Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes
15 augustus 2013
We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de ruimtelijke organisatie van specifieke genomische loci in enkele cellen op een robuuste manier te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst fluorescent gelabelde sondes te genereren om uiteindelijk de genoomregio van belang te binden en te markeren. De volgende stappen zijn het hechten, fixeren en doorlaatbaar maken van de cellen van belang op een dia om toegang tot de sondes mogelijk te maken.
Vervolgens wordt een gelijktijdige hittedenaturering van sonde en cellulair DNA gevolgd door overnacht hybridisatie van de sonde met wasstappen om niet-specifiek gebonden sonde te verwijderen en tegenover te staan met dpi. Om de kern van de cel te visualiseren, zullen de resultaten verkregen met fluorescentiemicroscopie uiteindelijk de nucleaire positie onthullen die wordt bezet door specifieke genomische regio's. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van nucleaire organisatie, zoals het bepalen van functionele interacties tussen genen.
Het belangrijkste voordeel van dit specifieke DNA FISH-protocol is dat het snel, robuust en veelzijdig is. Hoewel we deze methode demonstreren met E Es-cellen, kan deze ook worden toegepast op tal van andere celtypen. Direct gelabelde sondes gemaakt van backs van 100 tot 250. Kilobases produceren consequent heldere signalen als kleinere sondes vereist zijn.
Gebruik 40 tot 50 kilobase smid, of zelfs plasmiden die vijf tot tien kilobase-inserts bevatten. Identificeer de back of smid-klonen die overeenkomen met specifieke genen met behulp van de ensemble- of UCSC-genoombrowsers. Om hoogwaardig back-DNA voor te bereiden, gebruik herhaalde precipitatie of een commercieel verkrijgbaar kit, de netheid van de voorbereiding is evenredig aan het volume van de sonde dat nodig is.
Voer de labelbewerking uit in twee stappen. Eerst gebruikt u NIC-translatie om amino-alleel, DUTP te introduceren. Ten tweede gebruikt u chemische koppeling om een AM-gemiddelde reactieve kleurstof te bevestigen.
Het is de moeite waard om tijd te investeren in het maken van heldere sondes, aangezien deze essentieel zijn voor sterke vissignalen. Deze procedure kan parallel worden uitgevoerd aan de behandeling van de cellen en hoeft niet aan het begin van de dag te worden gedaan. Eerst mengde 10 tot 20 nanogram direct gelabelde sonde met zes microliters CO 1D NA voor zes microgram.
Voeg vervolgens één microliter enkelstrengs DNA uit zalmtestikels toe voor 9,7 microgram. Pas het volume van het mengsel aan tot 100 microliter met water. Voeg vervolgens 10 microliters drie molaire natriumacetaat en 275 microliters ethanol toe en meng door te vortexen.
Laat het mengsel minimaal een uur precipitatie bij min 20 graden Celsius. Draai vervolgens de precipitatie in een micro fuge bij maximale snelheid gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens de pellet met 70% ethanol en draai hem weer neer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Droog vervolgens de pellet in de lucht. Daarna resus. Suspendeer het in vijf microliters gedeïoniseerd formulier.
Amid bij 37 graden Celsius terwijl je schudt bij 1000 RPM om het te beschermen tegen licht. Voeg na 30 minuten vijf microliters dextrinesulfaatmix toe en zet de incubatie voort met agitatie. Nog 10 minuten. De neiging van de cellen om zich aan de dia te hechten, varieert sterk per celtype.
Bepaal voor elk celtype de optimale bezinkingstijd en celdichtheid empirisch. Voor consistente resultaten moeten de cellen in een enkele celsuspensie zijn. Om muis-ES-cellen op een dia te hechten. Begin met het omcirkelen van het gebied op de dia waar de cellen zullen worden aangebracht.
Gebruik een hydrofobe pen, een suspensie van 20 tot 50.000 cellen per 80 tot 100 microliter in normaal kweekmedium, voeg de celsuspensie toe in de cirkel en laat de cellen ongeveer drie uur aanhechten in een bevochtigde incubator. Na het aanbrengen op de dia, fixeer de cellen door de dia voorzichtig 10 minuten in 4% PFA te onderdompelen. De dia moet plat liggen in een bakje zoals een tipbox.
Gebruik kamertemperatuurreagentia in coplan-potten. Kwets eerst de cellen gedurende 10 minuten met trischloride. Bewerk vervolgens de cellen met een sapin en triton X 100-mengsel gedurende 10 minuten.
Was de cellen vervolgens twee keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Na de wasbeurten, incubeer de cellen gedurende ten minste 20 minuten in 20% glycerol. Op dit punt kunnen de dia's in 50% glycerol bij min 20 graden Celsius gedurende enkele weken worden bewaard.
Opslag gedurende een dag of meer zou de signaalsterkte moeten verhogen. Zorg ervoor dat de cellen worden geëquilibreerd tot kamertemperatuur in 20% glycerol in PBS voordat u verdergaat. Bevries en ontdooi de dia nu drie keer met vloeibaar stikstof.
Eén dia per keer wanneer het knapperende geluid stopt. Verwijder na een paar seconden de dia naar een papieren handdoek om te ontdooien. Wacht tot het ondoorzichtige bevroren glycerol verdwijnt voordat u de dia weer invriest. Tot 15 dia's kunnen comfortabel worden gedaan in rotatie voor drie vries-ontdooicycli. Was nu de dia's twee keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.
Behandel vervolgens de dia's gedurende 30 minuten met 0,1 molair zoutzuur. Volg de zoutzuurbehandeling met nog eens vijf minuten wassen in PBS. Bewerk de cellen nu opnieuw met een sterkere sapin en Triton X 100-mix gedurende 30 minuten om de oppervlakteactieve stoffen van de dia's te verwijderen. Gebruik twee vijf minuten PBS-washbeurten.
De dia's zijn nu klaar om te worden geëquilibreerd in 50% formamidaat in XSSC. Dit zou minstens 10 minuten moeten duren terwijl u geëquilibreerd bent. Haal de sonde op en neer en breng vervolgens 10 microliters per celpunt aan op een dekglas van de juiste grootte. Verwijder een dia uit de formamidaat en droog eventueel overtollig vocht rond
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuust protocol voor het analyseren van de nucleaire architectuur met behulp van 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescente probes. De methode maakt het mogelijk om de ruimtelijke organisatie van genomische loci in individuele cellen te onderzoeken.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genomics
Achtergrond
- Inzicht in de nucleaire organisatie is essentieel voor het verduidelijken van geninteracties.
- 3D DNA FISH is een krachtige techniek voor het visualiseren van genomische regio's.
- Het protocol is veelzijdig en kan worden toegepast op diverse celtypen.
- Direct gelabelde probes versterken de signaalintensiteit voor een betere visualisatie.
Doel van de studie
- Om een snelle en betrouwbare methode te ontwikkelen voor het analyseren van de nucleaire architectuur.
- Om de studie van functionele interacties tussen genen te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat toepasbaar is op verschillende celtypen.
Gebruikte methoden
- Genereren van fluorescentie-gelabelde probes voor specifieke genomische regio's.
- Fixatie en permeabilisatie van cellen om toegang voor de probes mogelijk te maken.
- Hittedenaturatie en overnight hybridisatie van probes.
- Visualisatie met fluorescentiemicroscopie om de nucleaire positionering te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol brengt succesvol specifieke genomische regio's in individuele cellen in kaart.
- De robuustheid en veelzijdigheid van de methode worden aangetoond in verschillende celtypen.
- Heldere signalen van direct gelabelde probes verbeteren de detectiecapaciteiten.
- Er worden cruciale inzichten geboden in de nucleaire organisatie en geninteracties.
Conclusies
- Dit DNA-FISH-protocol is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die de nucleaire architectuur bestuderen.
- Het biedt een betrouwbare aanpak om de ruimtelijke genomische organisatie te onderzoeken.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse biologische onderzoeksvelden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Robuuste 3D DNA FISH maakt nauwkeurige ruimtelijke mapping van genomische loci in enkelvoudige cellen mogelijk, wat targetvalidatie ondersteunt door directe visualisatie van de chromosomale architectuur. Deze methode vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door functionele geninteracties en patronen van nucleaire organisatie te onthullen die relevant zijn voor ziektemanismen. De veelzijdigheid over verschillende celtypen en de compatibiliteit met high-throughput imaging maken het tot een schaalbare tool voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen in preklinisch onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door ruimtelijke relaties tussen genen van belang te visualiseren.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare gegevens over de nucleaire positionering om betrokkenheid van signaalpaden en functionele target-engagement te verduidelijken.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door loci te identificeren met ziekte-relevante ruimtelijke configuraties die correleren met genregulatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief meetbare inter-allelische en inter-locus afstanden voor een objectieve beoordeling van de genomische organisatie.
- Operationele waarde: Levert robuuste, heldere signalen vanuit direct gelabelde probes, wat betrouwbare geautomatiseerde beeldvorming en verminderde achtergrondruis mogelijk maakt.
- Schaalbaarheidswaarde: Compatibel met high-throughput workflows, waardoor screening van meerdere genomische regio's in diverse celmodellen mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de natuurlijke nucleaire architectuur in ziekte-relevante systemen te behouden.
- Mechanische risicoreductie: Onthult ruimtelijke veranderingen in genomische loci die kunnen wijzen op pathogene mechanismen, wat bijdraagt aan de selectie van targets.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt het mogelijk om te beoordelen of kandidaat-therapeutica een aberrante nucleaire organisatie normaliseren, ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows na targetidentificatie, waardoor ruimtelijke genomische gegevens beschikbaar komen vóór lead-optimalisatie en preklinische efficiëntietesten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door aan te tonen of genloci co-lokaliseren in de nucleus, wat wijst op potentiële regulatoire interacties.
- Screening: Maakt assay-ready, gestandaardiseerde nucleaire beeldvorming mogelijk met kwantitatieve afstandmetrieken voor het vergelijken van verbindingen of genetische perturbaties.
- Analytics: Genereert meetbare resultaten, zoals inter-allelische afstanden als een fractie van de nucleaire straal, waardoor statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk zijn.
- Translational Research: Sluit aan op preklinisch werk door de nucleaire integriteit in primaire cel- en stamcelmodellen te behouden, wat ruimtelijke beoordelingen in lijn met biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare beeldvormingscapaciteit voor studies naar de nucleaire architectuur over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct visueel bewijs te leveren van genomische ruimtelijke relaties in enkelvoudige cellen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor sonde-labeling, denaturatie en hybridisatie, waardoor variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door fenotypes van nucleaire organisatie te koppelen aan target-validiteit, wat biologische uitval in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van ruimtelijke genoomorganisatiegegevens uit relevante ziektemodellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van moleculaire probes, nick-translatie en fluorescentiemicroscopie voor nauwkeurige signaaldetectie.
- Afhankelijk van toegang tot hybridisatieovens, fluorescentiemicroscopen en geautomatiseerde imagingsystemen voor high-throughput toepassingen.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams van de kwaliteitscontrole van probes en nucleaire segmentatiealgoritmen voor een consistente interpretatie van de gegevens.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie vereisen van de permeabilisatie- en denaturatiecondities op basis van celtype en nucleaire dichtheid.
- Praktische beperkingen omvatten restricties in de probe-grootte voor het genereren van een sterk signaal en de noodzaak voor zorgvuldige behandeling om de nucleaire morfologie tijdens vries-dooi-cycli te behouden.
