Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Dit experimentele systeem maakt gebruik van agro-infiltratie om genconstructen effectief af te leveren in bladeren voor de productie van hoge concentraties recombinant eiwit. Kweek eerst end hamana-planten gedurende zes weken in een gecontroleerde omgeving, tot drie dagen vóór de infiltratie. Bereid op de dag van de infiltratie de agrobacteriumculturen voor die het doelgen bevatten dat in de planten tot expressie moet worden gebracht.

Introduceer de agrobacteriumculturen in het plantweefsel via een spuit of door vacuüminfiltratie. Resultaten, zoals de intensiteit van de groene fluorescentie van GFP in tabaksbladeren onder UV-licht, tonen een robuuste expressie van recombinante eiwitten in planten aan die concurreert met die van huidige expressiesystemen op basis van zoogdieren, bacteriën en insecten. Agro-infiltratie is een effectieve methode om transgenen in plantencellen te introduceren, wat leidt tot een hoge expressiegraad van recombinante eiwitten.

Het kan worden gebruikt voor een breed scala aan plantensoorten. Het belangrijkste is dat het kan worden opgeschaald voor de commerciële productie van farmaceutische eiwitten. Deze methode kan dus inzicht bieden in de kinetiek en expressie van GFP en kan worden toegepast op andere eiwitten, zoals subunit-vaccins en recombinante monoklonale antilichamen, en kan worden gebruikt bij behandelingen voor kanker en infectieziekten.

Een succesvol experiment vereist optimale omstandigheden voor zowel de bacteriecultuur als het plantmateriaal. Dit infiltratieproces is gemakkelijker te reproduceren na een visuele demonstratie. Begin met het plaatsen van maximaal 60 veenpellets in een kweekplaat.

Voeg vier liter kraanwater toe en laat de veenpellets het water gedurende twee uur absorberen. Plaats nu twee hamana-zaden in elke veenpellet en dek de tray af met een transparante plastic koepel voor de kieming. Plaats de zaden in een omgeving van 25 °C en 84% luchtvochtigheid.

Verwijder twee weken na het zaaien de koepel en verplaats de planten naar een nieuwe tray. Voeg vervolgens twee liter van 1,48 gram per liter Jack's meststof toe. Laat de planten verder groeien bij 25 °C.

Om de twee dagen een omgeving met 50% luchtvochtigheid. Voeg twee liter Jack's meststof per tray toe. Verplaats de planten met veenpellets in week vier naar een nieuwe tray met zes planten voor verdere groei tot een leeftijd van zes weken.

Kies vier zes weken oude Nicotiana benthamiana-planten met elk vijf tot zes bladeren: drie bladeren voor volledige infiltratie met de Agrobacterium-stammen die de genen van belang bevatten, één blad voor de negatieve controle en één blad voor spot-infiltratie. Maak met een naald een kleine inkeping in de epidermis aan de achterzijde van het blad, waarbij u ervoor zorgt dat het blad niet volledig wordt doorboord.

Houd de voorzijde van het eerste blad stevig vast terwijl u een lichte tegendruk op de nek uitoefent met de duim van één hand. Injecteer de agrobacteriummengsels in infiltratiebuffer met een injectiespuit en naald in de nek.

Inject de mengsels van agrobacterium in de incisie totdat de donkergroene cirkel niet meer uitbreidt. Maak vervolgens een nieuwe incisie en herhaal de injecties totdat het gehele blad is geïnfiltreerd en het volledige blad donkergroen wordt. Voltooi de infiltraties van de eerste drie bladeren en infiltreer voor het vierde blad van elke plant met vectorcombinaties van ofwel alle vier de Gemini-virale vectoren of drie magcon-vectoren.

Maak daarnaast voor elke combinatie van agrobacteriumstammen één inkeping en infiltreer elke inkeping met één combinatie. Verplaats de planten na infiltratie terug naar de groeikamer en monitor de eiwitexpressie gedurende een periode van twee tot 15 dagen. Plaats na de infiltratie een bak in een vacuümdesiccator en breng drie liter infiltratiebuffer over die de agrobacteriumstammen bevat.

Sluit vervolgens de desiccator aan op een membraanvacuümpomp van een vacuümmerk. Plaats nu een plant ondersteboven op de plaat van de desiccator en laat de plaat met de plant zakken totdat het volledige blad- en stengelsysteem is ondergedompeld in de infiltratiebuffer, waarbij de plaat op de bovenkant van de kuip rust. Plaats daarna de O-ring van de desiccator langs de rand.

Plaats het deksel op de vacuümkamer, schakel de vacuümpomp in en start de tijdmeting zodra het vacuüm 100 millibar bereikt. Schakel na één minuut bij 100 millibar de vacuümpomp uit en open vervolgens langzaam het ontluchtingsventiel van de vacuümkamer om de agrobacteriën toe te laten in de interstitiële ruimten van het ondergedompelde plantweefsel. Herhaal deze infiltratie.

Zet één stap om een goede infiltratie te waarborgen. Verwijder vervolgens de plant uit het desiccaat en breng deze terug in de rechtopstaande positie. Plaats de planten terug in de groeikamer en monitor de proteïne-expressie tussen twee en 15 dagen na infiltratie.

Om de effectiviteit van syringe-infiltratie van agrobacterium in plantweefsel aan te tonen, hebben we de expressie van twee fluorescerende eiwitten, GFP en Ds red, getest met twee verschillende gedeconstrueerde plantenvirale vectoren, Gemini viral en magcon for end. Hamana-bladeren werden volledig geïnfiltreerd met agrobacteriën die Gemini-virale vectoren bevatten. GFP-expressie werd waargenomen over het gehele bladoppervlak onder UV-licht, beginnend vanaf 2 DPI, en bereikte een piekaccumulatie bij 4 DPI.

Daarentegen vertoonden bladeren die geïnfiltreerd waren met magcon-vectoren met agrobacterium-combinaties pas GFP-fluorescentie na vijf DPI en bereikten deze de maximale accumulatie bij zeven DPI. Er werd geen groene fluorescentie waargenomen in bladeren die geïnfiltreerd waren met negatieve controle-mengsels van agrobacteriën van EP one 10 plus P 19, wat aantoont dat de fluorescentie specifiek was voor het GFP-gen en niet het resultaat was van achtergrondfluorescentie van de bladeren. Bij de maximale accumulatie is de fluorescentie van de magcon-vector die GFP tot expressie brengt intenser dan die van de Gemini-virale vector.

Er werd geen significante necrose waargenomen op bladeren die geïnfiltreerd waren met GFP-constructen; wanneer beide fluorescerende eiwitten via Gemini-virale vectoren met spuiten-spot-infiltratie op hetzelfde blad werden tot expressie gebracht, werden ze gedetecteerd met hun verwachte fluorescerende kleur op de plek waar ze waren geïnfiltreerd. Interessant genoeg resulteerde co-infiltratie van GFP en DS RED in een gelige fluorescentie. Vacuüm-infiltratie werd eveneens onderzocht om een schaalbare agro-infiltratiemethode te ontwikkelen die kan worden gebruikt voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten via transiënte expressiesystemen in planten.

Zoals verwacht werd GFP-fluorescentie waargenomen bij alle bladeren van de geïnfiltreerde plant in vergelijking met infiltratie via een spuit. Het is robuuster en maakt het mogelijk om elke plant in een veel korter tijdsbestek te infiltreren. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze binnen 48 uur worden uitgevoerd.

Meestal is dit voor de agrobacteriële kweek, aangezien de feitelijke infiltratietijd slechts enkele minuten bedraagt. Volg het protocol voor een optimale agro-infiltratie-efficiëntie en gerichte eiwitexpressie. Vergeet niet de kritische parameters te controleren, waaronder de plantgroeicondities, de agrobacteriële concentratie, de vacuümdruk en de duur binnen het veld van de plantbiotechnologie.

Deze experimentele benadering kan worden gebruikt om de ontwikkeling en bioproductie van nieuwe farmaceutische eiwitten in een breed scala aan plantensoorten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video heeft u een goed beeld van hoe agro-infiltratie kan worden gebruikt om doelgenconstructen in de plant te brengen, zodat planten met transient expressiesystemen recombinant eiwit kunnen produceren dat kan concurreren met dat van zoogdier-, bacteriële en insectencelculturen.