Synthese, Cellular Levering en In vivo Toepassing van Dendrimeer-gebaseerde pH Sensoren

Het algemene doel van het volgende experiment is om nieuwe fluorescente sensoren te ontwikkelen op basis van Dun drummers met verbeterde eigenschappen voor pH-beeldvorming in vitro in levende cellen en in vivo. Dit wordt bereikt door eerst pH-gevoelige kleurstoffen te koppelen aan een dendritisch scaffold samen met andere groepen, zoals targetinggroepen of pH-gevoelige kleurstoffen. En in vitro metingen worden genomen om een pH-kalibratiecurve te genereren naast het beeldvormen van pH in levende cellen.

De sensor wordt geleverd door middel van elektroporatie en pH-kaarten worden gegenereerd met behulp van confocale microscopie om pH in de extracellulaire ruimte van de hersenen af te beelden. Tijdens fysiologische en pathologische neurale activiteit wordt de sensor micro geïnjecteerd in de hersenen van verdoofde muizen. Fluorescerende gegevens worden vervolgens verzameld met behulp van twee-fotonmicroscopie.

De verkregen resultaten tonen aan dat drimmer-gebaseerde sensoren slagen in het meten van pH-veranderingen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie, zowel in levende cellen als in vivo. Hoewel er al verschillende flues-kleurstoffen met pH-gevoelig gedrag zijn gebruikt, lijden ze aan verschillende nadelen, zoals slechte mobiliteit en cellek. Bovendien staan ze de rash metrische absolute meting niet toe.

Hier hebben we de koppeling van pH-gevoelige kleurstoffen aan een D-genetisch scaffold aangetoond, en aangezien de prestaties een nauwkeurige meting met speciale en temporele resolutie mogelijk maken, zou deze methode een nuttig hulpmiddel kunnen zijn om fysiologische en pathologische processen te bestuderen die worden gereguleerd door pH in levende cellen. De verstoring van de pH-regulatie in het neurosysteem wordt geassocieerd met verschillende aandoeningen zoals beroerte en epilepsie, en beschikbare pH-sensoren bleken weinig effectief te zijn, wat leidde tot het ontwerp van de gepresenteerde sensor. Hoewel deze methode hier is toegepast op pH-beeldvorming, is het een algemene aanpak en kan het worden toegepast op andere biologisch relevante soorten.

Door de winstgevende kleurstof te kiezen, maakt de eenvoudige en veelzijdige synthetische benadering deze procedures eenvoudig. Het demonstreren van de procedure van vandaag zal Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody en Sebastian Suli To zijn om pH-indicatoren te koppelen aan Piam Demers. Begin met het oplossen van de rimer in anhydrisch DMSO bij een eindconcentratie van 50 micromolar.

Bereid 10 micromolar stockoplossingen van fluoresceïne NHS en Tetraethyl RUMINE NHS, ook bekend als TMR in anhydrisch, DMSO in een microcentrifugebuis, gecombineerd met een milliliter van G vier peram dederer oplossing met acht equivalenten, of 40 microliters van fluoresceïne en acht equivalenten, of 40 microliters van TMR. De molaire verhouding in het mengsel zal de hoeveelheid kleurstof weerspiegelen die op de demer is geladen. Roer de oplossing 12 uur bij kamertemperatuur.

Verdun vervolgens het mengsel één op tien met gedeïoniseerd water en laad het reactiemengsel in een dialysezak met een molecuulgewichtsgrens van 10 kilodalton. Dialyseer tegen gedeïoniseerd water en vervang het water in het reservoir drie keer gedurende 24 uur. De volgende dag brengt u de oplossing over in een glazen buis en bevriest deze gedurende enkele uren op min 80 graden Celsius. Wanneer de oplossing volledig bevroren is, brengt u de buis over in een lyofilisaat en vriest u deze 24 uur lang droog.

Er zou een paarse poeder moeten worden verkregen, een golf verkregen vaste stof, en het moet worden opgelost in mqe-water. Bij een eindconcentratie van 10 micromolar. Verdeel de oplossing in 50 microliter-aliquots in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes en bewaar ze op min 20 graden Celsius.

Voor in vitro-kalibratie bereidt u een 500 nanomolar oplossing van D drummer in twee millimolar PBS in een kwarts Q vet. Er wordt een zeer verdunde PBS-buffer gebruikt om abrupte pH-veranderingen tijdens de titratie te voorkomen. Meet de emissiespectra van fluoresceïne en TMR en optimaliseer de optische instellingen van de fluorimeter om een goede signaal-ruisverhouding te bereiken.

Voer vervolgens een pH-titratie uit door kleine volumes van 0,1 normaal natriumhydroxide en 0,1 normaal zoutzuur toe te voegen. Na elke toevoeging schudt u de Q vet om te mengen. Wacht een minuut voor evenwicht en meet vervolgens de pH met behulp van een pH.

Micro-elektrode-emissiespectra van fluoresceïne en TMR moeten voor elke stap worden geregistreerd zonder enige verandering. Plot in de optische instellingen de fluorescentie-intensiteit versus pH. Voor de titratie mag het rod domine-signaal niet worden beïnvloed door pH.

Het fluoresceïnesignaal moet een sigmoïdale curve zijn en moet worden aangepast met een enkel bindingsmodel met een PK van 6,4 voor elektroporatie. Breng zes keer 10 naar de vijfde hela-cellen in 72 microliters over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis naar de resuspendeerde cellen. Voeg dendri of een waterige oplossing toe bij een concentratie van twee micromolar, voeg drie milliliter elektroporatiebuffer toe aan een micro-puratiebuis.

Gebruik vervolgens een 10 microliter elektroporatietip om de cel- en rimermengsels aan te zuigen. Plaats vervolgens de micropipet in het pipetteerstation en stel hier de micro-puratiepulscondities in. De pulsspanning is ingesteld op 1005 volt.

De pulsbreedte is ingesteld op 35 milliseconden en het aantal pulsen is ingesteld op twee na de pulsplaat. 20 microliter van de geëlektroporiseerde cellen op glazen bodemschalen met vers medium zonder antibiotica. 12 uur na elektroporatie worden de cellen afgebeeld met een confocale microscoop met behulp van een standaard filterset voor fluoresceïne en r domine.

Concentreer u op het specimen en pas de laservermogen en detectorversterking aan om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Als de elektroporatie succesvol was, zouden cellen fel fluorescerend moeten zijn in beide kanalen. De lokalisatie hangt af van de grootte en lading van de D die worden gebruikt. Vaak.

Sun lysosomale lokalisatie, die wordt gezien als kleine perinucleaire vesikels, is aanwezig als gevolg van endocy