Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie
September 30th, 2013
Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een live time-lapse opname te genereren van neurale crestcelmigratie om de vorming van zich ontwikkelende craniumfaciale structuren te tonen. Dit wordt bereikt door eerst een geanesthetiseerd transgeen SOX 10 KD-zebravisje in agarose te monteren om beweging gedurende het experiment tot een minimum te beperken. Vervolgens wordt onder een confocale microscoop UV-fotoactivatie uitgevoerd om KD van groen naar rood te converteren in neurale crestcellen.
Vervolgens wordt de focus gelegd op de foto omgezette neurale crestcellen. Een Zack wordt gegenereerd van de zich ontwikkelende structuur voordat een time-lapse video wordt opgenomen. Resultaten worden verkregen die de ontwikkeling van craniale neurale crestcellen tot de primaire kaak van de zebravis in een transgeen SOX 10 KD-zebravisje embryo tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals statische beeldvorming, is dat complexe ontwikkelingsprocessen zoals celmigratie in realtime kunnen worden gevisualiseerd. Dit maakt de resultaten toegankelijker voor de wetenschappelijke gemeenschap. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe structuren afgeleid van neurocrestcellen worden gevormd en hoe PTO-genen hun ontwikkeling beïnvloeden.
Om embryo's voor montage voor te bereiden, gebruik een 125 milliliter fles om E drie water met laagsmeltend aeros-microgolfoven op te lossen. Voeg vervolgens trica toe en plaats de fles in een waterbad van 50 graden Celsius om warm te blijven en nest de helder fluorescente transgene soine KD-zebravis embryo's op 60 uur na bevruchting. Breng ze vervolgens elk over naar een kamerschijven met tissuepapier.
Zuig het overtollige E drie water op en gebruik vervolgens de agarro-oplossing om het embryo te bedekken. Gebruik een micro loader-tip om de embryo perfect dorssaal te positioneren, zodat de embryo's volledig ondergedompeld zijn in agarro. Nadat de agarro is gestold, gebruik E drie 0,015% trica om de kamerschijven te vullen om fotoconversie uit te voeren.
Begin met het gebruik van een 20 x lucht-immersieobjectief om te focussen op het embryo. Druk vervolgens op de L 100-lichtknop op de microscoop en selecteer kanalen in de software. Open de pictogrammen.
Bekijk acquisitiecontroles A een instellingen en klik op de confocale instellingenknop. Klik vervolgens op auto en selecteer DPI 4 88 en 561,9 voor kanalen 1, 2, 3 respectievelijk voordat u het venster weer sluit. Schakel vervolgens kanalen één en drie uit voordat u op de vergrendelingsknop klikt en op de scanknop drukt, beginnend met één frame per seconde en HV 200.
Begin met focussen op cellen van belang. Verhoog geleidelijk het aantal frames per seconde tot één per 32 en verlaag de spanning tot 100 tot 120, afhankelijk van de achtergrondruis. Wanneer het embryo scherp staat, grijpt u de groene rand aan de rechterkant van het scherm en verkleint deze om deze in de te converteren fotogebied te passen voordat u met de muis met de rechtermuisknop klikt.
Verander de frames per seconde naar één en de HV naar 200 en druk op scan. Een ingezoomd beeld van het gebied van fotoconversie zal nu zichtbaar zijn. Volgende foto.
Converteren cellen door kanaal één aan te zetten voor een periode van vijf tot 60 seconden totdat het groene KD-signaal bijna afwezig is. Schakel vervolgens het dappy-kanaal uit. Schakel kanalen twee en drie in om terug te keren naar de oorspronkelijke zoom.
Klik met de rechtermuisknop op het zoomvenster en kies terugkeren naar oorspronkelijke grootte om te controleren of de gewenste cellen voldoende zijn gefotoconverteerd. Stel de limieten van de Zack in door het pictogram Capture Z Series in de menubalk te kiezen. Pas de lookup-tabellen of uts aan om een time-lapse op te zetten.
Kies de A een eenvoudige GUI-box en vink de volgende instellingen aan. Een per 32 frames per seconde. Grootte 1024 en gemiddelde vier of acht x, afhankelijk van het aantal Z-stacks dat in één lus moet worden genomen.
Ga vervolgens naar weergave acquisitiecontroles ND-sequentie-acquisitie en stel de tijdsperiode in. Klik vervolgens op continu en vervolgens Zack. Stel de randen in zoals eerder is gedemonstreerd.
Start de film, voeg E drie 0,015% trica-oplossing toe aan de kamer, glijd gedurende de dag en vul de kamer volledig voor overnacht opname. Wanneer de opname is voltooid, maak een hoogwaardige video van het beeldbestand door op maximale intensiteitsprojectie te klikken. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op het beeld en maak een nieuw document.
Verwijder onnodige frames en pas de L uts aan. In deze film die Palato Genesis in de zebravis toont, wordt de SOX 10 K transgene lijn gebruikt om craniale neurale crestcellen te volgen terwijl ze zich ontwikkelen om de primaire kaak te vormen. De meest voorste cellen van de zich vormende kaak worden gefotoconverteerd van groen naar rood op 60 uur na bevruchting.
Wanneer de gepaarde trabeculae zijn samengekomen om de primaire kaak te vormen, worden deze cellen vervolgens gevolgd tot ze hun eindbestemming bereiken. Deze film toont verstoorde kaakontwikkeling die leidt tot de vorming van een orofaciale spleet, morino-gemedieerde knockdown van speck. Een lb, een gen dat betrokken is bij oblique faciale spleetvorming, wordt als voorbeeld gebruikt.
Bij 60 HPF eenzijdige fotoconversie van de meest voorste etmoïdale plaatcellen toont een falen van de effusie tussen de mediale en laterale etmoïdale plaatcellen. Dit defect lijkt op de pathogenese van de ontwikkeling van oblique faciale spleet bij mensen waarbij een falen van de effusie tussen het laterale nasale proces en de maxillaire prominentie optreedt. Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van ontwikkelingsbiologie om neurocrestcelontwikkeling in zebravis te onderzoeken.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze methode kunt gebruiken om uw ontwikkelingsproces van belang vast te leggen.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het visualiseren van neurale crestcelmigratie in zebravisembryo's door middel van live time-lapse opnames. Door gebruik te maken van fotoconversie van het kaede-eiwit, kunnen onderzoekers de ontwikkeling van craniofaciale structuren beter begrijpen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Embryologie
Achtergrond
- Visualisatie van experimentele gegevens is cruciaal voor wetenschappelijke communicatie.
- Time-lapse opnames verhogen het begrip van complexe ontwikkelingsprocessen.
- Transgene zebravismodellen zijn waardevol voor het bestuderen van neurale crestceldynamica.
- Fotoconversietechnieken maken nauwkeurige tracking van cellulaire veranderingen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Live time-lapse opnames genereren van neurale crestcelmigratie.
- De vorming van craniofaciale structuren in zebravis illustreren.
- Fotoconversie gebruiken voor verbeterde visualisatie van cellulaire processen.
Gebruikte methoden
- Anesthetische transgene SOX 10 KD zebravis in agarose monteren.
- UV fotoactivering uitvoeren om kaede-eiwit van groen naar rood te converteren.
- Foto-geconverteerde neurale crestcellen onder een confocale microscoop focussen.
- Time-lapse video's opnemen om de ontwikkeling van craniofaciale structuren vast te leggen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van neurale crestcelmigratie in zebravis.
- Demonstratie van craniofaciale neurale crestcellen die zich ontwikkelen tot de primaire verhemelte.
- Generatie van een time-lapse video die de cellulaire dynamica laat zien.
- Inzichten in de rol van SOX 10 in craniofaciale ontwikkeling.
Conclusies
- Het protocol demonstreert effectief het gedrag van neurale crestcellen in vivo.
- Fotoconversie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van craniofaciale ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
