PCR: De polymerasekettingreactie

De polymerasekettingreactie of PCR is een veelgebruikte methode voor het amplificeren van DNA-fragmenten. PCR maakt gebruik van thermocyclen, waarbij de reactie herhaaldelijk wordt verwarmd en afgekoeld via drie verschillende temperaturen, genaamd denaturatie, annealing en extensie of elongatie.

De thermocycliseringsreactie begint zodra de PCR-reagentia in een thermocycler worden geplaatst, een apparaat dat is geprogrammeerd om de reactie nauwkeurig te verwarmen en te koelen.

De PCR-cyclus begint met denaturatie, die 20 tot 30 seconden duurt bij 95 °C, ruim boven de smelttemperatuur van DNA. De smelttemperatuur is de toestand waarin de helft van het DNA een dubbelstrengs helix is en de andere helft een enkelstrengs random coil. De denaturatietemperatuur ligt ruim boven de smelttemperatuur om ervoor te zorgen dat alle waterstofbruggen tussen complementaire basenparen worden verbroken, waardoor alleen enkelstrengs DNA overblijft. Gepaarde enkelstrengs worden de sense- en antisense-strengen genoemd. De sequentie van de sense-streng, of coderende streng, is identiek aan de sequentie van mRNA, dat uiteindelijk codeert voor eiwit. Daarom wordt deze de sense-streng genoemd. Wanneer deze van links naar rechts wordt gelezen, begint deze met het 5’-fosfaat en eindigt deze met de 3’-hydroxylgroep. De antisense-streng wordt ook de complementaire streng genoemd en begint met de 3’-hydroxylgroep en eindigt met het 5’-fosfaat wanneer deze van links naar rechts wordt gelezen.

In de tweede stap, het annealing, binden korte stukjes DNA, genaamd primers, die specifiek zijn voor de sense- of antisense-strengen, via waterstofbruggen. De primer die bindt aan de antisense-streng en dezelfde sequentie heeft als de sense-streng, is de forward- of sense-primer. De primer die bindt aan de sense-streng en een sequentie heeft die omgekeerd en complementair is aan de sense-streng, is de reverse- of antisense-primer. Afhankelijk van de lengte van de gebruikte primers ligt de annealing-temperatuur voor deze stap meestal 3 tot 5 °C onder de laagste smelttemperatuur van de twee primers. Annealing vindt doorgaans plaats tussen 50 en 65 °C en duurt 20 tot 40 seconden.

Zodra de primers aan het DNA binden, primen ze de reactie door een 3’-hydroxylgroep-uiteinde te creëren waaraan een polymerase, een enzym dat DNA repliceert, zich zal binden.

De volgende stap, genaamd elongatie of extensie, vindt plaats bij 72 °C, wat optimaal is voor de polymerase-activiteit. Zodra het polymerase is gebonden, begint het vrije nucleotidetrifosfaten, of dNTP's, één voor één in de 5’- naar 3’-richting aan de uiteinden van de primer toe te voegen om dubbelstrengs DNA te vormen.

Zodra de elongatie is voltooid, begint de volgende cyclus. In de volgende cyclus zullen primers binden aan het enkelstrengs DNA dat is gevormd via de vorige extensie. Het korte fragment dat men probeert te amplificeren, het amplicon, wordt uiteindelijk gevormd wanneer het polymerase verlengt vanaf de forward-primer op een streng die is gegenereerd door amplificatie vanaf de reverse-primer of vice versa. Eenmaal gegenereerd, zal de hoeveelheid amplicon exponentieel toenemen in opeenvolgende cycli. Afhankelijk van het doel van de reactie zijn 20 tot 40 cycli nodig.

Voor lange amplicons wordt doorgaans een laatste elongatiestap uitgevoerd bij 72 °C gedurende 5 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat al het DNA dubbelstrengs is. Meestal wordt een laatste hold-stap bij 4 °C in de thermocycler geprogrammeerd als voorzorgsmaatregel om ervoor te zorgen dat het DNA stabiel blijft totdat het uit de thermocycler wordt gehaald.

De PCR-reactie vereist verschillende belangrijke reagentia. Ten eerste is er het DNA-sjabloon, het DNA-monster waarvan het fragment wordt geamplificeerd. Daarnaast zijn er de primers, de korte stukjes DNA of oligonucleotiden die de polymerasereactie initiëren.

Bij de keuze van de primers moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke overwegingen. Ten eerste moeten ze complementair zijn aan de 5’- en 3’-regio's van het DNA-sjabloon die de sequentie die u wilt amplificeren flankeren. Ten tweede moeten ze tussen de 15 en 30 basenparen lang zijn en voor ongeveer 50% uit guanines en cytosines bestaan. Ten derde moeten de smelttemperaturen van beide primers boven de 50 °C liggen en binnen één tot twee graden van elkaar liggen, zodat ze efficiënt kunnen binden bij dezelfde annealing-temperatuur. Ten vierde mogen ze niet complementair aan elkaar zijn en primer-dimeren vormen. En ten vijfde mogen ze geen secundaire structuur bevatten, die wordt gevormd door zelf-annealing binnen één van de primers.

Naast de primers en het DNA-sjabloon is DNA-polymerase essentieel voor de PCR-reactie. Het enzym dat het meest wordt gebruikt in PCR is Taq-polymerase, een thermostabiel enzym geïsoleerd uit de bacterie Thermus aquaticus die voorkomt in warmwaterbronnen. Taq-polymerase kan temperaturen boven de 90 °C weerstaan.

dNTP's, die de basenparen in de groeiende strengen vormen, moeten ook aan de reactie worden toegevoegd. Een reactiebuffer, die de pH handhaaft en belangrijke ionen bevat zoals mangaan, magnesium en kalium, is eveneens een noodzakelijke component die de reactie stabiliseert en belangrijke cofactoren levert aan het polymerase-enzym. Zoals alle reacties heeft PCR een oplosmiddel nodig, waardoor PCR-kwaliteit water wordt gebruikt, dat vrij is van ionen die de reactie kunnen remmen.

Zorg ervoor dat de werkomgeving schoon is voordat u met de PCR begint om contaminatie te voorkomen. Handschoenen moeten altijd worden gedragen.

Om het overzicht te behouden van de verschillende reactiecomponenten die nodig zijn, maakt u een tabel met de reagentiavolumes en concentraties voor elk van uw monsters, inclusief de controles. Wat betreft de volumes bevat een typische reactie 5μL van 10X reactiebuffer, 4μL van 25 mM MgCl2, 1μL dNTP's bij 10 mM, 2μL forward- en reverse-primers bij 50 ng/μL en 0,3μL Taq polymerase bij 5 U/μL. Voeg voldoende template toe zodat er 100 ng in de reactie aanwezig is. De meeste PCR-reacties worden uitgevoerd in een totaalvolume van 50μL. Gebruik daarom een volume PCR-kwaliteit water om te garanderen dat het totaalvolume inderdaad 50μL is.

Zodra uw reactie op papier is gepland, verzamelt u de reagentia op ijs.

Voeg vervolgens de reagentia toe aan de PCR-buis. Voeg eerst het water toe, gevolgd door uw template, de primers, de buffer, magnesiumchloride en dNTP's; voeg als laatste Taq polymerase toe en meng het geheel grondig.

Nadat de reactie is klaargemaakt, plaatst u uw monster in een thermocycler en start u het PCR-programma. Kort samengevat bestaan de onderdelen van het apparaat uit een thermoblock, waarin de PCR-buis of plaat wordt geplaatst en die wordt onderworpen aan precieze temperatuurwijzigingen; een verwarmd deksel, dat condensatie voorkomt zodat er geen monster verloren gaat; en een interface met een display voor het programmeren van de PCR-temperaturen en cyclusduuren. Stel uw programma altijd in voordat u de reactie samenstelt.

Zodra de thermocycler het proces heeft voltooid, haalt u uw reactie eruit en verifieert u het PCR-product met gelelektroforese. Als de PCR succesvol is, moet u het amplicon op de juiste basenpaargrootte zien.

Hier volgen enkele nuttige tips voor het werken met PCR. Wanneer u probeert hetzelfde PCR-product te amplificeren uit een aantal verschillende templates en u dus veel verschillende reacties moet opzetten, is het handig om de reactie op te schalen door een mastermix te maken. De PCR-mastermix is een mengsel met een groot volume van alle reagentia die door uw monsters worden gedeeld, dat later over meerdere reactiebuisjes wordt verdeeld.

De meeste PCR-reacties beginnen met een initiële denaturatiestap, die plaatsvindt bij 95°C gedurende 1 tot 9 minuten. Deze stap zorgt ervoor dat al het template enkelstrengs is voor de eerste amplificatiecyclus.

Vaak is het wenselijk om een PCR-kast te gebruiken wanneer het risico op contaminatie van uw monster hoog is. Om eventuele contaminatie in uw reactie te controleren, is het raadzaam om een negatieve controle op te zetten; deze bevat geen DNA-template en zou geen product mogen opleveren in uw DNA-gel.

Vaak moet de PCR worden geoptimaliseerd door temperaturen of de magnesiumchlorideconcentratie aan te passen, of door nieuwe primers te proberen. Zodra uw PCR werkt, is het verstandig om altijd een positieve controleset-template mee te draaien, waarvan u weet dat deze een product zal opleveren.

Er bestaan veel variaties en toepassingen van PCR voor uiteenlopende doeleinden.

Een variatie van PCR, hot start PCR, houdt in dat de polymerase pas na de eerste denaturatiestap aan de reactie wordt toegevoegd, wat aspecifieke amplificatie voorkomt die vóór het cyclen zou kunnen optreden.

PCR kan ook worden aangepast om gelijktijdig meerdere DNA-sequenties te amplificeren door meerdere primers in één enkele PCR-reactie te gebruiken, wat multiplex PCR wordt genoemd.

In combinatie met fluorescerende oligonucleotide-sondes kan PCR een techniek worden waarmee relatieve of absolute niveaus van genexpressie kunnen worden gemeten, of de hoeveelheid mRNA die wordt geproduceerd voor een bepaald gen of een groep genen. Deze methode wordt aangeduid als qPCR.

PCR kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van een specifieke DNA-sequentie in een organisme vast te stellen. Deze procedure wordt genotyping genoemd. Genotyping kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de authenticiteit van vismonsters te bepalen door vast te stellen of een soortspecifieke sequentie in het monster aanwezig is. Genotyping wordt ook gebruikt bij forensische analyse om te bepalen of DNA dat op een plaats delict is gevonden, overeenkomt met dat van een verdachte.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over PCR bekeken. In deze video hebben we besproken wat PCR is en hoe het werkt, de vele componenten van de PCR-reactie, het mechanisme waarmee PCR DNA kan amplificeren en de vele variaties en toepassingen van deze uiterst nuttige techniek. Bedankt voor het kijken!