitbreiding van de cellijnen te helpen verlengen. Bewaar het gesupplementeerde, of “volledige”, celcultuurmedium bij 4 C wanneer u het niet gebruikt.
Let eerst op de kleur van het weefselkweekmedium. Vers, celkweekmedium is rijk aan voedingsstoffen en heeft een heldere, oranje kleur, deels vanwege de toevoeging van de pH-indicator, fenolrood.
Naarmate cellen voedingsstoffen in het medium beginnen te gebruiken, beginnen afval en zuur zich op te hopen in de celcultuur, waardoor de pH daalt. Om deze reden bevatten veel weefselkweekmedia fenolrood, dat het medium van oranje naar geel verandert wanneer cellen de cultuur zuur maken. Ververs het medium voordat het deze kleur krijgt!
Wanneer het fenolrood het medium een roze kleur geeft, wat aangeeft dat de pH te basaal is geworden voor gezonde celgroei, is het misschien tijd om uw CO2-tank evenals uw medium te vervangen.
De meeste adherente cellijnen hechten zich natuurlijk aan ongecoat plastic. Daarom worden plastic celkweekplaten, zoals petrischalen of 6-welplaten, vaak gebruikt voor het subcultiveren van cellen.
Er worden ook plastic celkweekkolven gebruikt. De T25 celkweekkolf wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om kleine celpopulaties uit te breiden of om de groei van een langzaam uitbreidende cellijn te starten. T75-kweekkolven worden vaak gebruikt voor cellijnen die zich sneller vermenigvuldigen of om grotere aantallen cellen te genereren dan in een T25-kolf passen.
Bij het verwijderen van adherente cellen moeten de eiwitten die de cellen aan het plastic binden, eerst worden afgesneden. Voor dit doel wordt het spijsverteringsenzym trypsine vaak gebruikt. Het is belangrijk om de blootstelling aan trypsine zorgvuldig te timen, omdat te langdurige behandeling kan leiden tot schade aan andere celoppervlakte-eiwitten.
Celkweekmedium kan trypsineneutralisatoren bevatten. Daarom wordt fosfaatgebufferd zoutoplossing, of PBS, vaak gebruikt om de cellen te wassen voordat ze worden getrypsiniseerd.
EDTA, een calciumchelator, wordt soms ook gebruikt om de proteolytische functie van trypsine te verbeteren.
Voor de uitbreiding van de celkolonie worden de vers gepasseerde cellen vervolgens gekweekt in een celkweekincubator onder de omstandigheden die geschikt zijn voor die cellijn, meestal bij ongeveer 37 C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
Voordat u begint, is het belangrijk om te begrijpen hoe vaak uw cellen moeten worden gecontroleerd, wat afhankelijk is van hoe snel uw cellen zich vermenigvuldigen.
Nu uw medium een gelukkige oranje kleur heeft, observeer de andere kweekomstandigheden, zoals of de cultuur troebel is – mogelijk een indicatie van besmetting –, de grootte en dichthe
Cellijnen worden vaak gebruikt in biomedische experimenten, omdat ze een snelle kweek en uitbreiding van celtypen mogelijk maken voor experimentele an…
Passaging, of subcultiveren, van cellen, is een veelvoorkomende procedure waarbij cellen uit een bepaalde cultuur worden verdeeld, of “gesplitst”, in nieuwe culturen en gevoed met vers medium om verdere uitbreiding te vergemakkelijken. Hoewel het concept zelf relatief eenvoudig is, zullen we in deze video enkele van de belangrijkste stappen bespreken voor het succesvol onderhoud en de uitbreiding van cellijnen.
Toxische metabolieten accumuleren in celcultuurmedia in de loop van de tijd. Bij het uitbreiden van cellen is het vooral belangrijk om het medium regelmatig te verversen om de celgezondheid te behouden en om de celuitbreiding te controleren om celovergroei te voorkomen.
Over het algemeen worden twee hoofdtypen cellen gesubcultiveerd: geïmmortaliseerde cellijnen en stamcellenijnen
Geïmmortaliseerde cellijnen zijn cellen die zijn afgeleid van meercellige organismen die een soort mutatie hebben ondergaan die hun celcyclusregulatie beïnvloedt, waardoor ze zich oneindig kunnen vermenigvuldigen. Misschien wel de bekendste geïmmortaliseerde cellijn is de HeLa-cellijn, die werd afgeleid van een cervicaal carcinoom gevonden op een biopsie genomen van mevrouw Henrietta Lacks in 1951.
In tegenstelling tot door kanker geïmmortaliseerde cellijnen, worden stamcellenijnen gegenereerd door het isoleren van zelfvernieuwende en multipotente cellen uit een verscheidenheid aan weefsels, zowel uit volwassen als embryonale weefsels. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze cellen, zoals de menselijke embryonale stamcellen die u hier ziet, oneindig in cultuur worden bewaard.
Cellen worden ofwel optimaal in suspensie gekweekt, zoals geïmmortaliseerde cellen geïsoleerd uit bloed, of ze groeien het beste wanneer ze zich hechten aan een oppervlak, zoals het geval is voor veel weefsel-afgeleide cellen.
De groei van deze adherende cellen moet nauwlettend worden gecontroleerd om de celgezondheid te waarborgen. Afhankelijk van het celtype moeten de meeste adherende cellen worden gepasseerd wanneer ze 70-90% confluent zijn, dat wil zeggen wanneer ze 70-90% van het oppervlak van de cultuurcontainer bedekken.
Houd er rekening mee dat cellijnen veel kenmerken van de oorspronkelijke celcultuur behouden, maar met elke opeenvolgende passage kunnen ze ook kenmerken beginnen te verwerven die uniek zijn voor de uitgebreide cultuur. Overweeg daarom om het aantal keren te beperken dat u een individuele celcultuur blijft passeren.
Bij het passeren van cellen is het belangrijk om een steriele techniek en de juiste reagentia en apparatuur te gebruiken.
Het is essentieel om het juiste medium te gebruiken voor de optimale groei en uitbreiding van uw cellijn. Elke cellijn heeft een specifiek groeisuppletiecocktail nodig, maar de meeste cellijnen hebben minimaal de volgende suppletie nodig: Serum, zoals foetaal bovien serum, dat moet worden warmtebehandeld om het boviene complement te inactiveren en dat vitale groeifactoren voor de cellen levert, antibiotica, zoals penicilline en streptomycine, die helpen bij het beperken van verontreinigende groei in de cultuur, en andere groeifactoren, zoals fibroblastgroeifactor, om de groei en uitbreiding van de cellijnen te helpen verlengen. Bewaar het gesupplementeerde, of “volledige”, celcultuurmedium bij 4 C wanneer u het niet gebruikt.
Let eerst op de kleur van het weefselkweekmedium. Vers, celkweekmedium is rijk aan voedingsstoffen en heeft een heldere, oranje kleur, deels vanwege de toevoeging van de pH-indicator, fenolrood.
Naarmate cellen voedingsstoffen in het medium beginnen te gebruiken, beginnen afval en zuur zich op te hopen in de celcultuur, waardoor de pH daalt. Om deze reden bevatten veel weefselkweekmedia fenolrood, dat het medium van oranje naar geel verandert wanneer cellen de cultuur zuur maken. Ververs het medium voordat het deze kleur krijgt!
Wanneer het fenolrood het medium een roze kleur geeft, wat aangeeft dat de pH te basaal is geworden voor gezonde celgroei, is het misschien tijd om uw CO2-tank evenals uw medium te vervangen.
De meeste adherente cellijnen hechten zich natuurlijk aan ongecoat plastic. Daarom worden plastic celkweekplaten, zoals petrischalen of 6-welplaten, vaak gebruikt voor het subcultiveren van cellen.
Er worden ook plastic celkweekkolven gebruikt. De T25 celkweekkolf wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om kleine celpopulaties uit te breiden of om de groei van een langzaam uitbreidende cellijn te starten. T75-kweekkolven worden vaak gebruikt voor cellijnen die zich sneller vermenigvuldigen of om grotere aantallen cellen te genereren dan in een T25-kolf passen.
Bij het verwijderen van adherente cellen moeten de eiwitten die de cellen aan het plastic binden, eerst worden afgesneden. Voor dit doel wordt het spijsverteringsenzym trypsine vaak gebruikt. Het is belangrijk om de blootstelling aan trypsine zorgvuldig te timen, omdat te langdurige behandeling kan leiden tot schade aan andere celoppervlakte-eiwitten.
Celkweekmedium kan trypsineneutralisatoren bevatten. Daarom wordt fosfaatgebufferd zoutoplossing, of PBS, vaak gebruikt om de cellen te wassen voordat ze worden getrypsiniseerd.
EDTA, een calciumchelator, wordt soms ook gebruikt om de proteolytische functie van trypsine te verbeteren.
Voor de uitbreiding van de celkolonie worden de vers gepasseerde cellen vervolgens gekweekt in een celkweekincubator onder de omstandigheden die geschikt zijn voor die cellijn, meestal bij ongeveer 37 C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
Voordat u begint, is het belangrijk om te begrijpen hoe vaak uw cellen moeten worden gecontroleerd, wat afhankelijk is van hoe snel uw cellen zich vermenigvuldigen.
Nu uw medium een gelukkige oranje kleur heeft, observeer de andere kweekomstandigheden, zoals of de cultuur troebel is – mogelijk een indicatie van besmetting –, de grootte en dichthe
Passaging, of subcultiveren, van cellen, is een veelvoorkomende procedure waarbij cellen uit een bepaalde cultuur worden verdeeld, of “gesplitst”, in nieuwe culturen en gevoed met vers medium om verdere uitbreiding te vergemakkelijken. Hoewel het concept zelf relatief eenvoudig is, zullen we in deze video enkele van de belangrijkste stappen bespreken voor het succesvol onderhoud en de uitbreiding van cellijnen.
Toxische metabolieten accumuleren in celcultuurmedia in de loop van de tijd. Bij het uitbreiden van cellen is het vooral belangrijk om het medium regelmatig te verversen om de celgezondheid te behouden en om de celuitbreiding te controleren om celovergroei te voorkomen.
Over het algemeen worden twee hoofdtypen cellen gesubcultiveerd: geïmmortaliseerde cellijnen en stamcellenijnen
Geïmmortaliseerde cellijnen zijn cellen die zijn afgeleid van meercellige organismen die een soort mutatie hebben ondergaan die hun celcyclusregulatie beïnvloedt, waardoor ze zich oneindig kunnen vermenigvuldigen. Misschien wel de bekendste geïmmortaliseerde cellijn is de HeLa-cellijn, die werd afgeleid van een cervicaal carcinoom gevonden op een biopsie genomen van mevrouw Henrietta Lacks in 1951.
In tegenstelling tot door kanker geïmmortaliseerde cellijnen, worden stamcellenijnen gegenereerd door het isoleren van zelfvernieuwende en multipotente cellen uit een verscheidenheid aan weefsels, zowel uit volwassen als embryonale weefsels. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze cellen, zoals de menselijke embryonale stamcellen die u hier ziet, oneindig in cultuur worden bewaard.
Cellen worden ofwel optimaal in suspensie gekweekt, zoals geïmmortaliseerde cellen geïsoleerd uit bloed, of ze groeien het beste wanneer ze zich hechten aan een oppervlak, zoals het geval is voor veel weefsel-afgeleide cellen.
De groei van deze adherende cellen moet nauwlettend worden gecontroleerd om de celgezondheid te waarborgen. Afhankelijk van het celtype moeten de meeste adherende cellen worden gepasseerd wanneer ze 70-90% confluent zijn, dat wil zeggen wanneer ze 70-90% van het oppervlak van de cultuurcontainer bedekken.
Houd er rekening mee dat cellijnen veel kenmerken van de oorspronkelijke celcultuur behouden, maar met elke opeenvolgende passage kunnen ze ook kenmerken beginnen te verwerven die uniek zijn voor de uitgebreide cultuur. Overweeg daarom om het aantal keren te beperken dat u een individuele celcultuur blijft passeren.
Bij het passeren van cellen is het belangrijk om een steriele techniek en de juiste reagentia en apparatuur te gebruiken.
Het is essentieel om het juiste medium te gebruiken voor de optimale groei en uitbreiding van uw cellijn. Elke cellijn heeft een specifiek groeisuppletiecocktail nodig, maar de meeste cellijnen hebben minimaal de volgende suppletie nodig: Serum, zoals foetaal bovien serum, dat moet worden warmtebehandeld om het boviene complement te inactiveren en dat vitale groeifactoren voor de cellen levert, antibiotica, zoals penicilline en streptomycine, die helpen bij het beperken van verontreinigende groei in de cultuur, en andere groeifactoren, zoals fibroblastgroeifactor, om de groei en uitbreiding van de cellijnen te helpen verlengen. Bewaar het gesupplementeerde, of “volledige”, celcultuurmedium bij 4 C wanneer u het niet gebruikt.
Let eerst op de kleur van het weefselkweekmedium. Vers, celkweekmedium is rijk aan voedingsstoffen en heeft een heldere, oranje kleur, deels vanwege de toevoeging van de pH-indicator, fenolrood.
Naarmate cellen voedingsstoffen in het medium beginnen te gebruiken, beginnen afval en zuur zich op te hopen in de celcultuur, waardoor de pH daalt. Om deze reden bevatten veel weefselkweekmedia fenolrood, dat het medium van oranje naar geel verandert wanneer cellen de cultuur zuur maken. Ververs het medium voordat het deze kleur krijgt!
Wanneer het fenolrood het medium een roze kleur geeft, wat aangeeft dat de pH te basaal is geworden voor gezonde celgroei, is het misschien tijd om uw CO2-tank evenals uw medium te vervangen.
De meeste adherente cellijnen hechten zich natuurlijk aan ongecoat plastic. Daarom worden plastic celkweekplaten, zoals petrischalen of 6-welplaten, vaak gebruikt voor het subcultiveren van cellen.
Er worden ook plastic celkweekkolven gebruikt. De T25 celkweekkolf wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om kleine celpopulaties uit te breiden of om de groei van een langzaam uitbreidende cellijn te starten. T75-kweekkolven worden vaak gebruikt voor cellijnen die zich sneller vermenigvuldigen of om grotere aantallen cellen te genereren dan in een T25-kolf passen.
Bij het verwijderen van adherente cellen moeten de eiwitten die de cellen aan het plastic binden, eerst worden afgesneden. Voor dit doel wordt het spijsverteringsenzym trypsine vaak gebruikt. Het is belangrijk om de blootstelling aan trypsine zorgvuldig te timen, omdat te langdurige behandeling kan leiden tot schade aan andere celoppervlakte-eiwitten.
Celkweekmedium kan trypsineneutralisatoren bevatten. Daarom wordt fosfaatgebufferd zoutoplossing, of PBS, vaak gebruikt om de cellen te wassen voordat ze worden getrypsiniseerd.
EDTA, een calciumchelator, wordt soms ook gebruikt om de proteolytische functie van trypsine te verbeteren.
Voor de uitbreiding van de celkolonie worden de vers gepasseerde cellen vervolgens gekweekt in een celkweekincubator onder de omstandigheden die geschikt zijn voor die cellijn, meestal bij ongeveer 37 C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
Voordat u begint, is het belangrijk om te begrijpen hoe vaak uw cellen moeten worden gecontroleerd, wat afhankelijk is van hoe snel uw cellen zich vermenigvuldigen.
Nu uw medium een gelukkige oranje kleur heeft, observeer de andere kweekomstandigheden, zoals of de cultuur troebel is – mogelijk een indicatie van besmetting –, de grootte en dichthe
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between immortalized cell lines and stem cell lines?
Immortalized cell lines derive from multicellular organisms with mutations affecting cell cycle regulation, allowing indefinite proliferation. Stem cell lines are generated by isolating self-renewing, multipotent cells from adult or embryonic tissues. Both can be maintained indefinitely in culture under appropriate conditions, but stem cells retain pluripotency while immortalized cells do not.
Q2: Why is it important to change cell culture media regularly?
Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time, lowering pH and reducing nutrient availability. Fresh media maintains cell health and supports continued expansion. Media color indicators like phenol red signal when changes are needed—orange indicates fresh media, yellow indicates acidic conditions requiring immediate media change, and pink suggests pH is too basic.
Q3: What does 90% confluency mean and why does it matter for cell passaging?
Confluency refers to the percentage of culture container surface covered by cells. At 90% confluency, adherent cells cover most of the container bottom and must be passaged to prevent overgrowth and maintain cell health. Monitoring confluency ensures cells are split at the optimal time for expansion and prevents toxic metabolite accumulation.
Q4: What are the essential components of complete cell culture media?
Complete media requires serum such as heat-treated Fetal Bovine Serum for growth factors, antibiotics like penicillin and streptomycin to prevent contamination, and additional growth factors such as fibroblast growth factor to prolong expansion. Each cell line requires a specific growth supplement cocktail tailored to its needs. Store complete media at 4°C when not in use.
Q5: How is trypsin used to remove adherent cells from culture plates?
Trypsin is a digestive enzyme that cleaves proteins binding cells to plastic surfaces. Cells are first washed with calcium- and magnesium-free phosphate buffered saline, then trypsin is added and incubated at 37°C for approximately 5 minutes. Careful timing is critical to avoid damaging cell surface proteins. Fresh media is added to stop proteolysis before transferring cells to a conical tube for counting using hemacytometer methods and applications.
Q6: What are alternative methods for removing cells that are too adherent for standard trypsin treatment?
For cells sensitive to enzymatic digestion or extremely adherent to plates, a cell scraper can gently remove cells from the culture container bottom. Alternatively, a serological pipette can be used in a firm scraping motion while rinsing with media. Mechanical dissociation requires care, as delicate cells can be damaged by these methods.
Q7: How can cell cultures be expanded more rapidly than single-layer flasks allow?
Multilayer flasks expand cell cultures 3-5 fold compared to single-layer flasks, enabling faster and more reproducible scale-up of cell expansion. These specialized culture vessels provide increased surface area for cell growth, making them ideal for generating large numbers of cells efficiently while maintaining appropriate culture conditions.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:40
Basic Principles of Subculturing Cells
2:59
Common Equipment/Reagents for Passaging Cells
6:36
How to Passage Cells
8:03
Applications
9:36
Summary