Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek In vivo
July 9th, 2013
De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een laat In vivo Context. Immunofluorescentiekleuring nauwkeurig visualiseren vasculaire plexus is cruciaal voor het succes van deze typen studies.
Het algemene doel van deze procedure is om angiogenesis in de neonatale muisretina te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de postnatale ogen te nucleeren, en vervolgens een fixatief toe te passen. De derde stap is om de postnatale muisretina zorgvuldig te dissecteren in een bloemvorm, en de laatste stap is om het retinale vaatwerk te kleuren. Uiteindelijk wordt visualisatie van het vaatwerk van de muisretina bereikt door middel van fluorescente kleuring en confocale microscopie.
Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Simon Tlo, een post-doc in mijn laboratorium, en Kathleen Allenson, een eerder lid van mijn laboratorium. Gedurende deze procedure is de standaardtemperatuur kamertemperatuur. Begin door een humaan gedode muispop op zijn zij te leggen met een schaar.
Verwijder de huid die het oog bedekt. Vervolgens, met de schaar onder het oog gepositioneerd, snij de oogzenuw en omliggende weefsels door en til het oog eruit. Breng het uitgewiste oog over in een 24-wellsplaat met fixatief, wat 4% PFA is in twee keer.
Ga verder met het dissecteren van het volgende oog terwijl er een in het fixatief ligt. Het tijdsverschil tussen de twee oogdissecties is een halve minuut. Met oefening.
Laat elk oog 10 tot 15 minuten fixeren. Vervolgens breng ze over in koud twee keer PBS op ijs gedurende minimaal vijf tot tien minuten. Voordat u de retina's isoleert, verzamelt u zoveel ogen in het PBS als gewenst, met behulp van een plastic weidepipet die is gesneden om de bok te verbreden.
Breng de ogen over in een petrischaal met twee keer PBS onder een dissecteermicroscoop. Verwijder eventueel vet rond het oog met behulp van pincetten en schaar. Prik met scherpe schaar in de rand van het hoornvlies en snijd rond het hoornvlies en de iris, gooi deze weefsels weg.
Voer vervolgens de pincetten in tussen retina en sclera. Verwijder de sclera, zorg ervoor dat de retina niet scheurt. De choroïdelaag kan ook worden verwijderd, zolang er geen risico is op beschadiging van de retina.
Het achterlaten van de choroïdelaag mag de kwaliteit van de immunokleuring niet aanzienlijk beïnvloeden. Verwijder nu met behulp van pincetten de lens en het glasvocht. Verwijder vervolgens de aloïsche vaten.
Gebruik fijne pincetten om ze samen te brengen in het midden van het oog. Trek ze vervolgens snel weg van het centrum van de retina. Wees extra voorzichtig om alle gele distels te verwijderen, want als u er enkele achterlaat, kunnen ze uw staande resultaten verduisteren.
De bekervormige retina moet nu worden overgebracht naar een schone petrischaal en schoongemaakt met PBS. Ga nu de retina in. Maak vier tot vijf radiale incisies die ongeveer tweederde van de weg naar het centrum bereiken.
Gebruik veerscharen om deze peddelvormige retina te maken. Deze stap vereist geduld en oefening om te perfectioneren. Trek nu het meeste PBS af met behulp van een weidepipet.
Dit zal de retina afvlakken. Verwijder vervolgens eventueel overtollig PBS met een klein stukje absorberend papier. Breng vervolgens min 20 graden methanol druppel voor druppel aan op het oppervlak van de retina totdat het grotendeels ondergedompeld is, en voeg vervolgens overvloedig methanol toe.
De retina's worden wit. Deze stap helpt de retina's te fixeren en zal de penetratie vergemakkelijken. Breng de retina's in het koude methanol over naar een kleine buis.
Gebruik een plastic pipet met een brede opening. Laat ze minimaal 20 minuten in het koude methanol incuberen. De retina's kunnen eventueel in het methanol op min 20 graden gedurende enkele maanden blijven. Het antilichaam wordt hier alleen gebruikt.
De cine kan niet met succes worden gebruikt op een moederlijk gefixeerde retina. In dit geval moet de retina direct naar immunokleuring overgaan na het platgelegd te zijn in een bloemvorm. Begin met voorzichtig het methanol van de retina's te pipetten.
Geef de retina's vervolgens een snelle en zachte spoeling in één keer PBS. Verwijder het PBS en bedek de retina's met 100 microliter permblockoplossing met 5% van de juiste serum. Zet de retina's om later een uur lang zachtjes te schudden.
Verwijder de permblockoplossing met een pipet en vervang deze door 100 microliter permblockoplossing met het primaire antilichaam of is selectine voor. Zet de retina's dan in om te incuberen overnacht bij vier graden Celsius met schudden de volgende ochtend. Was de retina's vier keer in PBS TX gedurende 10 minuten per wasbeurt.
Gebruik tijdens alle wasstappen zachte schudbewegingen. Als het primaire antilichaam niet geconjugeerd is, voeg dan 100 microliter van het juiste fluorescerende secundaire antilichaam toe, verdund tot één op 200 in PBS tx. Incubeer de retina's overnacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur bij kamertemperatuur met zachte agitering om het secundaire antilichaam te verwijderen.
Was de retina's vier keer in PBS TX met zachte schudbewegingen gedurende 15 minuten per wasbeurt. Ga nu verder met het monteren. Breng de retina's over op dia's met behulp van een plastic pipet met een brede opening en verwijder eventueel overtollig P-B-S-T-X met een zakdoek.
Monteer vervolgens de retina's in 50 microliter verlengd goud en bedek de oplossing voorzichtig met een dekglas. Om de verlengde goudtijd in te stellen, bewaar de dia's een nacht lang in de koelkast bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Ga door met het beeldvormen van de retina's na de dissectie.
De retina zou eruit moeten zien als een platte bloem met behulp van ISO selectine B vier Alexa 4 88. De endotheelcellen zijn gekleurd en lijken groen van kleur. Ondersteunende vasculaire spiercellen werden gevisualiseerd met behulp van Antifa gladde spier, actine. Het gebruik van een lage vergroting, toegestaan een overzicht van de vasculaire organisatie van de retina door een andere combinatie van antilichamen te gebruiken.
Endotheelcellen kunnen worden gezien met behulp van anti CD 31 immunokleuring, ondersteunende parasieten
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze procedure onderzoekt angiogenesis in het neonatale muisretina, een goed gekarakteriseerd model voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling. Het omvat zorgvuldige dissectie en kleuring van het retinale vaatstelsel om angiogenesis in vivo te visualiseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Angiogenesis
- Retinaire ontwikkeling
Achtergrond
- Het neonatale muisretina is een gevestigd model voor angiogenesis studies.
- Het begrijpen van de rollen van genen en medicijnen in angiogenesis is cruciaal voor therapeutische ontwikkeling.
- Immunoflurescente kleuring is essentieel voor het visualiseren van het vasculaire plexus.
- Dit model maakt in vivo onderzoeken van vasculaire modulatie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de mechanismen van angiogenesis in het neonatale muisretina te onderzoeken.
- Om het retinale vaatstelsel te visualiseren met behulp van fluorescente kleuringstechnieken.
- Om de procedure te demonstreren voor toekomstige onderzoekstoepassingen.
Gebruikte methoden
- Het nucleeren van postnatale ogen van muispups.
- Het aanbrengen van een fixatief om de weefselstructuur te behouden.
- Het dissecteren van de retina in een bloembladvorm voor optimale kleuring.
- Het gebruik van confocale microscopie voor de visualisatie van geverfd vaatstelsel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van het retinale vasculaire plexus.
- Demonstratie van het angiogeneseproces in een gecontroleerde omgeving.
- Inzichten in de modulatie van angiogenesis door verschillende factoren.
- Een betrouwbare methode vaststellen voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het neonatale muisretina dient als een effectief model voor angiogenesis onderzoek.
- Fluorescente kleuring en confocale microscopie zijn vitaal voor het visualiseren van vasculaire structuren.
- Deze procedure kan helpen bij het begrijpen van de genetische en farmacologische invloeden op angiogenesis.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
