Het passeren van cellen

Het passeren, of subcultiveren, van cellen is een veelvoorkomende procedure waarbij cellen uit een bepaalde cultuur worden verdeeld, of "gesplitst", in nieuwe culturen en worden gevoed met vers medium om verdere expansie te faciliteren. Hoewel het concept zelf relatief eenvoudig is, zullen we in deze video enkele van de belangrijkste stappen bespreken voor het succesvol onderhouden en uitbreiden van cellijnen.

Toxische metabolieten hopen zich na verloop van tijd op in celkweekmedia. Bij het expanderen van cellen is het bijzonder belangrijk om het medium regelmatig te verversen om de celgezondheid te behouden en om de celexpansie te monitoren om overgroei van cellen te voorkomen.

Over het algemeen worden twee hoofdtypes cellen gesubcultured: geïmmortaliseerde cellijnen en stamcellijnen

Geïmmortaliseerde cellijnen zijn cellen afgeleid van meercellige organismen die een mutatie hebben ondergaan die de regulatie van hun celcyclus beïnvloedt, waardoor ze onbeperkt kunnen prolifereren. Misschien wel de bekendste geïmmortaliseerde cellijn is de HeLa-cellijn, die is afgeleid van een cervicale kankerlaesie gevonden in een biopsie van mevrouw Henrietta Lacks in 1951.

In tegenstelling tot cellijnen die door kanker zijn geïmmortaliseerd, worden stamcellijnen gegenereerd door zelfvernieuwende en multipotente cellen te isoleren uit diverse weefsels, zowel uit volwassen als embryonale weefsels. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze cellen, zoals de menselijke embryonale stamcellen die u hier ziet, onbeperkt in cultuur worden gehouden.

Cellen worden ofwel optimaal gekweekt in suspensie, zoals geïmmortaliseerde cellen geïsoleerd uit bloed, of ze groeien het best wanneer ze aan een oppervlak hechten, zoals het geval is bij veel weefselafgeleide cellen.

De groei van deze adherente cellen moet nauwlettend worden gevolgd om de celgezondheid te waarborgen. Afhankelijk van het celtype moeten de meeste adherente cellen worden gepassaged wanneer ze 70-90% confluent zijn, dat wil zeggen wanneer ze 70-90% van het oppervlak van de kweekcontainer bedekken.

Houd er rekening mee dat cellijnen veel kenmerken van de oorspronkelijke celkweek behouden, maar dat ze bij elke opeenvolgende passage ook kenmerken kunnen gaan vertonen die uniek zijn voor de geëxpandeerde kweek. Overweeg daarom om het aantal keren dat u een individuele celkweek blijft passagen te beperken.

Bij het passeren van cellen is het belangrijk om steriele technieken en de juiste reagentia en apparatuur te gebruiken.

Het is essentieel om de juiste media te gebruiken voor de optimale groei en expansie van uw cellijn. Elke cellijn vereist een specifiek groeisupplementenmengsel, maar de meeste cellijnen vereisen minimaal aanvulling met het volgende: serum, zoals foetaal kalfsserum, dat hittebehandeld moet worden om het bovine complement te inactiveren en dat vitale groeifactoren voor de cellen levert; antibiotica, zoals penicilline en streptomycine, die helpen de groei van contaminanten in de cultuur te beperken; en andere groeifactoren, zoals fibroblastgroeifactor, om de groei en expansie van de cellijnen te verlengen. Bewaar het aangevulde, of "complete", celkweekmedium bij 4 C wanneer u het niet gebruikt.

Let eerst op de kleur van het weefselkweekmedium. Vers celkweekmedium is rijk aan voedingsstoffen en heeft een heldere, oranje kleur, mede door de toevoeging van de pH-indicator fenolrood.

Wanneer cellen de voedingsstoffen in het medium beginnen op te gebruiken, hopen afvalstoffen en zuren zich op in de celcultuur, waardoor de pH daalt. Om deze reden bevatten veel weefselkweekmedia fenolrood, waardoor het medium van oranje naar geel verandert wanneer cellen de cultuur zuur maken. Verschoon het medium voordat het deze kleur krijgt!

Wanneer het fenolrood het medium een roze kleur geeft, wat aangeeft dat de pH te basisch is geworden voor een gezonde celgroei, kan het tijd zijn om zowel uw CO2-cilinder als uw medium te vervangen.

De meeste adherente cellijnen hechten zich van nature aan ongecoat plastic. Daarom worden plastic celkweekplaten, zoals petrischalen of 6-wells platen, vaak gebruikt voor het subcultiveren van cellen.

Ook plastic celkweekflessen worden gebruikt. De T25-celkweekfles wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om kleine populaties van cellijnen uit te breiden of om de groei van een traag expanderende cellijn te starten. T75-kweekflessen worden gewoonlijk gebruikt voor cellijnen die sneller prolifereren of om grotere aantallen cellen te genereren dan in een T25-fles passen.

Bij het verwijderen van adherente cellen moeten de eiwitten die de cellen aan het plastic binden eerst worden gesplitst. Hiervoor wordt vaak het spijsverteringsenzym trypsine gebruikt. Het is belangrijk om de blootstelling aan trypsine nauwkeurig te timen, omdat een te lange behandeling kan leiden tot schade aan andere celoppervlakte-eiwitten.

Celkweekmedia kunnen trypsine-neutralisatoren bevatten. Daarom wordt fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS, vaak gebruikt om de cellen te wassen vóór de trypsinisatie.

EDTA, een calciumchelatormiddel, wordt soms ook gebruikt om de proteolytische functie van trypsine te versterken.

Voor de expansie van de celkolonie worden de vers gepasseerde cellen vervolgens gekweekt in een celkweekincubator onder de omstandigheden die geschikt zijn voor die cellijn, doorgaans bij ongeveer 37 C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.

Voordat u begint, is het belangrijk om te begrijpen hoe vaak uw cellen gecontroleerd moeten worden, wat afhankelijk is van de proliferatiesnelheid van uw cellen.

Nu het medium een heldere oranje kleur heeft, observeert u de overige kweekcondities, zoals of de kweek troebel is – wat mogelijk op contaminatie duidt – de grootte en dichtheid van de celkolonies en de algehele kwaliteit van de cellen.

Als de cellen een confluentie van ongeveer 90% hebben bereikt, verwijdert u het weefselkweekmedium en wast u de cellen met calcium- en magnesiumvrij PBS.

Voeg nu trypsine toe aan de cellen en incubeer deze vervolgens bij 37 C. Bevestig na ongeveer 5 minuten dat de cellen zijn losgelaten en stop vervolgens de proteolyse door vers weefselkweekmedium toe te voegen.

Overbreng de celsuspensie naar een conische buis voor centrifugatie. Verwijder na het centrifugeren van de cellen voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de cellen in vers medium. Tel hoeveel cellen u heeft verzameld en zaai de cellen vervolgens uit volgens de dichtheid die geschikt is voor onmiddellijke of latere expansie.

Nu u weet hoe u cellen moet passageren, bekijken we enkele verschillende toepassingen van deze methode.

Zoals eerder vermeld, zijn menselijke embryonale stamcellen een type cel dat gepassageerd moet worden. Ze worden doorgaans gecocultiveerd met embryonale fibroblasten van muizen, of MEFs, die factoren leveren die stamcellen helpen hun pluripotente status te behouden.

Stamcelkolonies die zijn gegroeid op feeder-cellen moeten worden "gepikt" zodra ze het juiste ontwikkelingsstadium hebben bereikt. Ze kunnen worden geselecteerd met een micropipet of door voorzichtig schrapen met een glazen pick-tool en vervolgens worden geplaatst in een nieuwe kweek voor expansie.

Sommige cellijnen zijn gevoelig voor enzymatische digestie of ze zijn zo sterk adherent dat ze niet alleen met een trypsinbehandeling kunnen worden geresuspendeerd. Een celscraper kan worden gebruikt om de cellen voorzichtig van de bodem van de kweekplaat te verwijderen. Als de cellen bijzonder adherent zijn, probeer dan een serologische pipet met een stevige schrapende beweging te bewegen terwijl u de bodem van de celcontainer spoelt met medium of een andere geschikte oplossing. Wees voorzichtig met deze methode, aangezien delicate cellen kunnen worden beschadigd door deze mechanische methode van dissociatie.

Om de expansie van uw cellen sneller en reproduceerbaarder op te schalen dan mogelijk is in flasks met een enkele laag, kunnen multilayer-flasks worden gebruikt, waarmee celculturen 3-5 keer meer kunnen worden uitgebreid in vergelijking met flasks met een enkele laag.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over het passeren van cellen bekeken. In deze video hebben we besproken wat een cellijn is, hoe u deze subcultiveert en enkele verschillende toepassingen van het passeren van cellen. Bedankt voor het kijken en vergeet niet uw medium vers te houden!