Name: Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerd microfluidisch platform voor celcultuur en stimulatie met digitale microfluidica. Deze methode maakt precieze controle over kleine celpopulaties en herstel van lysaten voor moleculaire analyses mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Ronald F. Renzi en Michael S. Bartsch voor hun bijdrage aan het ontwerp en de ontwikkeling van DMF apparaten en de DMF-hub. Dit onderzoek werd volledig ondersteund door het Laboratorium Geregisseerd Research en Development programma bij Sandia National Laboratories. Sandia is een multi-programma laboratorium beheerd en geëxploiteerd door Sandia Corporation, een volledige dochteronderneming van Lockheed Martin Corporation, voor de US Department of Energy&#39;s National Nuclear Security Administration onder contract DE-AC04-94AL85000.

Deze algemene protocol is ontworpen om de toepassing van het platform ondersteunen vele verschillende studies, specifieke aspecten van de representatief onderzoek in dit rapport beschreven worden afgescheiden haakjes Figuur 2 illustreert een representatief onderzoek uitgevoerd met het protocol.. Merk op dat in het protocol, alle &quot;instrueren&quot; opdrachten worden geautomatiseerd door het gebruik van vooraf bepaalde scripts. Merk ook op dat stap 2 in parallel met stap 1 (bijv. bij stap 1.7 en 1.8) kan worden uitgevoerd, en dat stap 2.1 vaak overbrugd (omdat patroon / DMF beklede inrichting platen worden gewassen en opnieuw gebruikt, zie stap 5.2) . 1. Assembleren en Bevolk de Cel perfusiekamers <ol><li> Smeer de binnenzijde van gesteriliseerd (autoclaaf) microcapillairen (fused-silica, 679 urn od, 534 urn id, 15 cm lang) met fibronectine, door instrueren de spuitpomp een steriele fibronectine-oplossing (30 pl van 50 ug / ml) trekken in elkmicrocapillaire, incuberen (37 ° C gedurende 2 uur), instrueren de spuitpomp de oplossing opnieuw, en laten de microcapillairen droging (kamertemperatuur (KT) gedurende 6 uur). </li><li> Sluit elke fibronectine gecoate microcapillaire (perfusie kamer) naar polycarbonaat buis (500 pm od, 100 um id) en de slang aan op de multi-poort spuitpomp, met CapTite hulpstukken (6 perfusiekamers, 8-port injectiepomp). </li><li> Met behulp van tape, beveiligen het lichaam van elke perfusie kamer een ingesteld op gewenste temperatuur warmte-blok (37 ° C). </li><li> Dompel de open einden van de perfusiekamers in een reservoir (microcentifuge buis of microtiter putje) bevattende cellen (P388D.1 murine macrofagen) gesuspendeerd in vers kweekmedium (RPMI-1640, 10% FBS, 500 eenheden / ml penicilline, 500 ug / ml streptomycine) en gewenste concentratie (10 6 cellen / ml). </li><li> Instrueer de injectiepomp aan cellen (10 pl, 10 4 cellen) te trekken in elk perfusiekamer gevolgd door genoeg air aan de vloeibare plug (~ 4,5 cm) te verplaatsen naar het deel bevestigd aan de hitte blok. </li><li> Laat de cellen hechten aan de met fibronectine beklede binnenzijde van de perfusiekamers (37 ° C gedurende 1-2 uur). Intussen dragen de open einden van de perfusiekamers uit de cellen reservoir in nieuw reservoir met vers groeimedium. </li><li> Na de hechting periode, instrueren de spuit pomp om de vloeistof pluggen (geconditioneerde media en losse cellen) te sturen naar afval, trekken vers medium (10 pl), en volg met genoeg lucht om de nieuwe vloeistof stekkers (vers medium) te positioneren over de aangehouden cellen. </li><li> Blijven uitvoeren medium beurzen (dwz herhaal stap 1.7) met regelmatige tussenpozen (elke 2 uur) totdat de celpopulaties voldoende evenwicht gebracht en uitgebreid (16-24 uur van micro-schaal cultuur gegenereerd populaties van ~ 1000 cellen / kamer). </li></ol> 2. Fabriceren de DMF Device en Monteer de Hub Architecture <ol><li&gt; 14,29 Zoals eerder beschreven patroon de bodemplaat van het toestel met DMF zesenveertig indium tin oxide (ITO) elektroden (bestuurders van druppel verstuiving) door fotolithografie en etsen, en breng 5 urn of Parylene-C en 50 nm van Teflon-AF. Vormen de bovenplaat van de DMF-apparaat door het bekleden van een unpatterned ITO glazen substraat met Teflon-AF, zoals hierboven. </li><li> Met metalen compressie frames, bevestig de DMF platen in een polymeer gegoten 14,30 uitsparingen die een 400 urn afstand tussen de platen te behouden, deze afstand in combinatie met de bediening grootte van de elektrode (2,5 mm2), de druppel volume (2,5 pl per elektrode). Merk op dat DMF samenstel kan worden bereikt door eenvoudige middelen 24. </li><li> Insert Teflon beklede overdracht microcapillairen (360 urn od, 100 urn id, 3,5-4,0 cm lang) in de ruimte tussen de platen DMF, positioneren elk uitstrekken naar de rand van het verwante bediening elektrode. </li><li> Naar de tegenovergestelde nld van elke overdracht microcapillaire aanbrengen van een CapTite fitting. </li><li> Schakel de elektrische aansluitingen aan de voedingsspanning aan de ITO elektroden. Elektrode activeringssequenties worden geautomatiseerd door het gebruik van een computer-gestuurde elektronische interface actief voorafbepaalde scripts. </li><li> Optioneel: Verplaats de geassembleerde DMF naaf op de translationele fase van een microscoop (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) voorzien van een charge-coupled device (CCD) camera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) te vergemakkelijken het volgen van druppels . 31 </li></ol> 3. Sluit de perfusiekamers aan de DMF Hub en Stimuleren van de celpopulaties <ol><li> Verwijder de open einden van de perfusiekamers uit het medium reservoir (zie stap 1.6) en plaats ze in de CapTite inrichting aangebracht op de uiteinden van de overdracht van de microcapillairen DMF naaf (zie Stap 2.4). </li><li> Instrueer de spuit pomp om de vloeistof pluggen (geconditioneerde media) in de perfusiekamers om afval te sturen. </li><li> Instruct de DMF-hub om stimulus te tekenen (E. coli BioParticles bij 100 ug / ml in vers medium met 0,1% Pluronic F127 w / v) van een on-board reservoir en leveren een druppel van de juiste grootte (10 pl) aan elke overdracht microcapillaire . De aan boord reservoirs bestaan ​​uit cilindervormige compartimenten (1.5 x 1.5 cm elk) en via slangen verbonden met de hub DMF. </li><li> Instrueer de injectiepomp te stellen de stimulus wordt aangesloten op de overdracht microcapillairen, en volg met genoeg lucht om de stekkers te positioneren over de celpopulaties in de perfusiekamers. </li><li> Incubeer de cellen met stimulus (37 ° C gedurende 1-4 uur). Optioneel: Exchange voor verse stimulus (dwz herhaal dan de stappen 3,2-3,4) op regelmatige tijdstippen. </li></ol> 4. Beëindigen Stimulatie en Recover cellysaten voor Analysis <ol><li> Optioneel: Als een post-stimulatie periode nodig is, wisselen de stimulus-bevattende vloeistof stekkers voor vers medium (dwz Herhaal stap 3,2-3.4, Vervangen vers medium voor stimulus), en blijven broeden en uit te wisselen als dat nodig is. </li><li> Exchange de vloeistof pluggen in de perfusiekamers voor wasbuffer (Prelude Direct Lysis Buffer Module B) (of herhaal stappen 3,2-3,4, vervangen wasbuffer voor stimulus) en incubeer indien nodig (5 min). </li><li> Exchange de vloeistof pluggen (wasbuffer) voor lysis oplossing (Prelude Direct Lysis Buffer Module A met 0,1% Pluronic F127 w / v) (dwz herhaal stappen 3,2-3,4, vervangen lysis oplossing stimulus) en incubeer indien nodig (5 min) . </li><li> Vraag de spuitpomp de vloeistof pluggen (cellysaten) naar de naaf DMF. </li><li> Demonteer de DMF-hub, verwijder de bovenplaat van de DMF-apparaat (met behulp van zorg niet aan de plaat zijwaarts kantelen, want dit kan resulteren in een druppeltje mengen), en het verzamelen van de lysaten met een Pipetman of spuit voor off-platform analyse (genexpressieprofilering via qPCR). </li></ol> 5. Schoon Platform Hardware voorHergebruik <ol><li> Dompel de overdracht microcapillairen en CapTite armaturen in 10% bleekwater (v / v in water) gedurende 10 min bij RT, goed spoelen met gedemineraliseerd water, en droog met behulp van stikstofgas. </li><li> Dompel het DMF inrichting platen in 10% bleekmiddel gedurende 10 min bij kamertemperatuur, spoelen met isopropanol gevolgd door gedeïoniseerd water en droog met stikstofgas gevolgd door bakken bij 160 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> De spuitpomp is polycarbonaat buizen, en DMF apparaat polymeer gegoten en compressie frame kunnen worden hergebruikt zonder reiniging. De perfusie kamer microcapillairen worden na elk experiment weggegooid. </li></ol>

<ol><li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+bioapplications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for bioapplications.</a> Small. 7, 12-48 (2011).</li>
<li>Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained microfluidic cell culture system.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Skafte-Pedersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained%2C+programmable+microfluidic+cell+culture+system+with+real-time+microscopy+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access.</a> Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+complete+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for complete mammalian cell culture.</a> Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).</li>
<li>Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Openly+Accessible+Microfluidic+Liquid+Handlers+for+Automated+High-Throughput+Nanoliter+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture.</a> Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).</li>
<li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li>
<li>Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+culture+of+droplet-confined+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Dynamic culture of droplet-confined cell arrays.</a> Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).</li>
<li>Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+perfusion+microfluidic+cell+culture+array+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).</li>
<li>King, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+real-time+gene+expression+living+cell+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array.</a> Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).</li>
<li>Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile%2C+fully+automated%2C+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system.</a> Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).</li>
<li>Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+-+Putting+electrowetting+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry - Putting electrowetting to work.</a> Science. 322, 539-540 (2008).</li>
<li>Gong, J., Kim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 898-906 (2008).</li>
<li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+field+effect+transistor-based+biosensors+with+a+digital+microfluidic+device+for+a+lab-on-a-chip+application%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application.</a> Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for cell-based assays.</a> Lab Chip. 8, 519-526 (2008).</li>
<li>Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability%3A+incorporation+of+non-natural+amino+acids%2C+pseudo-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide.</a> 16, 3185-3203 (2010).</li>
<li>Miller, E. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+approach+to+homogeneous+enzyme+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays.</a> Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).</li>
<li>Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%3A+a+versatile+tool+for+applications+in+chemistry%2C+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology.</a> 12, 2452-2463 (2012).</li>
<li>Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidic+Magnetic+Separation+for+Particle-Based+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays.</a> Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).</li>
<li>Sista, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+immunoassays+using+magnetic+beads+on+a+digital+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform.</a> Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochip+functionalization+using+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidics+for+surface+plasmon+resonance+imaging+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+digital+microfluidics+for+enhanced+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).</li>
<li>Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidic+method+for+protein+extraction+by+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Nelson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubated+protein+reduction+and+digestion+on+an+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidic+chip+for+MALDI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS.</a> Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).</li>
<li>Mousa, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-scale+estrogen+assays+in+breast+tissue%2C+blood%2C+and+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum.</a> Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+method+for+dried+blood+spot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic method for dried blood spot analysis.</a> Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).</li>
<li>Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidics+for+Automated+Proteomic+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing.</a> J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).</li>
<li>Thaitrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+Next+Generation+Sequencing+Library+through+an+Integrative+Digital+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Shin, Y. J., Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+vision+for+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Machine vision for digital microfluidics.</a> Review of Scientific Instruments. 81, (2010).</li>
<li>Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+minimally+disturbed+synchronous+cultures+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells.</a> BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).</li>
<li>Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+adhesion+of+hematopoietic+cells+to+culture+dish+induces+endomitosis+and+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy.</a> Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).</li>
<li>Raje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+nylon+membrane+substrate+for+convenient+and+versatile+high+resolution+microscopic+analysis+of+Escherichia+coli+%26+mammalian+cells+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture.</a> Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).</li>
<li>Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics+with+nonaqueous+solvents+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions.</a> Lab Chip. 6, 199-206 (2006).</li>
<li>Perroud, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+cell+sorting+of+Francisella+tularensis+infected+macrophages+using+optical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces.</a> Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Malone, J. H., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays%2C+deep+sequencing+and+the+true+measure+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically-unified+cell+culture%2C+sample+preparation%2C+imaging+and+flow+cytometry+for+measurement+of+cell+signaling+pathways+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution.</a> Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).</li>
<li>Srivastava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+platform+enabling+automated+phosphoprofiling+of+macrophage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response.</a> Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We hebben een eenvoudige en veelzijdige geautomatiseerd platform voor micro-schaal celcultuur en stimulatie experimenten ontwikkeld. Het platform stelt ons in staat om te werken met kleine volumes cultuur en celpopulaties (1 - 20 pl en 100 - 2000 cellen, per kamer); cultuur maten kan verder worden verminderd door gebruik te maken van microcapillairen van kleinere diameter. Werken bij deze schalen reduceert de routine studies en maakt mogelijk studies dat het gebruik van kostbare reagentia en / of cellen vereise...

De studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt waardevol inzicht in de fundamentele principes en moleculaire mechanismen die complexe biologische systemen en de volksgezondheid. De conventionele methoden voor cultuur, stimulatie, en het verzamelen van cellen voor analyse, die petrischaaltjes en microtiterplaten benutten, zijn ontworpen voor onderzoek van grote populaties van cellen (≥ 10 5) in milliliter-schaal cultuur volumes (≥ 0,1 ml). Er zijn echter veel gevallen waarin slechts beperkte hoeveelheden cellen beschikbaar zijn (primaire cellen) of kleine populaties van cellen gewenst (bijv. cel-cel variabiliteit te verminderen in de populatie) of vereiste reagentia moeilijk te verkrijgen zijn of onbetaalbaar (bijv. gezuiverd cel-uitgescheiden factoren). Dergelijke kwesties met succes kan worden aangepakt door schaalverkleining cultuur grootte, die het extra voordeel van het verminderen van het verbruik van alle heeftbenodigde reagentia in vitro analyse 1,2. Helaas, conventionele apparatuur en methoden niet ondersteunen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar 3-11 zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria. In dit rapport beschrijven we de montage en het gebruik van een eenvoudige en veelzijdige technologie platform voor geautomatiseerde cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 - 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform architectuur (figuur 1) is modulair opgebouwd: een set van fibronectine gecoate microcapillairen (&quot;cell perfusiekamers&quot; module) fungeert als de plaats voor vestiging, de handhaving en stimulering van micro-schaal culturen, en een digitale microfluidics (DMF ) 12,13 apparaat uitgerust met een &quot;transfer&quot; microcapillairen (&quot;centrale hub&quot; module) 14,15 routes cellenen reagentia en naar de perfusiekamers. DMF kan de gebruiker individueel meerdere druppels tegelijk te pakken en de manipulaties (dwz herconfigureren monster verwerking treinen) te wijzigen of opnieuw te bestellen zonder de hardware-apparaat. Haar enorme flexibiliteit is duidelijk in zijn recente opkomst als een belangrijke technologie in een brede waaier van toepassingen, met inbegrip van celkweek 16,17, enzymassays 18,19, immunoassays 20,21, DNA-analyse 22,23, eiwit verwerking, 24,25 en klinisch monster verwerking. 26,27 Onze centrale hub maakt gebruik van de flexibiliteit die inherent zijn aan DMF apparaten, en verder verbetert het door de toevoeging van microcapillaire interfaces, die gelegenheid voor het uitvoeren van een subset van de manipulaties (bijvoorbeeld celkweek) in gespecialiseerde perifere biedt modules en niet op het apparaat zelf DMF. Compartimentering van de verwerking treinen op deze manier vereenvoudigt ook het ontwerp van de plaTForm architectuur (niet nodig om een DMF apparaat dat kan uitvoeren van alle processtappen te bouwen) en faciliteert de ontwikkeling daarvan als nieuwe functies zijn nodig (gewoon nieuwe perifere modules als nodig te integreren). Vervoer van cellen en reagentia in de centrale naaf wordt door electrowetting krachten opgewekt door sequentiële activering van elektroden in het apparaat DMF 13,28, transport naar, van en binnen de perfusiekamers wordt aangedreven door drukveranderingen opgewekt door een zeer nauwkeurige spuit pomp. Al deze vloeiende bewegingen worden via een eenvoudige elektronische interface en geautomatiseerd door het gebruik van vooraf bepaalde scripts. Als representatief voorbeeld demonstreren we het gebruik van het platform voor de studie van transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën (Figuur 2). Het uitvoeren van deze experimenten op het platform konden wij werken met kleine aantallen cellen (~ 1000 per experimenteletal conditie), het minimaliseren van experiment-to-experiment variabiliteit, behouden reagentia, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, moet dit platform toepassing vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.

<table><tbody><tr><td>Prelude Direct Lysis Module</td><td>NuGEN</td><td>1400-24</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4% w/v)</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cell Stripper</td><td>Cellgro</td><td>25-056-C1</td><td></td></tr><tr><td>Ovation PicoSL WTA</td><td>NuGEN</td><td>3310-048</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo BioParticles</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>CCL4 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443111_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCL5 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm01302428_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00478374_m1</td><td></td></tr><tr><td>TNF TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443258_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm99999915_g1</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma Chemical</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinert FC-40</td><td>Sigma Chemical</td><td>51142-49-5</td><td></td></tr><tr><td>Parylene C dimer</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td></td></tr><tr><td>Polyimide tape</td><td>ULINE</td><td>S-11928</td><td></td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates </td><td>Delta Technologies</td><td>CB-40IN-1107</td><td></td></tr><tr><td>DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSU100375</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber microcapillaries</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP530700</td><td></td></tr><tr><td>Tubing and microcapillary fittings</td><td>Sandia National Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate tubing</td><td>Paradigm Optics</td><td>CTPC100-500-5</td><td></td></tr><tr><td>8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 &#956;l capacity) syringes</td><td>Hamilton Company</td><td>54848-01</td><td></td></tr><tr><td>Parylene-C vapor deposition instrument</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>PDS 2010 Labcoter 2</td><td></td></tr><tr><td>High-voltage function generator</td><td>Trek</td><td>615A-1 615-3</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Optioneel (maakt het volgen van druppels op DMF hub mogelijk)</td></tr><tr><td>QIClick digitale CCD-camera</td><td>QImaging</td><td>QIClick-F-CLR-12</td><td>Optioneel (maakt het volgen van druppels op DMF hub mogelijk)</td></tr></tbody></table>

een veelzijdige geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie experimenten

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt belangrijk inzicht in complexe biologische systemen. Gebruikelijke werkwijzen en apparatuur voor in vitro analyses zijn zeer geschikt voor onderzoek van grote aantallen cellen (≥ 10 5) in milliliter volumes schaal (≥ 0,1 ml). Er zijn vele gevallen waarin het nodig of wenselijk om de schaal van cultuur maat om het verbruik van de cellen van belang en / of reagentia die nodig zijn voor hun cultuur, stimulatie of verwerking te verminderen. Helaas, conventionele benaderingen ondersteunen geen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen, en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een eenvoudige en veelzijdige technologieplatform ontwikkeld voor het geautomatiseerd cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 - 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform omvat een set van fibronectine gecoate microcapillairen (&quot;cell perfusiekamers&quot;), waarin micro-schaal kweken opstellen, handhaven en gestimuleerd, een digitale microfluidics (DMF) apparaat uitgerust met een &quot;overdracht&quot; microcapillairen (&quot;central hub &quot;), welke routes cellen en reagentia en naar de perfusiekamers, een hoge precisie spuitpomp, welke bevoegdheden transport van materialen tussen de perfusiekamers en de centrale naaf, en een elektronische schakeling die de controle over vervoer van materiaal bepaalt welke gecoördineerd en geautomatiseerd via vooraf bepaalde scripts. Als voorbeeld gebruikten we het platform om het onderzoek transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën vergemakkelijken. Gebruik van het platform konden we het verbruik van cellen en reagentia te verminderen, te minimaliseren experiment-to-experiment variabiliteit, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, our platform moet gebruik vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.

Als een demonstratie van de geautomatiseerde platform, we gebruikten het voor het uitvoeren van een studie waarin kleine populaties van immuuncellen werden gekweekt in micro-schaal culturen, uitgedaagd met bacteriën, en gelyseerd voor off-platform analyse van pro-inflammatoire reacties (figuur 2 ). Elk van zes cel perfusiekamers werd geënt met 10 4 immuuncellen (P388D.1 murine macrofagen) geresuspendeerd in 10 pl groeimedium. Na een periode hechting (37 ° C gedure...

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Het algemene doel van deze procedure is het assembleren en gebruiken van een semi-geautomatiseerd microfluïdisch platform om kleine celpopulaties te kweken en te stimuleren, en om cellysaten terug te winnen voor moleculaire analyses. Dit wordt bereikt door eerst microscale celculturen te vestigen in met fibronectine gecoate microcapillaries, die worden aangeduid als celperfusiekamers. De tweede stap is om de perfusiekamers te verbinden met een digitale microfluïdische module (DMF-module), die een flexibele methode biedt waarmee reagentia naar en van de microscale celculturen worden geleid.Vervolgens brengt de DMF-module de gewenste stimulus over naar de perfusiekamers en worden de cellen gedurende een vooraf bepaalde blootstellingstijd met de stimulus geïncubeerd. Ten slotte worden de cellen via chemische weg gelyseerd en worden de lysaten op de DMF-module opgevangen voor moleculaire analyse. De opgevangen lysaten worden vervolgens geanalyseerd middels kwantitatieve R-T-P-C-R om de transcriptionele respons van de celpopulatie op de stimulus te karakteriseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele celkweekmethoden is dat het met deze techniek mog

a-versatile-automated-platform-for-micro-scale-cell-stimulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

This video demonstrates the use of an extracellular matrix-coated microfluidic chip to differentiate neural stem and progenitor cells or NPCs through electrical stimulation. After seeding and adhering to the coated region, NPCs grow, and the application of a direct current  triggers their differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.

Electrical Stimulation-Induced Differentiation of Neural Stem and Progenitor Cells

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en karakteriseren van een pneumatisch bedienend microfluïdisch apparaat voor chondrocyten compressie.

Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.

Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Dit protocol beschrijft miniaturiseerde CRISPR–Cas9 genoombewerking van de TCRα/β receptor in primaire menselijke T-cellen met behulp van 'DMF-ection', een digitaal microfluïdisch (DMF) elektroporatieplatform. De methode maakt parallelle, laag-input genbewerking met hoge levensvatbaarheid mogelijk en is verder aanpasbaar voor mRNA-levering in meercellige 3D-sferoïden.

Een digitaal microfluïdisch elektroporatieplatform voor low-input CRISPR-genoombewerking en mRNA-transfectie in suspensie-T-cellen en 3D-celmodellen

Leer een semi-geautomatiseerd microfluidisch platform voor celcultuur en stimulatie met digitale microfluidica. Deze methode maakt precieze controle over kleine celpopulaties en herstel van lysaten voor moleculaire analyses mogelijk.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Meer video's verkennen