Bacteriële transformatie: de heat-shockmethode

Bacteriële transformatie is een veelgebruikte methode waarbij vreemd DNA in een bacterie wordt geïntroduceerd, die het DNA vervolgens kan amplificeren of kloneren. Cellen die in staat zijn om dit DNA gemakkelijk op te nemen, worden competente cellen genoemd. Hoewel transformatie op natuurlijke wijze voorkomt bij veel soorten bacteriën, hebben wetenschappers manieren gevonden om de competentie van een bacteriële cel kunstmatig te induceren en te verhogen. In deze video bespreken we een van deze methoden: heat shock transformatie.

Voordat we de hitte-shocktechniek bespreken, gaan we eerst in op het type DNA dat het meest wordt gebruikt bij bacteriële transformatie: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat zijn omvang kan verkleinen door supercoiling, zodat het gemakkelijk door poriën in een celmembraan kan passeren.

Een plasmide bevat een paar belangrijke regio's die vermeld moeten worden. Commercieel verkrijgbare plasmiden bevatten een multiple cloning site of MCS. Deze regio bevat specifieke sequenties die worden herkend door restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen, die DNA splitsen. DNA-fragmenten waarin de onderzoeker geïnteresseerd is, kunnen in de multiple cloning site worden ingevoegd wanneer het plasmide en het DNA-fragment met dezelfde endonucleasen worden geknipt.

Plasmiden bevatten ook een Origin of Replication, of ORI, die informatie aan de cel verschaft over waar de replicatie van het plasmide moet beginnen.

Naast de origin of replication en de multiple cloning site bevatten de meeste plasmiden een antibioticaresistentiegen. Dit gen verleent antibioticaresistentie aan alle cellen die het plasmide bevatten, waardoor deze cellen kunnen overleven in media die antibiotica bevatten.

Nu we de plasmiden hebben besproken, gaan we in op de cellen waarin ze zullen worden geïntroduceerd: de competente cellen. Het meest gebruikte type bacterie in moleculair-biologisch onderzoek en transformatie is E. coli, die toevallig ook in uw onderste darmstelsel voorkomt. Cellen worden doorgaans competent gemaakt door blootstelling aan een calciumrijke omgeving.

De positieve ladingen van de calciumionen neutraliseren de negatieve ladingen van zowel het plasmide als de bacteriële celwand, waardoor de elektrostatische afstoting verdwijnt en de celwand wordt verzwakt.

Door de cellen bloot te stellen aan een plotselinge temperatuurstijging, of hitte-shock, ontstaat er een drukverschil tussen de buitenkant en de binnenkant van de cel, wat de vorming van poriën induceert waardoor supercoiled plasmide-DNA kan binnendringen. Nadat de cellen terugkeren naar een normalere temperatuur, zal de celwand zichzelf herstellen.

Zodra de cellen het plasmide hebben opgenomen, zullen ze in staat zijn om te groeien op agarplaten die zijn voorzien van antibiotica.

Reinig vóór aanvang van de hitte-shocktransformatie het werkgebied en zorg ervoor dat alle apparatuur is gesteriliseerd.

Zorg dat er voldoende medium en agar zijn voorbereid, die de voeding leveren voor de bacteriën die competent worden gemaakt. Zorg er daarnaast voor dat alle oplossingen via autoclaveren worden gesteriliseerd. Laat vloeibare media afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik en laat de agar afkoelen tot 50-55˚C, de temperatuur waarbij antibiotica kunnen worden toegevoegd en platen kunnen worden gegoten. Laat de platen afkoelen tot kamertemperatuur om te stollen.

Bij het werken met bacteriën moet men altijd aseptische technieken toepassen om de steriliteit te behouden. Een aseptische techniek houdt doorgaans het gebruik van een Bunsenbrander in om instrumenten en reagentia te steriliseren en een convectiestroom te creëren, waardoor luchtgedragen verontreinigingen uit de werkruimte worden gehouden.

Verwarm direct vóór de hitte-shockreactie uw media voor tot kamertemperatuur en de LB-agarplaten met antibiotica tot 37°C. Zorg er ook voor dat uw waterbad op 42°C staat.

Ontdooi vervolgens chemisch competente cellen op ijs.

Voeg 1-5uL van 1ng/μL koud plasmide toe aan de bacteriële cellen, meng voorzichtig en plaats het mengsel van cellen en plasmide gedurende 30 minuten terug op ijs.

Wanneer de tijd is verstreken, wordt het mengsel van cellen en plasmide blootgesteld aan een hitte-shock door het gedurende 30 seconden in een waterbad bij 42˚C te plaatsen.

Plaats de buis onmiddellijk na het uitnemen uit het waterbad op ijs en voeg 450μL medium toe. Plaats deze in een schudincubator bij 37°C gedurende 1 uur bij meer dan 225 rpm, zodat de cellen kunnen herstellen.

Voeg met behulp van de juiste aseptische techniek 20-200uL bacteriën toe aan een LB-agarplaat en verspreid het medium met een bacteriële spreider. Incubeer de platen overnacht bij 37˚C ondersteboven om te voorkomen dat de bacteriën worden blootgesteld aan condensatie.

De volgende dag vormen de bacteriën die het plasmide hebben opgenomen kolonies.

Tel vervolgens de kolonies om de transformatie-efficiëntie te berekenen, wat het aantal succesvolle transformanten is gedeeld door de totale hoeveelheid geplaatst DNA.

Nu kunnen kolonies worden geselecteerd voor verdere experimenten.

Voordat ze competent worden gemaakt, worden de bacteriën die voor de transformatie worden gebruikt in de vriezer bewaard. Ze moeten op ijs ontdooien, worden uitgeplaat op een agarplaat – zonder antibiotica – en gedurende de nacht worden gekweekt bij 37˚C.

Selecteer met aseptische techniek een bacteriële kolonie van de agarplaat en kweek deze gedurende de nacht bij 37˚C in een grote cultuur van 500 ml in een schudincubator – een instrument dat sedimentatie van de bacteriën voorkomt en een gelijkmatige verspreiding van voedingsstoffen in het medium waarborgt.

Terwijl de cellen groeien, worden oplossingen van 0,1 molair calciumchloride en 0,1 molair calciumchloride plus 15% glycerol bereid, geautoclaveerd en afgekoeld.

Absorbantiemetingen worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën zich in de mid-log fase van hun groei bevinden, wat betekent dat ze gemakkelijk DNA zullen opnemen. Zodra de cellen deze fase hebben bereikt, worden ze op ijs geplaatst en daar gedurende de gehele procedure gehouden.

Vervolgens worden de bacteriële cellen verdeeld over twee grote centrifugebuizen en gecentrifugeerd bij 4°C. Schenk het supernatant af en resuspendeer in ongeveer 100 ml koud 0,1 molair calciumchloride. Incubeer de cellen daarna 30 minuten op ijs. Deze stap wordt nog minstens één keer herhaald. Cycli van centrifugeren en resuspenderen van cellen worden vaak aangeduid als het wassen van de cellen.

Na de laatste wasbeurt worden de cellen geresuspendeerd in 50 mL koude 0,1 molair calciumchloride plus 15% glyceroloplossing. Deze cellen zijn nu chemisch competent.

Verdeel 50μL bacteriën over meerdere microcentrifugebuisjes en bewaar deze bij -80˚C tot ze klaar zijn voor de hitte-shock.

Er bestaan veel toepassingen en variaties van bacteriële transformatie.

Naast hitte-shock is elektroporatie een andere veelgebruikte techniek voor transformatie. Zoals de naam al aangeeft, maakt elektroporatie gebruik van elektriciteit om poriën in het bacteriële celmembraan te maken waar DNA doorheen kan passeren.

Wat betreft het screenen op getransformeerde bacteriën, bevatten plasmiden vaak een gen dat het enzym bèta-galactosidase codeert om het screenen te vergemakkelijken. Wanneer het substraat voor dit enzym in agarplaten wordt opgenomen, produceren bacteriën die zijn getransformeerd met plasmiden die een insert bevatten witte kolonies, terwijl bacteriën zonder insert blauwe kolonies produceren. Deze methode wordt blauw-wit screening genoemd.

In de meeste transformatie-experimenten is het doel om snel delende bacteriën te gebruiken om grote hoeveelheden van het plasmide, inclusief het doelgen, te produceren. Na de bacteriële transformatie is de volgende stap het kweken van grote hoeveelheden bacteriën in een vloeibaar medium dat antibiotica bevat en het uitvoeren van plasmidezuivering, wat, zoals de naam suggereert, het zuiveren van de plasmiden uit de bacteriën inhoudt. Hiervoor zijn veel commerciële kits beschikbaar.

Soms is het doel van transformatie dat bacteriën grote hoeveelheden proteïne genereren die door het plasmide worden gecodeerd. Hier ziet u hoe bacteriële cellen worden gehomogeniseerd en gelyseerd voordat een techniek genaamd affiniteitszuivering kan worden uitgevoerd om het doeleiwit te isoleren. Na het zuiveren van grote hoeveelheden van het eiwit kan dit vervolgens worden gekristalliseerd, waarna de structuur van het specifieke eiwit van belang kan worden geïdentificeerd.

U heeft zojuist de JoVE Introductie tot Heat Shock Transformaties bekeken. In deze video hebben we besproken: wat heat shock transformatie is en hoe het werkt, het achterliggende principe en hoe bacteriën succesvol getransformeerd kunnen worden. Bedankt voor het kijken!