Name: Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer agro-infiltratie van planten voor hoogwaardige tijdelijke expressie van recombinante eiwitten. Deze methode met Agrobacterium tumefaciens biedt een schaalbaar alternatief voor farmaceutische productie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken R. Zon en andere studenten van Chen&#39;s Laboratorium voor hun bijdrage aan materiaal generatie planten. We danken ook dr. D. Green voor zijn steun van undergraduate onderzoek in de Universiteit van Technologie en Innovatie (CTI). Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH subsidie ​​U01 AI075549 en 1R21AI101329 naar Q. Chen, en een SSE subsidie ​​van CTI van de Arizona State University naar Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, en J. Stahnke zijn undergraduate studenten ondersteund door de SSE subsidie.

1. Plant Groei <ol><li> Plaats 60 turf pellets in een vermeerdering lade. Voeg 4 L van kraanwater en laat de turf pellets absorberen het water voor 2 uur. </li><li> Voeg 2 N. benthamiana zaden in elke turf pellet met een zaaimachine, bedek de schaal met een doorzichtige plastic koepel en laat ze ontkiemen in een 25 ° C, 84% vochtigheid met een 16/8 uur dag / nacht cyclus (Figuur 1A). </li><li> Verwijder de koepel twee weken na het zaaien, afvoer van water uit de lade en voeg 2 L van Jack&#39;s kunstmest bij een concentratie van 1,48 g / L (Figuur 1B). Blijven planten groeien in een 25 ° C, 50% vochtigheid met een 16/8 uur dag / nacht-cyclus. Leveren 2 L van Jack&#39;s kunstmest om de 2 dagen per tray. </li><li> In week 4, dragen de planten met turf pellets naar een nieuwe lade die zes planten hosts om voldoende ruimte te bieden voor verdere groei (figuur 1C) tot ze klaar zijn om te worden geïnfiltreerd in leeftijd van 6 weken (figuur1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultuur Voorbereiding 2.1 Voorbereiding voor Spuit Infiltratie <ol><li> Streak A. tumefaciens GV3101 stammen bevattende de vectoren geminiviral p19, pREP110, pBYGFP en pBYDsRed op LB agarplaten die kanamycine (100 ug / ml). Streak een stam per plaat en groeien bij 30 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Ook streak en groeien GV3101 stammen die de MagnICON vectoren van de 5 &#39;module (pICH15879), de 3&#39; module die de doelwit-gen van GFP of DsRed (Pich-GFP of PICH-DsRed), en integrase (pCH14011) op LB Agar platen die carbenicilline (100 ug / ml). </li><li> Uit een kolonie op LB Agar plaat, inoculeren GV3101 stammen met geminiviral vectoren in 3 ml YENB medium (0,75% Bacto gistextract, 0,8% Nutrient Broth, pH tot 7,5 met NaOH) + kanamycine (100 ug / ml) in a ml rondbodem cultuurbuis 15, groeien de vloeibare kweek bij 30 ° C ineen shaker &#39;s nachts met een 300 rpm rotatiesnelheid. </li><li> Ook enten en groeien GV3101 stammen met MagnICON vectoren YENB media + carbenicilline (100 ug / ml) in een shaker nacht bij 30 ° C. </li><li> Meet en noteer OD600 waarden voor elke vloeibare kweek met een spectrofotometer en met de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V sub) worden gekweekt voor een nieuwe cultuur met een beginnende OD 600 van 0.025 in 10 ml YENB medium met geschikte antibiotica berekenen . Sub V (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transfer sub V (ml) van de overnacht cultuur (10 - V sub) YENB ml medium met geschikte antibiotica voor elke stam. Groeien de nieuwe kweek overnacht bij 30 ° C in een schudder met 250 rpm rotatiesnelheid totdat de OD 600-waarde in het traject van 1,7-2,0. </li><li> Meten en opnemen OD 600 waarden voor elke vloeibare cultuur en gebruiken van de onderstaande formule te gebruiken Calculeren noodzakelijke volume (V inf) wordt verdund in 50 ml van infiltratie buffer tot een uiteindelijke OD600 van 0,12 geven voor elke stam. Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transfer inf V (ml) van elke kweek een microcentrifugebuis en spin down de cellen door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml infiltratie buffer (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) door vortexen kort. </li><li> Meng geresuspendeerd cellen van pBYGFP + pREP110 + p19, draai de cellen neer op 12.000 xg gedurende 2 minuten, en resuspendeer in totaal 50 ml van infiltratie buffer. Dit Agrobacteriën combinatie is voor geminiviral expressie van GFP. </li><li> Ook meng de volgende combinaties van Agrobacterium cellen, spin down en resuspendeer ze in 50 ml buffer infiltratie. Zij omvatten (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 voor geminiviral expressie van DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 voor geminiviral co-expressie van GFP en DsRed, (3) pREp110 + p19 als negatieve controle van geminiviral expressie, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 voor MagnICON expressie van GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 voor MagnICON expressie van DsRed, en (6) pICH15879 + pCH14011 als negatieve controle voor MagnICON expressie. </li></ol> 2.2 Voorbereiding voor Vacuüm Infiltratie <ol><li> Enten en cultuur elkaar GV3101 stam die geminiviral vectoren of MagnICON vectoren in 15 ml YENB media met de juiste antibiotica in een 50 ml autoclaaf kolf en groeien &#39;s nachts, zoals beschreven voor spuit infiltratie hierboven. </li><li> Meet en noteer OD600 waarden voor elke vloeibare kweek met een spectrofotometer en met de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V sub) worden gekweekt voor een nieuwe cultuur met een beginnende OD van 600 0,025 250 ml YENB medium met geschikte antibiotica berekenen . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transfer sub V (ml) van de overnacht cultuur (250 - V sub) ml YENB media in een 1 L kolf geautoclaveerd met geschikte antibiotica voor elke stam en groeien de nieuwe cultuur overnacht zoals beschreven voor spuit infiltratie hierboven. </li><li> Meten en opnemen OD 600 waarden voor elke vloeibare cultuur en gebruik de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V inf) te worden verdund in 3 L van infiltratie buffer tot een uiteindelijke OD 600 van 0.12 geven voor elke stam te berekenen. V inf (ml) = (3000 ml) x (0.12) / OD 600 </li><li> Pellet en resuspendeer inf V (ml) van elke kweek in infiltratie buffer zoals beschreven voor spuit infiltratie en meng de geresuspendeerde kweken volgens de beschreven spuit infiltratie combinaties. Repellet de gemengde Agrobacterium cellen en resuspendeer ze in 3 L infiltratie buffer. </li></ol> 3.1 Spuit Infiltratie <ol><li> Kies vier 6-weken oude N. benthamiana planten met 5 vertrekt elk. De eerste drie bladeren rekenen vanaf de bovenkant van elke plant worden volledig geïnfiltreerd met een van de combinaties van A. tumefaciens stammen in infiltratie buffer. De vierde blad zal zijn spot-geïnfiltreerd met alle vier de stam combinaties voor geminiviral expressie of alle drie de combinaties voor MagnICON expressie. Het laatste blad van elke plant wordt geïnfiltreerd met combinaties van negatieve controles. </li><li> Een kleine inkeping met een naald in de epidermis aan de achterzijde van het blad (Figuur 2A). Attentie: zorg ervoor dat zo moeilijk om niet te krabben als te doorboren het blad door beide kanten, zoals de Agrobacteria cellen in de infiltratie mengsel door de punctie zal doorgeven aan de andere kant van het blad. </li><li> Neem een ​​stevige greep van de voorzijde van het blad en terwijl de toepassing van zachtetegendruk aan de nick met de duim van een hand, injecteer de Agrobacterium mengsels in infiltratie buffer in de nick met een spuit zonder naald (figuur 2B). Opmerking: Als de Agrobacterium mengsel komt in de intercellulaire ruimte van het blad, zal de geïnfiltreerde gebied draai zichtbaar donkerder groen (figuur 2C). </li><li> Doorgaan met de Agrobacterium mengsels injecteren in de inkeping totdat de donkere groene cirkel stopt om uit te breiden. Maak een andere nick en herhaal de stappen 3.1.2-3.1.4 totdat het hele blad wordt geïnfiltreerd en het hele blad wordt donkerder groen voor de eerste drie bladeren en het laatste blad. </li><li> Voor het vierde blad van elke plant, zullen alle vier (geminiviral vector) of drie (MagnICON vector) combinaties worden geïnfiltreerd in het. Maak een inkeping voor elke combinatie van Agrobacterium stammen, en infiltreren elke nick met een combinatie. </li><li> Na infiltratie, verplaatsen planten terug naar de groei kamer en monitor eiwitexpressie tussen 2-15 dagen na infiltratie (dpi). </li></ol> 3.2 Vacuüm Infiltratie <ol><li> Plaats een bad in een vacuüm exsiccator en overdracht 3 L infiltratie buffer met de Agrobacterium-stammen aan het bad. Sluit de exsiccator tot een Vacuubrand membraan vacuümpomp (figuur 3A). </li><li> Plaats een plant ondersteboven op de exsiccator plaat (figuur 3B) en laat de plaat met de plant totdat het hele blad en stengel systeem wordt ondergedompeld in de infiltratie buffer met de plaat rust bovenop van het bad. Plaats de exsiccator O-ring langs de rand en zet de exsiccator deksel op de kamer (Figuur 3C). </li><li> Schakel de vacuümpomp en start de timing wanneer het vacuüm bereikt 100 mbar. Open langzaam het ventiel op de exsiccator na 1 min bij 100 mbar tot ingang van Agrobacteria toe in de interstitiële ruimten van ondergedompeld plantenweefsel. Herhaal deze stap een additionale tijd om goede infiltratie te garanderen. </li><li> Na infiltratie, neem de plant uit de exsiccator en zet het terug naar zijn rechtopstaande positie. Verplaatsen planten terug naar de groei kamer en de monitor eiwitexpressie tussen 2-15 dpi. </li></ol> 4. Fluorescent Protein Detectie en fotografie <ol><li> Vanaf 2 dpi, zet planten in donkere kamer en glans UV-licht aan de achterzijde van geïnfiltreerde bladeren met een handbediende UV-lamp. </li><li> Let op de groene fluorescentie van GFP of de rode fluorescentie van DsRed. GFP geeft ze een sterker signaal met lange golf UV-licht, terwijl DsRed is sterker onder korte golf UV-licht. </li><li> Neem foto&#39;s van fluorescerende bladeren met een gewone digitale camera zonder flits. </li><li> Verplaatsen planten terug naar de groei kamer na observatie of fotografie. </li></ol>

<ol><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22Transgenic+Horticultural+Crops%3A+Challenges+and+Opportunities+-+Essays+by+Experts%22">Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts</a>. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).</li>
<li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li>
<li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559(2010).</li>
<li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+new+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biopharm.+Rev%22%5BJournal%5D)">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22New+Generation+Vaccines%22">New Generation Vaccines</a>. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).</li>
<li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li>
<li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li>
<li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li>
<li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li>
<li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li>
<li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li>
<li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li>
<li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li>
<li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li>
<li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells%3A+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Tech.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

De toenemende vraag naar eiwit gebaseerde geneesmiddelen wereldwijd vereisen nieuwe productieplatforms die robuust, schaalbaar, lage kosten en een kluisje. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve productiesystemen voor farmaceutische productie eiwit. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van deconstructed virus gebaseerde vectoren transiënte expressie van eiwitten in planten, die sterk verbetert de snelheid en opbrengst van plantaardige expressiesystemen 2,10 ingeschakeld....

Sinds 1970 zijn planten onderzocht als alternatieven voor zoogdieren, insecten en bacteriële celculturen voor de commerciële productie van recombinant proteïnen en therapeutische eiwitten 1. Plant-gebaseerde systemen voor de expressie van biofarmaceutische producten hebben aangetoond belofte in de afgelopen jaren een aantal nieuwe behandelingen voor ziekten, zoals de ziekte van Gaucher 2, en aviaire influenza H5N1 3, succesvol zijn gebleken in klinische onderzoeken. De ontwikkeling van competente mechanismen voor recombinante eiwitexpressie in planten in de decennia aangezien deze eerste experimenten heeft het potentieel voor plantaardige systemen voor het huidige paradigma van eiwitproductie aanpassen voor drie primaire redenen. Ten eerste is er een opmerkelijke afname in kosten bij zoogdieren, insecten en bacteriële bioreactoren vereisen aanzienlijke opstartkosten, duur groeimedia en gecompliceerde processen voor stroomafwaartse zuivering 4. De oprichting van stabiele transgene plantlijnen laat hen ook om de schaalbaarheid van andere expressie systemen overtreffen als eiwit expressie planten kunnen worden geteeld en geoogst op een agrarische schaal 5. Ten tweede, plantaardige expressiesystemen het risico op het overdragen van een mens of dier pathogeen het eiwit tot expressie gastheer voor mensen te verminderen, waaruit superioriteit openbare veiligheid 6. Tenslotte planten gebruik van een eukaryoot endomembranesysteem dat vergelijkbaar zoogdiercellen, waardoor goede post-translationele modificatie van eiwitten zoals glycosylering en de montage van meerdere-subeenheideiwitten 7. Dit vermogen geeft plantaardige systemen voordat deze basis prokaryotische systemen, zoals bacteriën, aangezien een groter aantal farmaceutische recombinante eiwitten, waaronder monoklonale antilichamen (mAbs) hebben een ingewikkeldere structuur en vereisen uitgebreide posttranslationele modificaties of assembly 8. Er zijn twee belangrijke passendpijn tot de uiting van recombinante eiwitten in planten. De eerste is de ontwikkeling van een transgene lijn stabiel, waarbij DNA dat codeert voor het doeleiwit wordt gekloneerd in een expressie cassette en ingevoerd om de nucleaire en chloroplastgenomen bedoeld. Daarbij, het vreemde DNA wordt erfelijk door opvolgende generaties en zorgt voor enorm verbeterde schaalbaarheid, veel verder dan die van andere systemen meningsuiting 1. Introductie van exogeen DNA aan het nucleaire genoom wordt gewoonlijk bereikt door Agrobacterium tumefaciens infectie van plantenweefsel of, minder vaak, door microprojectielbombardement van het weefsel 9. Plantenhormonen worden vervolgens gebruikt om differentiatie en groei van transgene plantenweefsel zoals wortels en bladeren induceren. Transformatie van de chloroplast genoom kan niet worden bereikt met A. tumefaciens, maar vertrouwt volledig op goud of wolfraam deeltjes bekleed met DNA afgevuurd ballistisch in plantencellen. De tweede methode van het uiten van recombinatient in planten is door tijdelijke expressie 10. In dit scenario worden virus afgeleide vectoren herbergen het gen van belang geleverd via A. tumefaciens tot volledig ontwikkelde planten door middel van een proces genaamd agroinfiltration. In plaats van integratie in het plantengenoom, wordt de geleverde genconstruct dan beginnen direct de tijdelijke productie van het gewenste eiwit, die kunnen worden geoogst en geïsoleerd na een korte incubatieperiode. Transiënte genexpressie biedt het voordeel van een grotere totale eiwit accumulatie en een verbeterde tijd eiwitproductie, zoals planten direct ongeveer 1-2 weken na oogsten agroinfiltration 11 zal zijn. Dit is aanzienlijk sneller dan de processen van productie, selectie, en de bevestiging van stabiele transgene plant lijnen, die enkele maanden kan duren tot een jaar. Dit is echter ook de beperking van het tijdelijke expressiesysteem, omdat het niet zal opleveren genetisch stabiele plantaardige lines die kunnen worden gebruikt om een ​​zaadbank voor grootschalige commerciële productie genereren. Desondanks zijn methoden ontwikkeld om grootschalige tijdelijke expressie verbeteren. Hier laten we zien een methode van generatie van voorbijgaande proteïne-expressie Nicotiana benthamiana planten met behulp gedeconstrueerd virale vectoren door A. geleverd tumefaciens. Twee belangrijke methoden ontwikkeld voor de levering van A. tumefaciens in plantenweefsel: bench schaal infiltratie via een injectiespuit en grootschalige infiltratie via de vacuümkamer. Beide protocollen worden beschreven met N. benthamiana, die nauw verwant is aan de gemeenschappelijke tabaksplant, zoals de waardplant voor transiënte expressie van twee fluorescerende eiwitten: het groen fluorescerend eiwit (GFP) van kwallen Aequorea Victoria en de rode fluorescente eiwit uit Discosoma koraal (DsRed) 12,13. N. benthamiana is de meest voorkomende waardplant voorrecombinant eiwit omdat het vatbaar is voor genetische transformatie kunnen grote hoeveelheden biomassa snel leveren en is een vruchtbare zaad producent opschaling productie 14. Een ander voordeel van N. benthamiana als gastheren voor eiwitexpressie is de beschikbaarheid van een verscheidenheid van expressievectoren 2,5. In deze studie, twee deconstructed virale vectoren, op basis van een tabak (TMV) RNA replicon systeem (MagnICON vectoren) en de andere zijn afgeleid van de boon yellow dwarf virus (BeYDV) DNA replicon systeem (geminiviral vectoren) 4,11, 15-18, worden gebruikt om het GFP en DsRed gen dragen en zal ze in N. benthamiana cellen via A. tumefaciens. Drie DNA constructen zullen worden gebruikt voor GFP en DsRed MagnICON expressie vectoren. Zij omvatten de 5 &#39;module (pICH15879) bevattende de promoter en andere genetische elementen voor het aandrijven van de expressie van het doelwitgen, het 3&#39;module die het gen van belang (Pich-GFP of Pich-DsRed) en het integrase module (pICH14011) codeert voor een enzym dat integreert de 5 &#39;en 3&#39; modules samen bij expressie 8,15. Drie DNA-constructen zijn ook nodig voor expressie met geminiviral vectoren. Naast de vectoren die replicon van het doelgen (pBYGFP of pBYDsRed), wordt een vector die codeert voor het replicatie-eiwit (pREP110) vereist voor de amplificatie van de doelwit replicon 11,14,16. Bovendien is de opname van een vector die codeert voor de silencing suppressor p19 van tomaat bossige stunt virus gewenst voor niveau doelwitgenexpressie hoog 11,16. Er zijn over het algemeen drie belangrijke stappen voor de invoering van de genen van recombinante eiwitten in plantencellen door agroinfiltration waaronder plantengroei, A. tumefaciens cultuur voorbereiding, en infiltratie. Aangezien elke stap is essentieel voor het uiteindelijke succes van deze procedure, dus een gedetailleerde beschrijving van elk wordtzowel spuit infiltratie en vacuüm infiltratie hieronder.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Zie verwijzing: Lico en Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Zie verwijzing: Baird en Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Zie verwijzing: giritch en Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral Vector</td><td>Author&rsquo;s Lab</td><td>n/a</td><td>Zie verwijzing: Chen en He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Author&rsquo;s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td><td>Author&rsquo;s Lab</td><td>n/a</td><td>Zie verwijzing: Lai en Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, platen</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, platen</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Broth</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hydrate Buffer</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack&rsquo;s Fertilizer</td><td>Hummert International</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Vacuum Air Regulator Valve</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Desiccator 12 1/8" met O ring</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Tub</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn&rsquo; Saver Bowl, 10-cup zal werken</td></tr><tr><td>plate/shelf 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Propagation Tray Dome</td><td>hydrofarm</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tray</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo Hand Seeder</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Cart 4 shelf</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubator/Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

efficiënte agroinfiltration van planten voor high-level tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Zoogdiercelculturen is het belangrijkste platform voor de commerciële productie van humane vaccins en therapeutische eiwitten. Het kan echter niet voldoen aan de toenemende wereldwijde vraag naar geneesmiddelen vanwege de beperkte schaalbaarheid en hoge kosten. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve farmaceutische productieplatforms die robuust, schaalbaar, goedkoop en veilig. De recente ontwikkeling van virus-gebaseerde vectoren is toegestaan ​​snelle en hoog-niveau transiënte expressie van recombinant eiwitten in planten. Verder optimaliseren van de bruikbaarheid van het tijdelijke expressiesysteem, demonstreren we een eenvoudig, efficiënt en schaalbaar methodologie om target-gen dat Agrobacterium introduceren in plantenweefsel in deze studie. Onze resultaten geven aan dat zowel agroinfiltration spuit en vacuüm methoden hebben geleid tot de efficiënte introductie van Agrobacterium in bladeren en levenskrachtige twee fluorescerende eiwitten, GFP en DsRed. VoortsWe tonen de unieke voordelen van beide methoden. Spuit infiltratie is eenvoudig en dure apparatuur hoeft niet. Ook kan de flexibiliteit om ofwel infiltreren gehele verlaten met een doelgen, of genen van meerdere doelen voeren op een blad. Zo kan het worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek expressie van recombinante eiwitten en voor verschillende eiwitten of vectoren waarin voor yield of expressie kinetiek. De eenvoud van de spuit infiltratie suggereert ook haar nut in de middelbare school en universiteit onderwijs voor het vak van de biotechnologie. Daarentegen, vacuüm infiltratie meer robuust en opgeschaald voor commerciële vervaardiging van farmaceutische eiwitten. Het biedt ook het voordeel van het kunnen plantensoorten die niet vatbaar is voor spuit infiltratie zoals sla en Arabidopsis zijn agroinfiltrate. Kortom, de combinatie van spuit en vacuüm agroinfiltration biedt onderzoekers en docenten een eenvoudige, efficiënte en robuustemethodologie voor transiënte eiwitexpressie. Het zal veel gemakkelijker de ontwikkeling van farmaceutische eiwitten en bevorderen van wetenschappelijk onderwijs.

1. Expressie van fluorescerende eiwitten door Spuit Infiltratie GFP en DsRed - - Om de effectiviteit van de spuit infiltratie van Agrobacterium in het plantenweefsel te tonen, hebben we de expressie van twee fluorescerende eiwitten getest door twee verschillende gedeconstrueerd planten virale vectoren - geminiviral en MagnICON - in N. benthamiana. Voor N. benthamiana bladeren die volledig werden geïnfiltreerd met Agrobacteriën bevattende geminiviral vectoren,...

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende introduceren<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; In planten voor eiwithoudende transiënte expressie.

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Dit experimentele systeem maakt gebruik van agro-infiltratie om genconstructen effectief af te leveren in bladeren voor de productie van hoge concentraties recombinant eiwit. Kweek eerst end hamana-planten gedurende zes weken in een gecontroleerde omgeving, tot drie dagen vóór de infiltratie. Bereid op de dag van de infiltratie de agrobacteriumculturen voor die het doelgen bevatten dat in de planten tot expressie moet worden gebracht.Introduceer de agrobacteriumculturen in het plantweefsel via een spuit of door vacuüminfiltratie. Resultaten, zoals de intensiteit van de groene fluorescentie van GFP in tabaksbladeren onder UV-licht, tonen een robuuste expressie van recombinante eiwitten in planten aan die concurreert met die van huidige expressiesystemen op basis van zoogdieren, bacteriën en insecten. Agro-infiltratie is een effectieve methode om transgenen in plantencellen te introduceren, wat leidt tot een hoge expressiegraad van recombinante eiwitten.Het kan worden gebruikt voor een breed scala aan plantensoorten. Het belangrijkste is dat het kan worden opgeschaald voor de commerciële productie van farmaceutische eiwitten. Deze methode kan dus inzicht bieden in de kinetiek en expr

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Hier presenteren we het eerste protocol voor gelokaliseerde vacuüminfiltratie voor in vivo studies van de genetische transformatie van grote planten. Met behulp van deze methodologie bereikten we voor het eerst de Agrobacterium-gemedieerde in planta voorbijgaande transformatie van cacao.

Vacuümgeforceerde agro-infiltratie voor in planta transformatie van recalcitrante planten: cacao als casestudy

Leer agro-infiltratie van planten voor hoogwaardige tijdelijke expressie van recombinante eiwitten. Deze methode met Agrobacterium tumefaciens biedt een schaalbaar alternatief voor farmaceutische productie.

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Meer video's verkennen