Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

Het algemene doel van deze procedure is om de krachtgeneratie te meten tijdens een maximale samentrekking van de stamspier bij zebravislarven. Dit wordt bereikt door eerst hechtlussen te maken die worden gebruikt om de larven op hun plaats te houden tijdens krachtmetingen. Vervolgens wordt de verdoofd gelaten larve in de experimentele kamer geplaatst.

Eenmaal op zijn plaats, wordt de kracht geregistreerd tijdens een maximale twitch-samentrekking. De laatste stap is om de afmetingen van de stamspieren te meten zodat de piekkracht kan worden genormaliseerd naar de spierdoorsnede. Uiteindelijk wordt het meten van krachtgeneratie tijdens samentrekking gebruikt om veranderingen in spierfunctie en algehele spiergezondheid te laten zien.

Hoewel we deze methode demonstreren met wilde zebravislarven, kan deze ook worden gebruikt bij genetisch gemodificeerde larven of larven die zijn behandeld met geneesmiddelen of toxische stoffen. De methode kan vervolgens worden gebruikt om modellen van spierziekten te karakteriseren en behandelingen te evalueren of om spierontwikkeling, verwondingen of chemische toxiciteit te bestuderen. De eerste stap is het voorbereiden van de hechtlussen die zullen worden gebruikt om de larven op hun plaats te houden.

Gedurende het krachttesten, gebruikt u een pincet om een niet-steriele hechtdraad in drie strengen te scheiden. Eenmaal gescheiden, begint u een dubbele boegslag in een van de strengen te binden, maar stop voordat u de knoop volledig vastdraait om een ​​kleine lus te maken. In plaats van de lus af te maken, gebruikt u een schaar om overtollig hechtdraad van de staarten af te knippen.

Plaats de lus op de plakkerige kant van een plakbriefje voor later gebruik. Maak twee hechtlussen voor elke larve die zal worden getest. Plaats eerst het testapparaat op het podium van een stereomicroscoop.

Verbind vervolgens de krachttransducer en lengteregelaarkabels met het testapparaat. Schakel de krachttransducer en de lengteregelaar in en draai de schakelaar aan de voorkant van de lengteregelaar. Dat maakt de lengteregelaarbuis verbonden met een wegwerpoverdrachtspijp.

Vul de experimentele kamer met testoplossing. Gebruik een pincet om een ​​hechtlus op te pakken door een van de staarten als grijphaak. De lus op het gebogen gedeelte kan de hechtdraad doen knellen en ervoor zorgen dat deze breekt tijdens volgende stappen.

Hang een lus aan de krachttransducerbuis en een andere aan de lengteregelaar Met een wegwerpoverdrachtspijp brengt u een zebravislarve over naar een kleine petrischaal gevuld met testoplossing. Zodra de verdoving heeft ingewerkt, duwt u zachtjes tegen de staart om te controleren of er een gebrek aan aanraakgeïnduceerde zwemmen is. Gebruik vervolgens een glazen pijp om de larve naar de experimentele kamer over te brengen met behulp van een pincet.

Leidt u voorzichtig het voorste gedeelte van de larve door de hechtlus op de krachttransducerbuis en grijpt u beide staarten van de hechtlus. Trek ze tegelijkertijd om de lus achter de eiken zak of zwemblaas te vernauwen met een pincet. Houd één hechtstaart vast en trek, waardoor de larve 90 graden om de buis draait totdat de laterale kant van de larve omhoog staat.

Gebruik de X, Y, Z positioneringsinrichting die aan de lengteregelaar is bevestigd om de lengteregelaarbuis langs de x-as te bewegen en onder de stam en staart van de larve. Laat ruimte tussen de uiteinden van de lengteregelaarbuis en de krachttransducerbuis. Leid vervolgens de hechtlus over de staart van de larve en draai de hechtlus vast.

Zoals eerder is aangetoond, moet u mogelijk het achterste gedeelte van de larve draaien zodat de laterale kant omhoog staat. Eenmaal op zijn plaats, snoeit u de staarten van de hechtlus. Gebruik de XY, Z positioneringsapparaten om de buizen langzaam te laten zakken totdat ze net de bodem van de kamer raken.

Vervolgens brengt u de larve op een geschikte afstand van de bodem van de kamer. Dit moet binnen de werkafstand van een geïnverteerd microscoopobjectief dat later wordt gebruikt. Pas ten slotte de lengteregelaarbuis aan om de lange as van de larve uit te lijnen met de lange as van de krachttransducerbuis.

Om te beginnen, verplaatst u het testapparaat naar het podium van een geïnverteerd microscoop. Verbind vervolgens de waterbadcirculatorthermometer en de temperatuurregelaar met het testapparaat. Schakel de noodzakelijke componenten in en stel de instelling op de temperatuurregelaar in op de gewenste waarde.

Verbind kabels van de stimulator naar het testapparaat. Schakel de stroom van de stimulator in, maar stimuleer de larven op dit moment nog niet. Om te controleren of de larve parallel is aan de onderkant van de kamer, bekijkt u het gedeelte van de larve tussen de uiteinden van de buizen.

Als het parallel is, zullen beide uiteinden van de larve in focus zijn indien nodig. Pas de krachttransducerbuis aan totdat beide uiteinden in focus zijn en de larve parallel is. Schakel het videosarcomeerlengtesysteem in en draai de videocamera zodat de strepen parallel zijn aan de zijkanten van het videoframe.

De strepenafstand wordt gebruikt als een indicator van de sarcomeerlengte. Pas de microscoop aan om te focussen op perifere vezels en noteer de aangegeven sarcomeerlengte. Als dat nodig is, pas de lengteregelaar aan om de larve te verkorten totdat de sarcomeerlengte minder dan optimaal is om de twitch-kracht te optimaliseren.

Stel eerst de uitgangsstroom op de stimulator in op een lage grootte en programmeer vervolgens gespecialiseerde software om stroompulsen te leveren. 0,2 milliseconden in duur. Lever de eerste puls en gebruik de oscilloscoop om de piekkracht van de twitch te meten.

Verhoog de stroom met 50 milliamp-incrementen en meet de piekkracht van de twitch bij elke nieuwe stroomniveau. Wacht 30 seconden tussen twitches om vermoeidheid te voorkomen terwijl de stimulatiestroming toeneemt. Piekkracht van de twitch neemt doorgaans toe tot een maximum en neemt vervolgens geleidelijk af bij de stroom waarop de