Synthese, Cellular Levering en In vivo Toepassing van Dendrimeer-gebaseerde pH Sensoren
September 10th, 2013
Fluorescentie sensoren zijn krachtige hulpmiddelen in life science. Hier beschrijven we een methode te synthetiseren en te gebruiken dendrimeer gebaseerde fluorescente sensoren pH meten in levende cellen en in vivo. De dendritische steiger versterkt de eigenschappen van geconjugeerde fluorescente kleurstoffen leidt tot betere detectie eigenschappen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om nieuwe fluorescente sensoren te ontwikkelen op basis van Dun drummers met verbeterde eigenschappen voor pH-beeldvorming in vitro in levende cellen en in vivo. Dit wordt bereikt door eerst pH-gevoelige kleurstoffen te koppelen aan een dendritisch scaffold samen met andere groepen, zoals targetinggroepen of pH-gevoelige kleurstoffen. En in vitro metingen worden genomen om een pH-kalibratiecurve te genereren naast het beeldvormen van pH in levende cellen.
De sensor wordt geleverd door middel van elektroporatie en pH-kaarten worden gegenereerd met behulp van confocale microscopie om pH in de extracellulaire ruimte van de hersenen af te beelden. Tijdens fysiologische en pathologische neurale activiteit wordt de sensor micro geïnjecteerd in de hersenen van verdoofde muizen. Fluorescerende gegevens worden vervolgens verzameld met behulp van twee-fotonmicroscopie.
De verkregen resultaten tonen aan dat drimmer-gebaseerde sensoren slagen in het meten van pH-veranderingen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie, zowel in levende cellen als in vivo. Hoewel er al verschillende flues-kleurstoffen met pH-gevoelig gedrag zijn gebruikt, lijden ze aan verschillende nadelen, zoals slechte mobiliteit en cellek. Bovendien staan ze de rash metrische absolute meting niet toe.
Hier hebben we de koppeling van pH-gevoelige kleurstoffen aan een D-genetisch scaffold aangetoond, en aangezien de prestaties een nauwkeurige meting met speciale en temporele resolutie mogelijk maken, zou deze methode een nuttig hulpmiddel kunnen zijn om fysiologische en pathologische processen te bestuderen die worden gereguleerd door pH in levende cellen. De verstoring van de pH-regulatie in het neurosysteem wordt geassocieerd met verschillende aandoeningen zoals beroerte en epilepsie, en beschikbare pH-sensoren bleken weinig effectief te zijn, wat leidde tot het ontwerp van de gepresenteerde sensor. Hoewel deze methode hier is toegepast op pH-beeldvorming, is het een algemene aanpak en kan het worden toegepast op andere biologisch relevante soorten.
Door de winstgevende kleurstof te kiezen, maakt de eenvoudige en veelzijdige synthetische benadering deze procedures eenvoudig. Het demonstreren van de procedure van vandaag zal Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody en Sebastian Suli To zijn om pH-indicatoren te koppelen aan Piam Demers. Begin met het oplossen van de rimer in anhydrisch DMSO bij een eindconcentratie van 50 micromolar.
Bereid 10 micromolar stockoplossingen van fluoresceïne NHS en Tetraethyl RUMINE NHS, ook bekend als TMR in anhydrisch, DMSO in een microcentrifugebuis, gecombineerd met een milliliter van G vier peram dederer oplossing met acht equivalenten, of 40 microliters van fluoresceïne en acht equivalenten, of 40 microliters van TMR. De molaire verhouding in het mengsel zal de hoeveelheid kleurstof weerspiegelen die op de demer is geladen. Roer de oplossing 12 uur bij kamertemperatuur.
Verdun vervolgens het mengsel één op tien met gedeïoniseerd water en laad het reactiemengsel in een dialysezak met een molecuulgewichtsgrens van 10 kilodalton. Dialyseer tegen gedeïoniseerd water en vervang het water in het reservoir drie keer gedurende 24 uur. De volgende dag brengt u de oplossing over in een glazen buis en bevriest deze gedurende enkele uren op min 80 graden Celsius. Wanneer de oplossing volledig bevroren is, brengt u de buis over in een lyofilisaat en vriest u deze 24 uur lang droog.
Er zou een paarse poeder moeten worden verkregen, een golf verkregen vaste stof, en het moet worden opgelost in mqe-water. Bij een eindconcentratie van 10 micromolar. Verdeel de oplossing in 50 microliter-aliquots in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes en bewaar ze op min 20 graden Celsius.
Voor in vitro-kalibratie bereidt u een 500 nanomolar oplossing van D drummer in twee millimolar PBS in een kwarts Q vet. Er wordt een zeer verdunde PBS-buffer gebruikt om abrupte pH-veranderingen tijdens de titratie te voorkomen. Meet de emissiespectra van fluoresceïne en TMR en optimaliseer de optische instellingen van de fluorimeter om een goede signaal-ruisverhouding te bereiken.
Voer vervolgens een pH-titratie uit door kleine volumes van 0,1 normaal natriumhydroxide en 0,1 normaal zoutzuur toe te voegen. Na elke toevoeging schudt u de Q vet om te mengen. Wacht een minuut voor evenwicht en meet vervolgens de pH met behulp van een pH.
Micro-elektrode-emissiespectra van fluoresceïne en TMR moeten voor elke stap worden geregistreerd zonder enige verandering. Plot in de optische instellingen de fluorescentie-intensiteit versus pH. Voor de titratie mag het rod domine-signaal niet worden beïnvloed door pH.
Het fluoresceïnesignaal moet een sigmoïdale curve zijn en moet worden aangepast met een enkel bindingsmodel met een PK van 6,4 voor elektroporatie. Breng zes keer 10 naar de vijfde hela-cellen in 72 microliters over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis naar de resuspendeerde cellen. Voeg dendri of een waterige oplossing toe bij een concentratie van twee micromolar, voeg drie milliliter elektroporatiebuffer toe aan een micro-puratiebuis.
Gebruik vervolgens een 10 microliter elektroporatietip om de cel- en rimermengsels aan te zuigen. Plaats vervolgens de micropipet in het pipetteerstation en stel hier de micro-puratiepulscondities in. De pulsspanning is ingesteld op 1005 volt.
De pulsbreedte is ingesteld op 35 milliseconden en het aantal pulsen is ingesteld op twee na de pulsplaat. 20 microliter van de geëlektroporiseerde cellen op glazen bodemschalen met vers medium zonder antibiotica. 12 uur na elektroporatie worden de cellen afgebeeld met een confocale microscoop met behulp van een standaard filterset voor fluoresceïne en r domine.
Concentreer u op het specimen en pas de laservermogen en detectorversterking aan om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Als de elektroporatie succesvol was, zouden cellen fel fluorescerend moeten zijn in beide kanalen. De lokalisatie hangt af van de grootte en lading van de D die worden gebruikt. Vaak.
Sun lysosomale lokalisatie, die wordt gezien als kleine perinucleaire vesikels, is aanwezig als gevolg van endocy
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het synthetiseren van dendrimeer-gebaseerde fluorescente sensoren die bedoeld zijn voor het meten van pH-niveaus in levende cellen en in vivo. Het gebruik van een dendritisch schakel verbetert de eigenschappen van geconjugeerde fluorescente kleurstoffen, wat resulteert in verbeterde detectiecapaciteiten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescentie beeldvorming
- Cellulaire biologie
- Neurowetenschap
Achtergrond
- Fluorescentie sensoren zijn essentiële hulpmiddelen in de life sciences.
- Dendrimers kunnen de prestaties van fluorescente kleurstoffen verbeteren.
- pH-meting is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire omgevingen.
- Bestaande methoden kunnen gevoeligheid of specificiteit missen.
Doel van het onderzoek
- Om nieuwe fluorescente sensoren voor pH-beeldvorming te ontwikkelen.
- Om de eigenschappen van pH-gevoelige kleurstoffen te verbeteren door gebruik te maken van dendritische schakelstructuren.
- Om in vitro en in vivo pH-metingen in levende cellen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Conjugatie van pH-gevoelige kleurstoffen aan dendritische schakelstructuren.
- In vitro metingen om een pH-kalibratiecurve te creëren.
- Elektroporatie voor sensoraflevering in cellen.
- Confocale microscopie voor het beeldvormen van pH in de extracellulaire ruimte.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van dendrimeer-gebaseerde fluorescente sensoren.
- Verbeterde gevoeligheid en specificiteit in pH-metingen.
- Effectieve beeldvorming van pH in levende cellen en hersenweefsel.
- Aangetoonde bruikbaarheid tijdens fysiologische en pathologische omstandigheden.
Conclusies
- Dendrimeer-gebaseerde sensoren vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang in pH-beeldvorming.
- Deze sensoren kunnen worden toegepast in verschillende biologische contexten.
- Toekomstige studies kunnen extra toepassingen in de neurowetenschap verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Dendrimer-based pH sensors address a key challenge in discovery biology: the need for reliable, ratiometric pH measurements in complex biological systems. By improving intracellular targeting and reducing dye leakage, these sensors enhance predictive confidence in pathway interrogation and target validation studies. Their compatibility with live-cell and in vivo imaging supports translational continuity from mechanistic de-risking to preclinical biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pH-dependent therapeutic hypotheses in live cells.
- Scientific Value: Supports functional target validation by correlating pH fluctuations with pathway activity.
- Operational Value: Reduces false positives from dye leakage and nonspecific signaling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, ratiometric readouts for high-confidence assay normalization.
- Operational Value: Improves assay reproducibility through stable intracellular retention of the sensor.
- Operational Value: Facilitates multiplexing with other fluorescent readouts due to distinct excitation/emission profiles.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links pH dysregulation to disease models in vivo, supporting biomarker relevance.
- Scientific Value: Enables longitudinal monitoring of pH changes during physiological and pathological challenges.
- Operational Value: Compatible with electrophysiological recordings for multimodal data integration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in cultured cells to target engagement validation in disease-relevant systems, particularly where pH modulates target function or drug response.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying pH’s role in signaling cascades and organelle function.
- Screening: Delivers ratiometric, concentration-independent readouts that improve hit validation confidence.
- Analytics: Provides dual-channel fluorescence ratio outputs enabling robust data normalization across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro pH responses to in vivo tissue-level changes, aiding preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Represents a modular sensor platform adaptable to other analytes via dye conjugation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in pH-sensitive pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sensor synthesis and delivery protocols.
- Strategic Value: Supports earlier go/no-go decisions by flagging pH-related liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on pH-dependent activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic conjugation, fluorescence spectroscopy, and microscopy.
- Needs access to dialysis, lyophilization, electroporation, and confocal/two-photon imaging systems.
- Demands cross-team standardization for sensor preparation, storage, and quality control.
- Must account for dendrimer size and charge effects on localization and toxicity in different cell types.
- Limited by the pKa range of the conjugated dye, requiring analyte-specific sensor design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:30
Synthesis of the Sensors
4:20
In vitro pH Measurements
5:36
Cell Culture and Electroporation
6:38
pH Sensing in Living HeLa Cells
8:47
In vivo Sample Preparation
10:30
pH Imaging in Mouse Brain
12:24
Representative Analysis of Dendrimer-based pH Sensor Fluorescence
15:45
Conclusion
