Multi-Scale modificatie van metalen implantaten Met Pore Verlopen, polyelektrolieten en hun indirecte monitoring In vivo

Het algemene doel van deze procedure is om metaalimplantaten op meerdere lengteschalen te wijzigen om het celgedrag in vitro en in vivo te beheersen. Dit wordt bereikt door eerst een poriegroottegradiënt te produceren binnen driedimensionale buisvormige implantaten, Biofreeze extractiemethode. De tweede stap is om nano fibrillaire basementmembraan-nabootsingen te ontwikkelen op basis van collageen en alginaat door middel van een laag-voor-laag-methode.

Vervolgens een indirecte methode om dergelijke implantaten na implantatie te monitoren met behulp van bloedplasma-analyse. HPLC en daaropvolgende peptide-sequencing wordt gedemonstreerd, uiteindelijk een implantaat waarbij verschillende gebieden verschillende celtypen kunnen accommoderen indien nodig. Voor sommige meercellige weefsels kan dit systeem een manier bieden om metaalimplantaten te wijzigen.

Het kan ook worden toegepast op 3D-celcultuurmodelsystemen zoals kunstmatig weefsel of ziektemodellen. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we probeerden een techniek te vinden om de celbeweging rond poreuze titanium-implantaten in vivo te beheersen. Om deze procedure te starten, maak de implantaten schoon en ontwerp en vervaardig Teflon-malen zoals beschreven in de tekst voor bevriezing en extractie.

Bereid de synthetische polymeer PLLA-oplossing voor in een binair mengsel van dioxine en water door het polymeerpoeder in het organische oplosmiddel te introduceren. Verwarm het mengsel op een magnetisch Starr tot 60 graden Celsius om een homogene oplossing te verkrijgen. Deze temperatuur is geselecteerd omdat het de hogere limiet is van de temperatuurbestendigheid voor de glasinjectiespuiten van precisie die worden gebruikt voor het inbrengen van de oplossing in de implantaten.

Bereken ondertussen het volume van de benodigde polymeeroplossing met betrekking tot de porositeit van het implantaat, rekening houdend met de verandering in het volume van de bevroren oplossing. Introduceer vervolgens de oplossing in de implantaten met behulp van glasinjectiespuiten van precisie met een nauwkeurigheid van 0,1 microliter. De ondergrens voor de polymeerconcentratie is 3% voor reproduceerbare PO-gradiëntvorming, of zodra het moeilijk wordt om een homogene verdeling in de dikke monsters boven 6% te verkrijgen, bevries de monsters ofwel direct bij minus 80 graden Celsius of met een voorafgaande incubatieperiode van 30 minuten bij kamertemperatuur.

De bevriezingscondities bepalen gedeeltelijk de porievorming. Daarom kunnen de bevriezingscondities worden aangepast aan de beoogde porositeit. Bewaar de monsters een nacht bij minus 80 graden Celsius.

Het scheiden van de mal in de bevroren toestand is een zeer moeilijke stap. Zorg ervoor dat het contact van de bevroren bodemloze oplossing met de mal wordt verminderd, met behulp van een scalp. Dompel de implantaten in 80% voorgekoeld ethanol om porositeitsgradiënten te verkrijgen. Gebruik een voorgekoeld scalpel om alle malonderdelen te verwijderen, behalve de mandril, voor de buisvormige implantaten en alle delen behalve het onderste deel voor schijfvormige implantaten, voer de extractie uit bij minus 20 graden Celsius gedurende de nacht.

Na extractie verwijdert u de resterende malonderdelen en laat u de implantaten aan de lucht drogen. Voor karakterisering van de algehele porositeit van de structuur is kwikoximeteranalyse noodzakelijk.

In dit voorbeeld tonen kwikoximetermetingen duidelijke pieken die overeenkomen met de poriën aan beide zijden van het implantaat en de kleinere intergedispergeerde poriën. De belangrijkste gegevens zijn echter het verschil tussen de porositeit van de intraluminale en extraluminale oppervlakken, die kan worden geanalyseerd met behulp van image J voor poriegrootteverdeling. Na het bevriezen en breken van de monsters door de dwarsdoorsnede te observeren met een rasterelektronenmicroscoop.

Vanwege de open poreuze aard van de gebruikte implantaten en de lichtreflecterende capaciteit van titanium is het mogelijk om Z-stacks van gelabelde cellen binnen de poreuze implantaten te maken. Cellen gelabeld met PKH 26 of calcium AM kunnen worden gebruikt om de implantaten te visualiseren met behulp van confocale lasermicroscopie voor de opbouw van meerdere lagen. De hoogste reproduceerbaarheid wordt verkregen met dompelrobots.

Indien een dompelrobot echter niet beschikbaar is, kunnen deze stappen handmatig worden uitgevoerd. Gebruik voor de bereiding van de collageenoplossing medisch geclassificeerd collageen type één en natriumalginaat. De geoptimaliseerde concentraties zijn 0,5 gram per liter voor elk in 150 millimolair.

Natriumchloridecitraatbuffer bij pH 3,8 lost de collageenoplossing een nacht lang op om de homogeniteit te waarborgen. De zure pH van 3,8 is noodzakelijk voor een stabiele opbouw van de lagen, omdat de structuur onstabiel is. Voordat de cross-linking plaatsvindt.

Ontwerp in neutraal pH een specifieke houder voor het gebruik van de implantaten met dompelrobots die worden gebruikt bij de productie van poly-elektrolyt-multilagen. Deponeer de lagen op het oppervlak van alleen titanium implantaten of implantaten gemodificeerd zoals beschreven in de tekst. Gebruik een dompelrobotsysteem door de implantaten eerst 15 minuten in een alginaatoplossing te dompelen, spoel vervolgens de structuur met 150 millimolair natriumchloride bij pH 3,8 gedurende vijf minuten.

Volg met een dompeling in een collageenoplossing gedurende 15 minuten. Om de basementmembraan eerst te stabiliseren, bereidt u de cross-linkoplossing voor bij 100 millimolair genine. In A-D-M-S-O-citraatbuffer bij een volumeverhouding van een op vier lost u genine op in het DMSO-component en vervolgens in het watercomponent om klontering te voorkomen. Cross-link de monsters door ze tussen 12 en 24 uur in de cross-linkoplossing te dompelen.

Spoel met overvloedige hoeveelheden citraatbuffer bij pH 3,8 Na het wassen van de stappen, steriliseer de monsters met UV-behandeling gedurende 30 minuten of in een antibiotische antischimmelbad. De belangrijkste parameters die de kwaliteit van de basementmembraan-nabootsing bepalen, zijn de dikte en de diameter van de vezels. Bereken de vezeldiamters met behulp van atoomkrachtmicroscopie of een FM-beeld verkregen in contactmodus.

Na het drogen van de monsters met een stikstofstroom, bepaal voor het