Name: Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer hoe je LRRK1 en LRRK2 kinasen metabool labelt met radioactief fosfaat om fosforyleringsniveaus in cellen te kwantificeren. Deze methode werkt zonder specifieke fosfo-antilichamen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn ook dankbaar voor de Michael J. Fox Foundation ter ondersteuning van deze studie. Wij danken het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen FWO (FWO-project G.0666.09, senior onderzoeker fellowship aan JMT), het IWT SBO/80020 project Neuro-TARGET, de KU Leuven (OT/08/052A en IOF-KP/07 / 001) voor hun steun. Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Fonds Druwe-Eerdekens beheerd door de Koning Boudewijnstichting om JMT.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li>
<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
<li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Roco+protein+family%3A+a+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affinity LRRK tagged eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De a...

Leucine rich repeat kinasen 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomein paralogen die een soortgelijke domeinnaam organisatie delen. Beide eiwitten coderen een GTPase sequentie verwant aan de familie van Ras GTPases (Ras van complexe eiwitten, of ROC) en een C-terminale domein van ROC (COR), effectief classificeren beide eiwitten aan de ROCO eiwitfamilie 5,6. N-terminus van de ROC-COR domein tandem, beide eiwitten coderen een leucine-rich repeat domein en een ankyrine-achtige domein, terwijl slechts LRRK2 codeert extra armadillo domein 6-8. C-terminus van ROC-COR, beide eiwitten delen een serine-threonine kinase domein terwijl slechts LRRK2 codeert voor een WD40 domein in het C-terminale gebied 8. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl genetische gegevens wijzen op een rol voor LRRK2 in de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; De fosforylering van eiwitten is een gemeenschappelijk mechanisme in cellen. Bijvoorbeeld kan fosforylatie van essentieel belang voor de activering van enzymen of de werving van eiwitten aan een signaleringscomplex. De cellulaire fosforylering van LRRK2 is uitgebreid gekarakteriseerd en phosphosite mapping is gebleken dat een meerderheid van de cellulaire fosforylatieplaatsen te komen in een cluster tussen de ankyrin repeat en leucine rich repeat domeinen 9-11. Hoewel LRRK1 cellulaire fosforyleringsplaatsen zijn nog niet in kaart gebracht, gegevens uit studies met fosfoproteïne kleuring van blots van immunologisch LRRK1 eiwit van COS7 cellen suggereert dat LRRK1 eiwit is gefosforyleerd in cellen 12. Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affiniteit tagged LRRK proteins worden uitgedrukt in HEK293T cellen die blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De affiniteit tag (3xflag) wordt vervolgens gebruikt om de LRRK eiwitten van andere cellulaire componenten te isoleren door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots.

<table><tbody><tr><td>Fosfor-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer dinatriumfosfaat in 1 ml water</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217;s Gemodificeerd Eagle Medium (D-MEM) (1X), vloeibaar (hoge glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Dit medium bevat geen fosfaten</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiniteit gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Voor een gelijkwaardig product met rood gekleurde gel (handig om de kralen gemakkelijker te visualiseren), gebruik cat. Nr. F2426.</td></tr><tr><td>Extra dikke blotting filter</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S-oplossing</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabole labeling van leucine rich repeat kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn paralogen die eenzelfde domein organisatie delen, waaronder een serine-threonine kinase domein, een Ras van complexe eiwitten domein (ROC), een C-terminale domein van ROC (COR), en leucine-rijke en ankyrine-achtige herhalingen in de N-terminus. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4. In dit rapport presenteren we een protocol bij de LRRK1 en LRRK2 eiwitten te labelen in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om de algemene fosforylering niveaus van deze 2 eiwitten in cellen te meten. Kortom, affiniteit gelabeld LRRK eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkeleuur incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. Via de affiniteit tag (3xflag) de LRRK eiwitten worden geïsoleerd van andere cellulaire componenten door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan fosforylering van andere eiwitten die tot expressie worden gebracht in cellen en geïsoleerd door immunoprecipitatie controleren.

<html> Om de algemene fosforylering niveaus van LRRK1 en LRRK2 vergelijken in cellen, 3xflag gelabeld LRRK1 en LRRK2 werden uitgedrukt in HEK293T cellen 15. Cellen werden gekweekt in 6-well platen en gemerkt met 32P en geanalyseerd zoals hiervoor in de tekst beschreven protocol. Figuur 1 geeft representatieve resultaten voor metabolisch merken van LRRK1 en LRRK2 in HEK293T cellen. Radioactief fosfaat opname wordt waargenomen voor zowel LRRK1 en LRRK2. Bij kwantificering van de ...

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de eiwitten van belang te labelen met radioactieve fosfaten om de eiwitten, cellulaire fosforylatieniveaus te kwantificeren. Dit wordt bereikt door cellen te kweken in aanwezigheid van fosfor 32 om de fosfaatmodificaties van eiwitten die in de cellen worden tot expressie gebracht radioactief te labelen. Als tweede stap worden gelabelde cellen gelyseerd en worden lysaten geïncubeerd met affiniteitskralen voor immunozuivering van de te analyseren eiwitten.Vervolgens worden monsters van gelabelde en gezuiverde eiwitten gedraaid op natriumdo desalsulfaat, polyacrylamide gelelektroforese en geblotted naar poly olainefluoride membranen. Om de incorporatie van radioactief fosfaat en eiwitniveaus te detecteren, worden resultaten verkregen die laten zien dat leucinerijke herhalingskinasen een en twee, afgekort L rrk een en L rrk twee, worden gefosforyleerd in cellen tot vergelijkbare niveaus op basis van autoradiografie en immunodetectie. Een belangrijk voordeel van de metabolische labeltechniek in vergelijking met andere technieken zoals fosfo-, immunoblotting, is dat deze techniek de bepaling van totale cellulaire fosforylatieniveaus van

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Deze video toont technieken voor de etikettering van menselijke embryonale stamcellen en mesenchymale stamcellen met fluorescerende kleurstoffen. Deze techniek kan worden gebruikt voor een in-vivo volgen van getransplanteerde stamcellen met optische beeldvorming en voor histopathologisch correlaties met fluorescentie microscopie.

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Leer hoe je LRRK1 en LRRK2 kinasen metabool labelt met radioactief fosfaat om fosforyleringsniveaus in cellen te kwantificeren. Deze methode werkt zonder specifieke fosfo-antilichamen.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Meer video's verkennen