DNA-gelelektroforese

DNA-gelelektroforese is een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten op basis van grootte te scheiden en te identificeren.

DNA-fragmenten van verschillende groottes worden geladen in een poreuze gel gemaakt van agarose – een koolhydraat dat in rode algen voorkomt.

Wanneer er een elektrisch veld wordt aangelegd, migreren de fragmenten door de gel, dankzij de negatief geladen fosfaatgroepen in de DNA-nucleotiden.

Kleinere stukken DNA migreren gemakkelijker door de gel dan grotere fragmenten, die meer moeite hebben om door de gelmatrix te bewegen.

Wanneer de gelrun is voltooid, kan de locatie van de DNA-monsters worden vergeleken met een reeks fragmenten of banden van bekende groottes, een DNA-ladder genoemd.

De aanwezigheid van het fragment van belang kan vervolgens worden bevestigd op basis van de grootte, die wordt bepaald door de relatieve locatie van het testmonster te vergelijken met de fragmenten van de ladder.

Agarosegels worden bereid met een gewichts-volumeprocentoplossing. Zo vormt 1 gram agarose in 100 ml buffer een 1% gel. Gels met een lager percentage scheiden grotere fragmenten beter, terwijl gels met een hoger percentage kleinere fragmenten gemakkelijker identificeerbaar maken. Om te beginnen met de bereiding van de gel, weegt u de juiste massa agarose af in een Erlenmeyerkolf.

Voeg running buffer toe aan de kolf, zodanig dat het volume buffer niet groter is dan 1/3 van de capaciteit van de kolf. Draai de kolf vervolgens rond om te mengen.

Smelt het agarose/buffer-mengsel door het in een magnetron op maximaal vermogen te verhitten. Haal de kolf elke dertig seconden uit de magnetron en draai de inhoud rond om goed te mengen. Herhaal dit totdat de agarose volledig is opgelost.

Voeg vervolgens ethidiumbromide toe tot een concentratie van 0.5 mg/ml. Ethidiumbromide is een aromatische verbinding die tussen individuele baseparen van DNA past, of intercaleert, waardoor DNA een intense oranje fluorescentie uitzendt onder UV-licht. Het is belangrijk om te weten dat ethidiumbromide carcinogeen is, dus er moeten altijd handschoenen worden gedragen bij het hanteren van gels die deze verbinding bevatten.

Om te voorkomen dat de geltray kromtrekt, laat u de agarose afkoelen door deze in een 65ºC waterbad te plaatsen.

Terwijl de agarose afkoelt, bereidt u de gelvorm voor door de geltray in het gietapparaat te plaatsen. Als alternatief kunt u tape gebruiken om de open randen van de geltray af te dichten om de vorm te creëren. Door een kam in de gel te plaatsen, ontstaan de wells waarin het DNA wordt geladen. Zorg ervoor dat de kam een well creëert die de juiste grootte heeft voor uw DNA-monster.

Giet de gesmolten agarose in de gelvorm en laat deze uitharden bij kamertemperatuur.

Nadat de agarose is uitgehard, verwijdert u de kam. Als de gel niet onmiddellijk wordt gebruikt, wikkel deze dan in plasticfolie en bewaar deze bij 4ºC tot gebruik.

Als de gel onmiddellijk wordt gebruikt, plaatst u deze in de gelbak.

Voeg om met deze procedure te beginnen gel-laadkleurstof toe aan de te scheiden DNA-monsters. Laadkleurstof wordt doorgaans bereid in een 6X-concentratie. De laadkleurstof helpt bij het visualiseren en laden van monsters in de wells en helpt bepalen hoe ver de monsters tijdens de run zijn gemigreerd.

Stel de voeding in op het gewenste voltage.

Voeg nu voldoende runbuffer toe aan de gelbak om het oppervlak van de gel te bedekken. Zorg ervoor dat dezelfde runbuffer wordt gebruikt als die waarmee de gel is bereid.

Sluit de leidingen van de gelbak aan op de voeding en schakel deze in. Denk eraan dat DNA negatief geladen is en naar de anode zal bewegen, die positief is en doorgaans rood van kleur. Zorg ervoor dat de zwarte leiding, of kathode, niet aan de onderkant van de gelbak wordt aangesloten. Om dit niet te vergeten, kunt u onthouden dat zwarte katten ongeluk brengen, of negatief zijn, en de zwarte KAThode daarom negatief is. Laat uw gel lopen naar rood, oftewel de anode. Om te verifiëren of zowel de gelbak als de voeding werken: het verschijnen van bellen bij de elektroden geeft aan dat er stroom loopt.

Verwijder het deksel van de gelbak. Laad de DNA-monsters langzaam en voorzichtig in de gel. Opnieuw zorgt de laadkleurstof in het monster ervoor dat het monster in de gel zakt en helpt dit bij het volgen van de afstand die het monster heeft afgelegd. Een DNA-sizemarker, of ladder, moet altijd samen met de experimentele monsters worden geladen.

Plaats het deksel terug. Controleer dubbel of de elektroden in de juiste aansluitingen van de voeding zijn geplugd.

Schakel de stroom in. Laat de gel lopen totdat de kleurstof over een passende afstand is gemigreerd.

Wanneer de elektroforese voltooid is, schakelt u de voeding uit en verwijdert u het deksel van de gelbox.

Haal de gel uit de gelbox en laat het overtollige buffer op het oppervlak van de gel weglopen. Plaats de geltray op papieren handdoeken om de resterende running buffer te absorberen.

Om de DNA-fragmenten te visualiseren, haalt u de gel uit de geltray en stelt u de gel bloot aan ultraviolet licht.

De DNA-fragmenten moeten zichtbaar zijn als oranje fluorescerende banden. Maak een foto van de gel.

Aan het einde van het experiment dient u de gel en de running buffer op de juiste wijze te verwijderen volgens de institutionele regelgeving. Denk er opnieuw aan om de gel en running buffers altijd met handschoenen te hanteren om blootstelling aan ethidiumbromide te voorkomen.

Nu u heeft gezien hoe u DNA-gelelektroforese uitvoert, bekijken we enkele downstream-toepassingen en variaties van deze zeer nuttige methode.

Hier ziet u het resultaat van een agarosegelelektroforese na het scheiden van PCR-producten. De in de gel geladen DNA-fragmenten zijn zichtbaar als duidelijk gedefinieerde banden. De DNA-standaard of ladder moet tot een zodanige mate gescheiden zijn dat de grootte van de monsterbanden nuttig kan worden bepaald. In dit voorbeeld worden DNA-fragmenten van 765 base pairs, 880 base pairs en 1022 base pairs gescheiden op een 1,5% agarosegel met een 2-log DNA-ladder.

Naast het bevestigen van de aanwezigheid van een DNA-fragment van belang, kan DNA-gelelektroforese worden gecombineerd met gelzuiveringsprocedures. Meestal wordt een scheermesje gebruikt om het gewenste DNA-fragment uit te snijden, zodat dit kan worden verzameld en het DNA-monster daarin kan worden teruggewonnen.

Agarosegelelektroforese kan ook worden gecombineerd met transfer-blotting, waarbij DNA of RNA wordt overgebracht naar een cellulosemembraan, waar radioactieve probes kunnen worden gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties in uw elektroforetisch gescheiden monster te identificeren.

Standaard DNA-gelelektroforese is niet ideaal voor de scheiding van DNA met een hoog molecuulgewicht, groter dan 15-20 kb, zoals genomisch DNA. Om grote DNA-monsters te scheiden, wordt pulse-field gelelektroforese gebruikt, waarbij de gel wordt blootgesteld aan een veranderend, of pulserend, elektrisch veld in verschillende richtingen. Deze techniek vereist een gespecialiseerd apparaat voor het runnen van gels, met paren elektroden die in verschillende oriëntaties rond de gel zijn geplaatst. Dit kan worden gebruikt om verschillen in genoomgrootte tussen populaties organismen te detecteren, zoals de samengevoegde DNA-monsters van verschillende microbiële gemeenschappen die u hier ziet, afkomstig uit verschillende meeromgevingen.

U heeft zojuist een inleiding in DNA-gelelektroforese gezien. We hebben het concept achter de methode toegelicht, hoe u de agarosegel bereidt, hoe u uw monsters aanbrengt, hoe u de gel laat lopen, hoe u deze analyseert en we hebben enkele veelvoorkomende toepassingen van agarosegelelektroforese besproken. Bedankt voor het kijken en veel succes met het runnen van uw gel.