Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie
30 september 2013
Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een live time-lapse opname te maken van de migratie van neurale kamcellen om de vorming van ontwikkelende craniofaciale structuren aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst een geanestheseerde transgene SOX 10 KD zebravis in agarose te monteren om beweging tijdens het experiment te minimaliseren. Vervolgens wordt onder een confocale microscoop UV-fotoactivatie uitgevoerd om KD in neurale kamcellen om te zetten van groen naar rood.
Richt u zich vervolgens op de gefotoconverteerde neurale lijstcellen. Er wordt een Z-stapel gegenereerd van de ontwikkelende structuur voordat een time-lapsevideo wordt opgenomen. De resultaten tonen de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen tot het primaire palatum van de zebravis in een transgene SOX 10 KD zebravisembryo.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals statische beeldvorming, is dat complexe ontwikkelingsprocessen zoals celmigratie in real-time kunnen worden gevisualiseerd. Dit maakt de resultaten toegankelijker voor de wetenschappelijke gemeenschap. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe structuren afgeleid van neurale kamcellen worden gevormd en hoe PTO-genen hun ontwikkeling beïnvloeden.
Om de embryo's voor te bereiden op montage, gebruik een kolf van 125 milliliter om E drie water te mengen met laag-smeltpunt aeros microwave om de oplossing op te lossen. Voeg vervolgens trica toe en plaats de kolf in een waterbad van 50 degree Celsius om deze warm te houden en nest de helder fluorescerende transgene soine KD zebra vis embryo's op 60 hours post fertilisatie. Draag ze vervolgens elk over naar een chamber slide met weefselpapier.
Absorbeer het overtollige E three-water en gebruik vervolgens de agarro-oplossing om het embryo te bedekken. Gebruik een microlader-tip om het embryo perfect dorsaal te positioneren, waarbij u ervoor zorgt dat de embryo's volledig ondergedompeld zijn in agarro. Nadat de agarro is gestold, vult u het kamerdia met E three 0,015% trica om de fotoconversie uit te voeren.
Begin met het gebruik van een 20x luchtimmersie-objectief om op het embryo te focussen. Druk vervolgens op de L 100-lichtknop op de microscoop en selecteer de kanalen in de software. Open de pictogrammen.
Bekijk de acquisitie-instellingen A one en klik op de knop voor de confocale opstelling. Klik vervolgens op auto en selecteer DPI 4 88 en 561.9 voor respectievelijk kanalen 1, 2 en 3 voordat u het venster opnieuw sluit. Schakel daarna kanalen één en drie uit voordat u op de knop om de interlock te verwijderen klikt en op de scan-knop drukt, beginnend bij 1 frame per seconde en HV 200.
Begin met het scherpstellen op de cellen van belang. Verhoog geleidelijk het aantal frames per seconde naar één per 32 en verlaag het voltage naar 100 tot 120, afhankelijk van de achtergrondruis. Wanneer het embryo scherp is, pakt u de groene rand aan de rechterkant van het scherm vast en verkleint u deze zodat deze precies het gebied omsluit dat gefotoconverteerd moet worden, waarna u met de rechtermuisknop klikt.
Wijzig het aantal frames per seconde naar één en de HV naar 200 en druk op scan. Een ingezoomde afbeelding van het fotoconversiegebied zal nu zichtbaar zijn. Volgende foto.
Converteer de cellen door kanaal één gedurende vijf tot 60 seconden in te schakelen, totdat het groene KD-signaal bijna afwezig is. Schakel vervolgens het dappy-kanaal uit. Schakel kanaal twee en drie in om terug te keren naar de oorspronkelijke zoom.
Klik met de rechtermuisknop op het zoomvenster en kies 'terugkeren naar oorspronkelijke grootte' om te controleren of de gewenste cellen adequaat zijn gefotoconverteerd. Stel de limieten van de Z-stap in door het icoon 'Capture Z Series' in de menubalk te selecteren. Pas de opzoektabellen of LUT's aan om een time-lapse in te stellen.
Kies het eenvoudige GUI-vak A en vink de volgende instellingen aan. Eén per 32 frames per seconde. Grootte 1024 en gemiddeld vier of acht x, afhankelijk van het aantal Z-stacks dat in één loop moet worden genomen.
Ga vervolgens naar de acquisitie-instellingen voor de ND-sequentieacquisitie en stel het tijdsframe in. Klik daarna op 'continuous' en vervolgens op 'Zack'. Stel de begrenzingen in zoals eerder gedemonstreerd.
Start de film, voeg E three 0,015%trica-oplossing toe aan de kamer, schuif gedurende de dag en vul de kamer volledig voor imaging gedurende de nacht. Wanneer de imaging is voltooid, maakt u een video van hoge kwaliteit uit het imaging-bestand door te klikken op 'show maximum intensity projection'. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer 'create new document'.
Verwijder overbodige frames en pas de L uts aan. In deze film waarin de palatogenese bij de zebravis wordt getoond, wordt de SOX 10 K transgene lijn gebruikt om craniale neurale kamcellen te volgen terwijl ze zich ontwikkelen tot het primaire palatum. De meest anterieure cellen van het vormende palatum worden 60 uur na bevruchtingsproces gefotoconverteerd van groen naar rood.
Wanneer de gepaarde trabeculae elkaar hebben ontmoet om het primaire palatum te vormen, worden deze cellen vervolgens gevolgd tot ze hun uiteindelijke bestemming bereiken. Deze film demonstreert een verstoorde palatumontwikkeling die leidt tot de vorming van een oro-faciale spleet, veroorzaakt door morino-gemedieerde knockdown van speck. Een lb, een gen betrokken bij schuine faciale spleten, wordt als voorbeeld gebruikt.
Bij 60 HPF vertoont unilaterale fotoconversie van de meest anterieure cellen van de ethmoïdale plaat een gebrekkige fusie tussen de mediane en de laterale cellen van de ethmoïdale plaat. Dit defect vertoont overeenkomsten met de pathogenese van de ontwikkeling van schuine gezichtsspleten bij mensen, waarbij een gebrekkige fusie tussen het laterale neusproces en de maxillaire uitstulping optreedt. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie om de ontwikkeling van neurale lijstcellen in zebravissen te bestuderen.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze methode kunt gebruiken om het ontwikkelingsproces waarin u geïnteresseerd bent vast te leggen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het visualiseren van de migratie van neurale kamcellen in zebravisembryo's via live time-lapse opnames. Door gebruik te maken van fotoconversie van het kaede-eiwit kunnen onderzoekers de ontwikkeling van craniofaciale structuren beter begrijpen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Embriologie
Achtergrond
- Visualisatie van experimentele gegevens is cruciaal voor wetenschappelijke communicatie.
- Time-lapse-opnamen verbeteren het begrip van complexe ontwikkelingsprocessen.
- Transgene zebravismodellen zijn waardevol voor het bestuderen van de dynamiek van neurale kamcellen.
- Fotoconversietechnieken maken nauwkeurige tracking van cellulaire veranderingen mogelijk.
Doel van de studie
- Om live time-lapse opnamen te maken van de migratie van neurale kamcellen.
- Om de vorming van craniaal-faciale structuren bij zebravis te illustreren.
- Om fotoconversie te gebruiken voor verbeterde visualisatie van cellulaire processen.
Gebruikte methoden
- Het monteren van geanestheseerde transgene SOX 10 KD zebravissen in agarose.
- Het uitvoeren van UV-fotoactivatie om het kaede-eiwit van groen naar rood om te zetten.
- Het focussen op gefotoconverteerde neurale kamcellen onder een confocale microscoop.
- Het opnemen van time-lapse video's om de ontwikkeling van craniale structuren vast te leggen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de migratie van neurale kamcellen in zebravisen.
- Demonstratie van craniale neurale kamcellen die zich ontwikkelen tot het primaire palatum.
- Generatie van een time-lapse video die de cellulaire dynamiek illustreert.
- Inzichten in de rol van SOX 10 bij de craniofaciale ontwikkeling.
Conclusies
- Het protocol demonstreert effectief het gedrag van neurale kamcellen in vivo.
- Fotoconversie is een krachtig instrument voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de craniofaciale ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het visualiseren van de dynamiek van craniale neurale kamcellen in zebravis biedt een voorspellend model voor mechanische risicoreductie bij de validatie van craniofaciale targets. Het sox10:kaede transgene systeem maakt temporele tracking met een hoge resolutie mogelijk van migratie- en differentiatiegebeurtenissen die relevant zijn voor de menselijke gezichtsmorfogenese. Deze benadering ondersteunt vroege ontdekkingen door genetische perturbaties te koppelen aan fenotypische uitkomsten in een ziekterelavant systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de bijdragen van de craniale neurale kam aan de maxillaire en mandibulaire elementen te volgen.
- Operationele waarde: Maakt precieze lineage-restrictie mogelijk via een photoconverteerbare kaede-reporter, waardoor label-ambiguïteit wordt verminderd in vergelijking met kleurstofinjectie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt fenotypische screening van craniofaciale mutanten om target-engagement en padmodulatie te beoordelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve spatiotemporele gegevens over celmigratie en weefselconvergentie voor standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Produceert reproduceerbare time-lapse resultaten die compatibel zijn met high-content imaging-pipelines.
- Schaalbaarheid: Aanpasbaar aan elke kaede of fotoconverteerbare reporter in transgene zebravis voor hergebruik van het platform.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Illustreert de homologie van de gezichtsuitstulpingen van zebravissen met die van amnioten, wat de translationele relevantie vergroot.
- Operationele waarde: Legt zowel normale als abnormale craniofaciale ontwikkeling vast in mutanten voor fenotypische validatie.
- Risicobeperking: Maakt observatie mogelijk van defecten in de uitstulpingen die de pathogenese van menselijke orofaciale clefts modelleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door live-imaging van structuren afkomstig van de neurale lijst te bieden voorafgaand aan compound-screening.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van genfuncties bij de migratie van craniale neurale kamcellen en de vorming van het gehemelte.
- Screening: Levert kwantitatieve confocale meetwaarden voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op celdynamiek.
- Analytiek: Maakt meting mogelijk van migratiesnelheid, convergentietiming en de vorming van weefselgrenzen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de ontwikkeling van het gehemelte bij zebravissen met menselijke craniofaciale homologen voor de afstemming van biomarkers.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare imagingcapaciteit voor de beoordeling van ontwikkelingsfenotypen over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door directe visualisatie van beslissingen over het cellot.
- Operationele waarde: Standardiseert fotoactivatie- en time-lapseprotocollen voor reproduceerbare tracking van de neurale lijst.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door genetische targets te koppelen aan observeerbare craniofaciale fenotypes.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van de ernst van het ontwikkelingsfenotype.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in zebravissen-embryologie, confocale microscopie en de omgang met fotoconverteerbare eiwitten.
- Afhankelijk van UV-compatibele confocale systemen en een infrastructuur voor agarose-inbedding voor de immobilisatie van embryo's.
- Necessiteert standaardisatie van de duur van de fotoactivatie en de acquisitie van z-stacks tussen verschillende gebruikers.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten variërende promoter-gestuurde reporters en ontwikkelingsstadia tussen verschillende zebravissen-stammen.
- Praktische beperkingen omvatten fototoxiciteit door langdurige UV-blootstelling en de levensvatbaarheid van embryo's tijdens langdurige beeldvorming.
