Eiwitscheiding met SDS-PAGE

SDS-PAGE is een techniek die door veel onderzoekers wordt gebruikt om eiwitmengsels op basis van grootte te scheiden. De succesvolle uitvoering van deze techniek is een essentiële eerste stap voor veel methoden van eiwitanalyse, zoals immunoblotting. Op zichzelf is het een nuttig instrument voor het bepalen van de grootte en zuiverheid van eiwitten.

Om de SDS-PAGE-techniek te begrijpen, moet u eerst de belangrijkste componenten ervan begrijpen. SDS-PAGE staat voor Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis. Sodium-dodecylsulfaat, het eerste deel hiervan, of "SDS", is een anionisch detergent. Dit betekent dat het is opgebouwd uit een hydrofiele groep met een netto negatieve lading en een lange hydrofobe keten met een neutrale lading.

De hydrofobe keten omhult eiwitten in verhouding tot hun massa, tegen een snelheid van 1,4 gram SDS per gram eiwit. Dit geeft de eiwitten de drijvende kracht die nodig is voor scheiding op basis van grootte in een elektrisch veld.

Polyacrylamidegelelektroforese maakt gebruik van een hydrogel gemaakt van polyacrylamide. Polyacrylamide is een polymeer dat een zeer regelmatige matrix vormt waar doorheen eiwitten kunnen bewegen. Hoe geconcentreerder de gel is, hoe langzamer de eiwitten erdoorheen zullen bewegen wanneer ze worden blootgesteld aan een elektrisch veld. Het proces waarbij een ruimtelijk uniform elektrisch veld wordt gebruikt om de beweging van een object te beïnvloeden, staat bekend als elektroforese.

SDS-PAGE wordt uitgevoerd op eiwitten die zijn geïsoleerd uit veel verschillende bronnen, waaronder cellen in kweek, weefsels, bloed, urine en gist.

Eiwitten uit deze diverse bronnen moeten eerst worden gescheiden van andere cellulaire componenten met behulp van technieken zoals homogenisatie en centrifugatie, vaak gevolgd door het gebruik van lysisbuffers.

Zodra het eiwit is geïsoleerd, wordt de concentratie ervan vaak gemeten om een gelijke belading van de monsters te garanderen, door de hoeveelheid eiwit in het monster te vergelijken met albumine-standaarden in een Bicinchoninezuur-, of BCA, colorimetrische assay.

Een belangrijke stap om te onthouden is de toevoeging van de laadbuffer. De laadbuffer heeft 3 hoofdfuncties. Ten eerste denatureert het, dankzij SDS en aanvullende reducerende middelen, de eiwitten, wat in feite betekent dat complexe eiwitstructuren worden omgezet in een lineaire keten van aminozuren. Ten tweede bevat het glycerine, wat ervoor zorgt dat het monster niet weg drijft wanneer het in de wells van de gel wordt geladen. En ten slotte bevatten de meeste commerciële laadbuffers een kleurstof, zoals broomfenolblauw, waarmee de voortgang van de elektroforese-stap kan worden gevolgd.

Na toevoeging van de laadbuffer moeten de monsters worden gemengd en vervolgens 5 minuten worden gekookt. Dit zorgt ervoor dat de sterke disulfidebruggen in de eiwitten kunnen worden verbroken met behulp van een reducerend middel zoals beta-mercaptoethanol. Zodra alle disulfidebruggen zijn verbroken, kan SDS de eiwitten gelijkmatiger omhullen.

Vervolgens worden de monsters kort gecentrifugeerd en zijn ze klaar om in het gelsysteem voor elektroforese te worden geladen.

Voordat de monsters kunnen worden geladen, moet het gelsysteem eerst worden geassembleerd. Dit begint met de aanschaf of vervaardiging van een polyacrylamidegel. Kant-en-klare gels worden steeds populairder omdat acrylamide neurotoxisch is en hersenschade kan veroorzaken. De gelcassette bevat putjes die worden gebruikt om de monsters te laden.

Zodra de gels op hun plaats zijn bevestigd, worden de binnenste en buitenste kamers gevuld met een buffer die dezelfde ionenconcentratie bevat als die gebruikt is voor het maken van de gels. Dit creëert een elektrisch circuit dat naadloos loopt van de kathode, door de gel en naar de anode.

Vervolgens worden er gewoonlijk moleculaire gewichtsmarkers (ladders) in de gel geladen, gevolgd door de monsters. Terwijl de gel loopt, zal de marker zich verspreiden en zichtbare proteïnebanden van bekende grootten vormen. In de laatste stappen kunnen deze banden worden gebruikt om de grootte van elk eiwit te berekenen.

Zodra alle monsters zijn geladen, worden de positieve en negatieve polen van de gelbox aangesloten op een stroombron die in staat is om gedurende een lange periode een constant voltage te handhaven. Gels worden doorgaans gestart bij ongeveer 60V totdat het gehele monster het gelgebied heeft bereikt dat de "stacking gel" wordt genoemd. Daarna wordt het voltage verhoogd naar ongeveer 200V gedurende 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte en concentratie van de gel en de grootte van het betreffende eiwit.

Wanneer de elektroforese is voltooid, wordt de cassette verwijderd en geopend om de gel bloot te leggen. De gel kan vervolgens worden gekleurd met een typische eiwitkleuring, zoals coomassieblauw of zilverkleuring, om de eiwitbanden in de gel te visualiseren. Coomassie-kleuring kan banden detecteren met slechts 50 nanogram eiwit, terwijl zilverkleuring banden kan detecteren met slechts 1 nanogram eiwit.

Bij tweedimensionale gelelektroforese worden monsters op gels gescheiden op basis van twee afzonderlijke eigenschappen, één dimensie per keer. Eerst worden de monsters geladen en gerangschikt volgens hun isoelektrisch punt op gelokaliseerde pH-gradiëntstrips. De eiwitten in de strip worden vervolgens gedenatureerd en bovenop een typische polyacrylamidegel geplaatst, waar ze op hun plaats worden vastgezet met een verse geloplossing. Vervolgens wordt de scheiding in de tweede dimensie uitgevoerd via SDS-PAGE.

Hoewel isoelektrische focussering niet de enige optie is voor 2-D gelelektroforese, is het wel de meest gebruikte methode. Tweedimensionale gelelektroforese is een onschatbaar hulpmiddel dat inzicht biedt in eiwitcomplexen en de organisatie van subcellulaire organellen.

Na het draaien van de gel is een zeer gebruikelijke volgende stap het overbrengen van de eiwitten van de gel naar een membraan van PVDF of nylon voor analyse. Vervolgens kunnen specifieke antilichamen worden gebruikt om het membraan te sonderen en te zoeken naar de eiwitten van belang. Hier worden typische immunoblot-resultaten getoond waarbij de onderzoeker drie verschillende signaalversterkingstechnieken heeft gebruikt om te bepalen welke de aanwezigheid van het Pit-1 eiwit over een reeks seriële verdunningen het beste aantoont.

U heeft zojuist de video van JoVE bekeken over eiwitscheiding met behulp van SDS-PAGE. U begrijpt nu de stappen die nodig zijn om een eiwit op basis van grootte te scheiden met deze krachtige techniek. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!