Basismethoden in de Cel- en Moleculaire Biologie

Veel biomedische experimenten vereisen de manipulatie van een bekende hoeveelheid cellen om nauwkeurige, reproduceerbare en statistisch relevante gegevens te verkrijgen. Daarom is het leren tellen van cellen een bijzonder essentiële techniek voor elke succesvolle biomedische wetenschapper. De meest gebruikelijke manier om cellen te tellen is met behulp van een hemocytometer - een instrument met twee lasergeëtste rasters die helpen bij de telling van een aliquot cellen onder een eenvoudige...

Cellijnen worden vaak gebruikt in biomedische experimenten, omdat ze een snelle kweek en expansie van celtypen mogelijk maken voor experimentele analyse. Cellijnen worden onder vergelijkbare omstandigheden gekweekt als vers geïsoleerde, of primaire, cellen, maar met enkele belangrijke basisverschillen: (i) cellijnen vereisen hun eigen specifieke groeifactorcocktails en (ii) hun groei moet nauwer worden gemonitord dan die van primaire cellen, aangezien de mutaties die het mogelijk maken om ze...

De polymerasekettingreactie, of PCR, is een techniek die wordt gebruikt om DNA te amplificeren via thermocyclen – cycli van temperatuurveranderingen met vaste tijdsintervallen. Met behulp van een thermostabiele DNA-polymerase kan PCR talrijke kopieën van DNA maken uit DNA-bouwstenen, genaamd dNTPs. Er zijn drie stappen in PCR: denaturatie, annealing en elongatie. Denaturatie is de eerste stap in de cyclus en zorgt ervoor dat het DNA smelt door het verbreken van waterstofbruggen tussen de basen,...

DNA-gelelektroforese is een techniek die wordt gebruikt voor de detectie en scheiding van DNA-moleculen. Er wordt een elektrisch veld aangelegd over een gelmatrix bestaande uit agarose, waarbij geladen deeltjes binnen de gel migreren en worden gescheiden op basis van grootte. De negatief geladen fosfaten van de DNA-backbone zorgen ervoor dat DNA-fragmenten naar de anode bewegen - een positief geladen elektrode. De video legt het mechanisme uit waarmee DNA-fragmenten worden gescheiden op een...

Sodium Dodecyl Sulfaat Polyacrylamide Gelelektroforese, of SDS-PAGE, is een veelgebruikte techniek voor het scheiden van eiwitmengsels uitsluitend op basis van hun grootte. SDS, een anionisch detergent, wordt gebruikt om een gelijkmatige lading te creëren over de gehele lengte van gelinieariseerde eiwitten. Door deze eerst in een gel van polyacrylamide te laden en vervolgens een elektrisch veld op de gel aan te leggen, worden de met SDS gecoate eiwitten gescheiden. Het elektrisch veld fungeert...

Transformatie is het proces dat plaatsvindt wanneer een cel vreemd DNA uit de omgeving opneemt. Transformatie kan in de natuur voorkomen bij bepaalde typen bacteriën. In de moleculaire biologie wordt transformatie in het laboratorium kunstmatig nagebootst door het creëren van poriën in de bacteriële celmembranen. Bacteriële cellen die in staat zijn om DNA uit de omgeving op te nemen, worden competente cellen genoemd. In het laboratorium kunnen bacteriële cellen competent worden gemaakt, waarna...

De term “transformatie” verwijst naar de cellulaire opname van vreemd DNA. In de natuur kan transformatie voorkomen bij bepaalde typen bacteriën. In de moleculaire biologie wordt transformatie echter kunstmatig geïnduceerd door het creëren van poriën in de bacteriële celwanden. Bacteriële cellen die in staat zijn om DNA uit de omgeving op te nemen, worden competente cellen genoemd. Electrocompetente cellen kunnen in het laboratorium worden geproduceerd en transformatie van deze cellen kan...

Een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt doorgaans uitgevoerd om de aanwezigheid en/of hoeveelheid van een specifiek doeleiwit in een experimenteel monster aan te tonen. De detectie van het doeleiwit wordt mogelijk gemaakt door antilichamen, waardoor de ELISA een immunoassay is. Via een reeks incubatie- en wasstappen detecteren deze antilichamen, die vaak gekoppeld of geconjugeerd zijn aan een enzym, het eiwit dat de bodem van een putje op een microtiterplaat bedekt. Wanneer er een...

Plasmidzuivering is een techniek die wordt gebruikt om plasmid-DNA te isoleren en te zuiveren van genomisch DNA, eiwitten, ribosomen en de bacteriële celwand. Een plasmid is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat wordt gebruikt als drager van specifieke DNA-moleculen. Wanneer een plasmid via transformatie in een gastheerorganisme wordt geïntroduceerd, zal het worden gerepliceerd, waardoor er talrijke kopieën ontstaan van het bestudeerde DNA-fragment. In deze video wordt een stapsgewijze...

Gelzuivering wordt gebruikt om DNA-fragmenten terug te winnen na elektroforetische scheiding. Het terugwinnen van DNA uit een agarosegel omvat drie basisstappen: binding, wassen en elueren vanuit een silicacolom. Men gaat ervan uit dat DNA in aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie via een zoutbrug aan silica bindt. Na de binding wordt het DNA gewassen om onzuiverheden te verwijderen en geëlueerd onder omstandigheden met een lage zoutconcentratie, waardoor deze interactie wordt verbroken.

Western blotting wordt gebruikt om de aanwezigheid van specifieke eiwitten in elektroforetisch gescheiden monsters aan te tonen. Na scheiding met een techniek die bekendstaat als natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, of SDS-PAGE, wordt een western transfer gebruikt om eiwitten van een polyacrylamidegel over te brengen naar een membraan dat de eiwitten op hun respectievelijke posities vastlegt. Vervolgens worden de membranen onderzocht met antilichamen in een proces dat...

Transfectie is het proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in zoogdiercellen wordt ingebracht. Het inbrengen van DNA in een cel maakt de expressie, of productie, van eiwitten mogelijk met behulp van de eigen machinerie van de cel, terwijl het inbrengen van RNA in een cel wordt gebruikt om de productie van een specifiek eiwit te downreguleren door de translatie te stoppen. Hoewel de actieplaats voor getransfecteerd RNA het cytoplasma is, moet DNA naar de nucleus...

In de moleculaire biologie verwijst ligatie naar het samenvoegen van twee DNA-fragmenten door de vorming van een fosfodiësterbinding. Een enzym, bekend als een ligase, katalyseert de ligatiereactie. In de cel herstellen ligases enkel- en dubbelstrengse breuken die optreden tijdens de DNA-replicatie. In het laboratorium wordt DNA-ligase gebruikt tijdens moleculaire klonering om DNA-fragmenten van inserts te verbinden met vectoren – dragermoleculen van DNA die doelfragmenten zullen repliceren in...

Restrictie-enzymen of endonucleasen herkennen en knippen DNA op een specifieke sequentie. Deze enzymen komen van nature voor in bacteriën als verdediging tegen bacteriofagen - virussen die bacteriën infecteren. Bacteriële restrictie-enzymen knippen het binnendringende DNA van de bacteriofaag, terwijl het genomisch DNA van de bacterie ongeschonden blijft dankzij de toevoeging van methylgroepen. Deze video legt de basisprincipes van restrictie-enzymen uit, waaronder: hoe restrictie-enzymen worden...

Moleculaire klonering is een verzameling methoden die worden gebruikt om recombinant DNA in een vector te plaatsen - een drager van DNA-moleculen die recombinante DNA-fragmenten in gastheerorganismen zal repliceren. Het DNA-fragment, dat een gen kan zijn, kan worden geïsoleerd uit een prokaryoot of eukaryoot monster. Na isolatie van het betreffende fragment, of insert, moeten zowel de vector als de insert worden geknipt met restrictie-enzymen en worden gezuiverd. De gezuiverde stukken worden...