Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten
1 september 2013
Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.
Het algemene doel van deze procedure is om subcellulaire structuren in muis-speekselklieren te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst de speekselklieren chirurgisch bloot te leggen zonder ze te beschadigen. In de tweede stap wordt het verdopte dier geïmmobiliseerd op de microscoopstandaard.
Vervolgens worden de speekselklieren zorgvuldig gepositioneerd om hun functie in de laatste stap niet te compromitteren. De muis wordt gestabiliseerd met een aangepaste houder om eventuele bewegingsartefacten als gevolg van de hartslag of ademhaling van het dier te minimaliseren. Uiteindelijk kunnen de dynamica van de subcellulaire structuren worden geïmageert door intra vitale microscopie.
Voor de anesthesie weegt u de muizen om de juiste dosis anestheticum te bepalen. Gebruik vervolgens isofluorine-inhalatie voor pre-anesthesie. Zodra de dieren bewusteloos zijn, bevestigt u de sedatie elke 15 minuten door poppinch en houdt u de muizen onder een verwarmingslamp gedurende de duur van de operatie.
Controleer de lichaamstemperatuur van de dieren met een rectale sondethermometer. Scheer vervolgens de nek van de muis met een elektrische tondeuse en gebruik vervolgens een met ethanol doordrenkte gaasdoek om de ventrale zijde van de nek schoon te maken, waarbij u het overtollige alcohol droogt met de kimdoek. Gebruik vervolgens een paar doffe gebogen pincetten om een klein stukje huid op te tillen aan de onderzijde van de massiter-spieren en maak een kleine incisie.
Breng de schaar in de incisie, waarbij de punten omhoog naar de onderkant van de huid wijzen en de bladen meerdere keren openen totdat de huid zich heeft gescheiden van het onderliggende weefsel. Begin dan bij de basis van de speekselklieren waar de zenuwduct en bloedvaten de klier met de rest van het lichaam verbinden. Gebruik de schaar om een 3 millimeter brede, 10 millimeter lange strook losgekomen huid te snijden.
Na het schoonmaken van het wondgebied, zal de resulterende opening een ellipsvormige vorm hebben en ongeveer acht bij 12 millimeter meten. Beide speekselklieren zullen zichtbaar zijn. Gebruik een spuit om optisch koppelingsgel in het midden van de snede aan te brengen en gebruik vervolgens verse stukken steriele gaas om het gel naar de buitenkant van de opening te vegen totdat al het bloed en loszittende haren zijn verwijderd.
Gebruik nu een paar nummer zeven pincetten om het uiteinde van de rechter speekselklier te vinden, waarbij het bindweefsel enkele millimeters boven het bovenste deel van de klier wordt vastgegrepen. Scheur vervolgens het bindweefsel rond de klier zonder het parenchym te verwonden. Zodra de klier is blootgelegd, scheidt u voorzichtig het bindweefsel van de klier en spoelt u eventueel bloeden weg met zoutoplossing.
Zorg ervoor dat alle bindweefsels zijn gescheiden en de klier volledig is blootgelegd. Voordat u het dier naar de microscoop brengt, plaatst u een dik stuk gaas en een verwarmingspak op de microscoopstandaard, waarbij u de bovenkant van het verwarmingspak ook bedekt met een dun stuk gaas. Plaats een dekglas over het midden van de standaard.
Plaats vervolgens de muis op zijn rechterzij op de gaas, zet het dier vast met een stuk plakband op de ventrale zijde van de voorste rechterpoot en een zijden hechtstof die om de snijtanden is gehaakt. Zorg voor enige spanning tussen de draad en de poot en bevestig ze aan de standaard. Met meer plakband zou de speekselklier natuurlijk moeten rusten.
In het midden van het dekglas. Gebruik plastic wiggen die aan de microscoopstandaard zijn gekoppeld om het hoofd en de thorax van de muis verder te stabiliseren. Plaats vervolgens een klein stukje lensreinigingsdoek over de klier.
Strek de klier lichtjes uit en plaats een aangepaste houder over de klier. Koppel vervolgens de stabilisator stevig aan de standaard met een metalen klem en plakband. Bedek het dier met gaas en een verwarmingskussen en controleer de temperatuur van de blootgestelde klieren met een flexibele thermisch gekoppelde sondevormig thermometer Direct na het stabiliseren van het dier, gebruik epifluorescentie-verlichting om te focussen op het oppervlak van de klier.
Beoordeel de bloedstroom in de haarvaten en de algehele morfologie van het weefsel. Gebruik een 488 nanometer laser om het GFP-gen te exciteren. Stel het piekvermogen in op 0,5 milliwatt om fotobleking voor het tandem-tomaat-eiwit te voorkomen.
Gebruik een 561 nanometer laser en stel het piekvermogen in op één milliwatt. Beoordeel nu de stabiliteit van het weefsel door het geselecteerde gebied voor te scannen. Als de voorbereiding niet stabiel is, pas dan het dier aan om het juiste brandpunt te vinden.
In de voorbeeldmodus. Beweeg het objectief geleidelijk naar het dekglas totdat de aser-structuren, secretoire korrels en plasmamembraan duidelijk zichtbaar worden. Gebruik vervolgens een scansnelheid van 0,5 tot twee seconden per frame en 256 bij 256 pixels met een ruimtelijke schaal van 0,2 micrometer per pixel om de dynamica van de secretoire korrels te beeld.
Om de korrels en het plasmamembraan optimaal te visualiseren, stelt u de optische dikte in op tussen de 0,9 tot 1,2 micrometer. Neem vervolgens een afbeelding van het gezichtsveld op om als referentiepunt te worden gebruikt. Stimuleer ten slotte exocytose door subcutaan 0,1 milligram per kilogram vers bereid isoproterenol en zoutoplossing te injecteren.
Een minuut na de injectie. Fusie van de secretoire korrels met het plasmamembraan zal worden gedetecteerd door een toename van de GFP-fluorescentie rond de korrels en de diffusie van het tandem-tomaat-peptide in hun begrenzende membranen. In de GFPM-tomaatmuis verschijnen de asine als duidelijk verschillende structuren die cytosolisch GFP en op het membraan gerichte tandem-tomaat-peptide uitdrukken, zoals aangegeven door de stippellijnen.
In individuele asine aser-cellen worden afgebakend door het tandem-tomaat-peptide, zoals aangegeven door de pijlen. GFP wordt ook ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerde methode voor het visualiseren van subcellulaire structuren in muze speekselklieren met behulp van intravitale microscopie. De procedure omvat de chirurgische blootstelling van de klieren, immobilisatie van het dier en nauwkeurige positionering om bewegingsartefacten te minimaliseren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Intravitale microscopie maakt real-time imaging van biologische processen mogelijk.
- Het is bijzonder nuttig voor het bestuderen van dynamische cellulaire structuren.
- Speekselklieren dienen als model voor het observeren van subcellulaire dynamiek.
- Het begrijpen van deze dynamiek kan inzicht bieden in diverse fysiologische processen.
Doel van de Studie
- Om de dynamiek van subcellulaire structuren in levende muizen te visualiseren.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het in beeld brengen van secretoire granula.
- Om het begrip van cellulaire functies in speekselklieren te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Chirurgische blootstelling van de speekselklieren zonder schade te veroorzaken.
- Immobilisatie van het geanestheseerde dier op de microscopietafel.
- Zorgvuldige positionering van de speekselklieren om de functie te behouden.
- Gebruik van een op maat gemaakte houder om de muis te stabiliseren en bewegingsartefacten te verminderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van subcellulaire structuren in levende speekselklieren.
- Demonstratie van de dynamiek van secretoire granules.
- Validatie van de methode voor toekomstige studies in levende diermodellen.
- Inzichten in de fysiologische rollen van deze structuren.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van subcellulaire dynamiek.
- Intravitale microscopie kan worden toegepast op diverse biologische onderzoeksgebieden.
- Deze techniek verdiept ons begrip van cellulaire processen in vivo.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Intravitale microscopie maakt real-time visualisatie van subcellulaire dynamiek in levende diermodellen mogelijk, wat cruciale mechanistische inzichten biedt voor targetvalidatie en padanalyse. Door de exocytose van secretoire granules en membraantransport in speekselklieren in beeld te brengen, ondersteunt deze methode de preklinische risicoreductie van GPCR-gemedieerde signaleringspaden die relevant zijn voor metabole en secretoire ziekte-targets. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door moleculaire verstoringen te koppelen aan functionele subcellulaire uitkomsten in een fysiologisch relevante context.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe observatie mogelijk van de fusie van secretoire granula gestimuleerd door bèta-adrenerge receptoren, wat bijdraagt aan de functionele validatie van GPCR-doelen in levend weefsel.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform om kinase-, fosfatase- of cytoskeletregulatoren van exocytose te onderzoeken met behulp van fluorescente biosensoren.
- Therapeutische waarde: Faciliteert het mechanistische minimaliseren van risico's (de-risking) van verbindingen die zich richten op cAMP/PKA-paden door de kinetiek van subcellulaire translocatie in real-time te kwantificeren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Een gestabiliseerde preparatie van de speekselklier maakt consistente baseline-imaging van GFP- en tandem-Tomato-signalen mogelijk voor screening van verbindingenbibliotheken.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de frequentie van granula-fusie, membraandiffusiesnelheden en collapskinetiek mogelijk als functionele read-outs voor modulatie van het signaalpad.
- Schaalbaarheid: De chirurgische stabilisatie en imaging-workflow kunnen worden aangepast voor studies met meerdere dieren met gestandaardiseerde thermische controle en bewegingscontrole.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert gereguleerde secretie in exocriene weefsels, toepasbaar op studies naar pancreatitis, het syndroom van Sjögren of disfunctie van de cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR).
- Continuïteit van biomarkers: Fluorescente reporters voor granula-membranen en cytosol maken correlatie mogelijk tussen imaging-eindpunten en biochemische assays van secretie.
- Preklinische risicoreductie: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door target engagement te koppelen aan functionele subcellulaire resultaten voorafgaand aan fenotypering op organniveau.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, waarbij real-time subcellular imaging inzicht geeft in het werkingsmechanisme en de padselectiviteit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests van GPCR-effectorpaden door visualisatie van de rekrutering van downstream-effectoren en membraandynamiek in intact weefsel.
- Screening: Maakt assay-klare preparaten mogelijk voor het evalueren van compound-effecten op de kinetiek van exocytose met ruimtelijke en temporele resolutie.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve gegevens over verschuivingen in fluorescentie-intensiteit, diffusiesnelheden en de timing van vesikelcollaps om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire targeting aan functionele secretie in een ziekte-relevant exocrien model, wat extrapolatie naar humane pathofysiologie ondersteunt.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Het stabilisatie- en imagingplatform kan worden hergebruikt voor meerdere fluorescente reporters en ziektemodellen met minimale revalidatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in signaaltransductie door directe visualisatie van effector-translocatie en membraanintegratiegebeurtenissen te bieden.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd immobilisatie- en imagingprotocol verbetert de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en studieperioden.
- Strategische waarde: Maakt vroegtijdige identificatie van fout-positieve hits mogelijk door functionele subcellulaire activiteit te bevestigen, voorbij binding of bulk-biochemische assays.
- Impact op portfolio: Verhoogt het vertrouwen in targetselectie door pathway-engagement te valideren in een fysiologisch intacte, dynamische cellulaire omgeving.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muizchirurgie, anesthesie en het opzetten van intravitale microscopie.
- Afhankelijk van een confocale microscoop met 488 nm en 561 nm laserlijnen, een thermische stage en hardware voor bewegingsstabilisatie.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor dierpreparatie om de toegankelijkheid van de klier en functionele stabiliteit over verschillende experimenten heen te waarborgen.
- Aanpassing aan andere weefsels kan aangepaste stabilisatiebenaderingen vereisen vanwege verschillen in orgaanmobiliteit en toegankelijkheid.
- Beperkingen door fotobleken vereisen een zorgvuldige kalibratie van het laservermogen en een selectie van de framerate voor longitudinale beeldvorming.
