Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten
July 23rd, 2013
Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende introduceren Agrobacterium tumefaciens In planten voor eiwithoudende transiënte expressie.
Dit experimentele systeem maakt gebruik van agro infiltratie om effectief genconstructen naar bladeren te leveren voor de productie van hoge niveaus van recombinant eiwit. Eerst kweek je end hamana planten in een gecontroleerde omgeving gedurende zes weken, drie dagen vóór de infiltratie. Bereid de agrobacterium culturen voor die het doelgen bevatten dat in de planten moet worden geëxpresseerd op de dag van infiltratie.
Introduceer de agrobacterium culturen in het plantenweefsel door middel van spuit- of vacuüminfiltratie. Resultaten zoals de intensiteit van groen fluorescerend GFP in tabaksbladeren onder UV-licht tonen een robuuste expressie van recombinante eiwitten in planten die vergelijkbaar is met die van huidige zoogdier-, bacteriële en insect-gebaseerde expressiesystemen. Agro infiltratie is een effectieve manier om transgenen in plantencellen te introduceren, wat leidt tot hoge niveaus van expressie van recombinante eiwitten.
Het kan worden gebruikt voor een breed scala aan plantensoorten. Het belangrijkste is dat het kan worden opgeschaald voor commerciële productie van farmaceutische eiwitten. Dus deze methode kan inzicht bieden in de kinetiek en expressie van GFP en kan worden toegepast op andere eiwitten zoals subunitvaccins, recombinante monoklonale antilichamen en kan worden gebruikt in behandelingen voor kanker en infectieziekten.
Een succesvol experiment vereist optimale omstandigheden voor zowel de bacteriecultuur als het plantmateriaal. Dit infiltratieproces is gemakkelijker te repliceren na visuele demonstratie. Begin met het plaatsen van maximaal 60 turfpellets in een vermeerderingsbak.
Voeg vier liter kraanwater toe en laat de erwtenpellets het water gedurende twee uur absorberen. Voeg nu twee en hamana zaden toe aan elke turfpellet en dek de bak af met een transparante plastic koepel voor kieming. Plaats de zaden in een omgeving van 25 graden Celsius, 84% luchtvochtigheid.
Twee weken na het zaaien, verwijder de koepel en breng de planten over naar een nieuwe bak. Voeg vervolgens twee liter toe van 1,48 gram per liter. Jack's meststof. Blijf de planten kweken in een omgeving van 25 graden Celsius.
50% luchtvochtigheid om de twee dagen. Geef twee liter jack's meststof per bak. In week vier, verplaats de planten met turfpellets naar een nieuwe bak die zes planten bevat voor verdere groei tot zes weken oud.
Kies vier, zes weken oude en hamama planten met vijf tot zes bladeren elk, drie bladeren voor volledige infiltratie met de agrobacteriële stammen die de genen van belang bevatten. Eén blad voor de negatieve controle en één blad voor spotinfiltratie. Maak een kleine snede met een naald in de epidermis aan de achterkant van het blad, zorg ervoor dat het blad niet aan beide kanten wordt doorboord.
Pak de voorkant van het eerste blad stevig vast terwijl je zachte tegendruk uitoefent op de nek. Met de duim van één hand. Injecteer de agrobacterium mengsels in infiltratiebuffer in de nek met een spuit, een naald.
Ga door met het injecteren van de agrobacterium mengsels in de snede totdat de donkergroene cirkel stopt met uitbreiden. Maak vervolgens een andere snede en herhaal de injecties totdat het hele blad is geïnfiltreerd en het hele blad donkerder groen wordt. Voltooi infiltraties van de eerste drie bladeren en het laatste blad voor het vierde blad van elke plant met vectorcombinaties van alle vier de Gemini virale vectoren of drie magcon vectoren.
Maak ook een snede voor elke combinatie van agrobacterium stammen en infiltreer elke snede met één combinatie. Na infiltratie, verplaats de planten terug naar de kweekkamer en monitor de eiwitexpressie tussen twee en 15 dagen. Plaats na infiltratie een emmer in een vacuüm drooggemaakt en breng over in drie liter infiltratiebuffer met de agrobacterium stammen.
Verbind vervolgens het drooggemaakte apparaat met een vacuümbrand membraanvacuümpomp. Plaats nu een plant ondersteboven op de drooggemaakte plaat en laat de plaat met de plant zakken totdat het hele blad en stengelsysteem is ondergedompeld in de infiltratiebuffer met de plaat rustend op de emmer. Positioneer vervolgens de drooggemaakte O-ring langs de rand.
Nadat de drooggemaakte deksel op de kamer is geplaatst, zet je de vacuümpomp aan en begin met timen wanneer het vacuüm 100 millibar bereikt. Na het uitschakelen van de vacuümpomp, open je langzaam de ontluchtingsklep op de drooggemaakte na een minuut op 100 millibar om de entree van agrobacteriën in de interstitiale ruimtes van ondergedompeld plantenweefsel mogelijk te maken. Herhaal deze infiltratie.
Doe stap één om goede infiltratie te garanderen. Verwijder vervolgens de plant uit de drooggemaakte en plaats het terug in zijn rechtopstaande positie. Verplaats de planten terug naar de kweekkamer en monitor de eiwitexpressie tussen twee en 15 dagen na infiltratie.
Om de effectiviteit van spuitinfiltratie van agrobacterium in plantenweefsel te demonstreren, hebben we de expressie van twee fluorescerende eiwitten, GFP en Ds red getest door middel van twee verschillende gedeconstrueerde plantenvirale vectoren, Gemini, viraan en magcon voor end. Hamana bladeren die volledig zijn geïnfiltreerd met agrobacteriën die Gemini virale vectoren bevatten. GFP expressie werd waargenomen over het gehele bladoppervlak onder UV-licht, beginnend vanaf 2D PI en bereikte de piekaccumulatie op vier DPI.
In tegenstelling daarmee, vertoonden bladeren die waren geïnfiltreerd met magcon vector bevattende agrobacterium combinaties GFP fluorescentie pas na vijf DPI en bereikten de maximale accumulatie op zeven DPI. Er werd geen groen fluorescentie waargenomen van bladeren die waren geïnfiltreerd met negatieve controle agrobacteriën mengsels van EP een 10 plus P 19, wat aangeeft dat de fluorescentie specifiek was voor het GFP gen en niet het resultaat was van achtergrondfluorescentie van de bladeren. Bij zijn piekaccumulatie, is de fluorescentie van magcon vector geëxpresseerd naar GFP intenser dan die van Gemini virale vector.
Er werd geen grote necrose waargenomen op bladeren die waren geïnfiltreerd met GFP constructen wanneer beide fluorescerende eiwitten op hetzelfde blad werden geëxpresseerd via Gemini virale vectoren met spuitspot infiltratie, werden ze gedetecteerd met hun verwachte fluorescerende kleur op de plek waar ze waren
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een schaalbare methode voor het produceren van farmaceutische eiwitten in planten met behulp van Agrobacterium tumefaciens. De aanpak maakt gebruik van agro infiltratie om genconstructen in plantweefsels af te leveren, waardoor hoge niveaus van recombinante eiwitexpressie mogelijk worden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiotechnologie
- Eiwitexpressiesystemen
- Farmaceutische productie
Achtergrond
- Huidige eiwitexpressiesystemen hebben beperkingen in schaalbaarheid en kosten.
- Planten bieden een veilig alternatief voor het produceren van farmaceutische eiwitten.
- Agrobacterium tumefaciens is een goed gevestigd hulpmiddel voor genoverdracht in planten.
- Transiente expressiesystemen kunnen snel hoge eiwitniveaus opleveren.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige en schaalbare methode voor eiwitexpressie in planten te ontwikkelen.
- Om de effectiviteit van agro infiltratie voor het leveren van genconstructen aan te tonen.
- Om plant-gebaseerde expressie te vergelijken met traditionele systemen.
Gebruikte methoden
- Agro infiltratietechniek voor genlevering.
- Gebruik van end hamana planten gekweekt in een gecontroleerde omgeving.
- Bereiding van Agrobacterium culturen bevattende doelgenen.
- Evaluatie van eiwitexpressie door middel van fluorescentiebeeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Hoge niveaus van recombinant eiwit werden succesvol geëxpresseerd in plantweefsels.
- Fluorescentiebeeldvorming toonde robuuste expressie van GFP in tabaksbladeren.
- De methode toonde voordelen ten opzichte van zoogdier- en bacterieelsystemen.
- Agro infiltratie bleek een effectieve methode voor genintroductie te zijn.
Conclusies
- De studie bevestigt de haalbaarheid van het gebruik van planten voor grootschalige eiwitproductie.
- Agro infiltratie is een veelbelovende techniek voor transiente genexpressie.
- Deze aanpak zou de efficiëntie van farmaceutische eiwitproductie kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
