Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten
6 augustus 2013
We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.
Het algemene doel van deze procedure is om een semi-automatisch microfluïdisch platform te assembleren en te gebruiken om kleine populaties cellen te cultiveren en te stimuleren en cellysaten te recupereren voor moleculaire analyses. Dit wordt bereikt door eerst microschaal cellenculturen op fibronectine gecoate micro capillairen, de zogenaamde celperfusiekamers, te vestigen. De tweede stap is om de perfusiekamers aan te sluiten op een digitaal microfluïdisch of DMF module, die een flexibele manier biedt waarop reagentia naar en van de microschaal cellenculturen worden geleid.
Vervolgens levert de DMF module het gewenste stimulus aan de perfusiekamers en worden de cellen gedurende een vooraf bepaalde blootstellingstijd met het stimulus geïncubeerd. Ten slotte worden de cellen door chemische middelen gelyseerd en worden de lysaten op het DMF module voor moleculaire analyse verzameld. De verzamelde lysaten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van kwantitatieve R-T-P-C-R om de transcriptionele respons van de celpopulatie op het stimulus te karakteriseren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele celteeltmethoden is dat het met deze techniek mogelijk is om celstimulatiestudies uit te voeren met kleine hoeveelheden cellen en ook kleine hoeveelheden reagentia te gebruiken. Ons onderzoek heeft aangetoond dat de precieze behandeling van cellen en reagentia op microschaal door het platform de variabiliteit tussen experimenten minimaliseert. Het platform is ook zeer veelzijdig.
Het digitale microflow module kan cellen en reagentia met grote flexibiliteit naar en van de perfusiekamers leiden, zodat experimenten snel en eenvoudig kunnen worden aangepast en geconfigureerd. Om te beginnen, bereidt u een steriele oplossing van 50 microgram per milliliter fibronectine en gebruikt u een multi-poort spuitpomp om 30 microliter van de oplossing in elke micro capillair te trekken om de coating van de binnenoppervlakken van de micro capillair te versnellen. Incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius, trek vervolgens de fibronectine oplossing terug en gooi deze weg en laat de micro capillairen zes uur op kamertemperatuur drogen.
Verbind vervolgens de met fibronectine gecoate micro capillairen of perfusiekamers met polycarbonaat slangen en de slangen met de spuitpomp met behulp van capite fittingen. De hier getoonde opstelling maakt gebruik van een spuitpomp met een hulppoort die zes perfusiekamers ondersteunt. Gebruik tape om de body van elke perfusiekamer aan een hitteblok te bevestigen en stel de temperatuur van het hitteblok in op 37 graden Celsius.
Dompel vervolgens de open uiteinden van de perfusiekamers in een reservoir met cellen, opgehangen in vers groeimedium, gelijkmatig verspreid op een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Instrueer de spuitpomp om 10 microliter van de celsuspensie in elke perfusiekamer te trekken. Verwijder vervolgens de open uiteinden van de perfusiekamers uit de celsuspensie en instrueer de spuitpomp om voldoende lucht te trekken om de vloeistofplukjes in de secties te verplaatsen die aan het hitteblok zijn bevestigd.
Laat de cellen aan de met fibronectine gecoate binnenoppervlakken van de perfusiekamers hechten door ze gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius te incuberen. Overbreng intussen de open uiteinden van de perfusiekamers naar een nieuw reservoir met vers groeimedium. Na de hechtingsperiode, instrueer de spuitpomp om de vloeistofplukjes naar afval te sturen en vervolgens 10 microliter vers medium in elke overvloedige kamer te trekken, gevolgd door voldoende lucht om het verse medium boven de gehechte cellen te plaatsen.
Vervolg het incuberen van de cellen bij 37 graden Celsius, het medium elke twee uur verversend totdat de culturen voldoende zijn geëquilibreerd en uitgebreid.Patron. De bodemplaat van het DMF module met 46 indium tin oxide elektroden. Gebruik standaard fotolitografische technieken om de bodemplaat van het DMF module te coaten met vijf micrometer Lene C via chemische dampafzetting, en bedek vervolgens met 50 nanometer Teflon af.
Spin vervolgens een ongecoate indium tin oxide glassubstraat met 50 nanometer Teflon AF om te gebruiken als de bovenplaat. Gebruik metalen compressieframes om de platen in een polymeervorm te fixeren met uitsparingen die een afstand van 400 micrometer tussen de platen handhaven. Deze afstand in combinatie met de actueringselektrodegrootte van 2,5 millimeter vierkant definieert het druppelvolume als 2,5 microliter per elektrode.
Voeg vervolgens Teflon gecoate overdracht micro capillairen in de ruimte tussen de DMF platen. Positioneer elk zodat het zich uitstrekt tot aan de rand van zijn cognate actueringselektrode tot het tegenoverliggende uiteinde van elke overdracht. Bevestig een capite fitting aan het micro capillair.
Schakel vervolgens de elektrische connectoren in om spanning te leveren aan de Indium 10 oxide elektroden. Elektrode activeringssequenties worden geautomatiseerd door gebruik te maken van een computergestuurde elektronische interface die vooraf bepaalde scripts uitvoert. Vul vervolgens de onboard reservoirs van de DMF module met de juiste reagentia voor celstimulatie, wassen en lysis.
In sommige gevallen is het het beste om de stimulus zelf in een later stadium te laden, net voor het gebruik, door te putten uit de geladen onboard reservoirs, micro druppels op het DMF module af te geven. Test, activering van de micro druppels, inclusief hun transport tussen het DMF module en de overdracht micro capillairen.Blais. Bereid eerst de stimulus voor in vers medium met 0,1%onic F1 27 op een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter.
Laad vervolgens 80 tot 100 microliter van de stimulus in het daarvoor bestemde onboard reservoir. Vervolgens verwijdert u de open uiteinden van de perfusiekamers uit het medium reservoir en plaatst u ze in de capite fittingen die zijn bevestigd aan de uiteinden van de overdracht Micro capillairen en geeft u de spuitpomp de opdracht om de vloeistofplukjes in de perfusiekamers naar de afvalcontainer te sturen. Geef vervolgens de opdracht aan het DMF module om 10 microliter druppels van de stimulus te genereren en deze via de overdracht micro capillairen naar de perfusiekamers te leveren.
Incubeer de cellen met de stimulus bij 37 graden Celsius gedurende één tot vier uur indien nodig. Wissel regelmatig voor vers stimulus na de stimulatieperiode. Geef de spuitpomp de opdracht om de stimulus naar de afvalcontainer te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een semi-geautomatiseerd microfluïdisch platform dat is ontworpen voor het cultiveren en stimuleren van kleine populaties cellen. Het platform maakt nauwkeurige controle over celkweekcondities mogelijk en vergemakkelijkt het herstel van cel-lysaten voor daaropvolgende moleculaire analyse.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celkweek
- Microfluïdica
- Moleculaire analyse
Achtergrond
- Micro-schalige celstimulatie is cruciaal voor het bestuderen van kostbare celpopulaties.
- Geautomatiseerde systemen kunnen de reproduceerbaarheid en efficiëntie in experimenten verbeteren.
- Cel-lysaten bieden waardevolle inzichten in cellulaire reacties.
- Microfluïdische technologieën maken nauwkeurige manipulatie van kleine volumes mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een platform te ontwikkelen voor geautomatiseerde celkweek en -stimulatie.
- Om het herstel van cel-lysaten voor moleculaire analyses mogelijk te maken.
- Om studies met beperkte celpopulaties en reagentia te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Opzetten van microschalige celculturen in fibronectine-gecoate micro haarvaten.
- Verbinding van perfusiekamers met een digitaal microfluïdische (DMF) module.
- Toediening van stimuli aan de cellen via de DMF module.
- Herstel van cel-lysaten voor analyse met behulp van kwantitatieve R-T-P-C-R.
Belangrijkste resultaten
- Het platform cultiveert en stimuleert met succes kleine celpopulaties.
- Cel-lysaten werden effectief hersteld voor moleculaire analyse.
- Kwantitatieve R-T-P-C-R leverde inzichten in transcriptionele reacties.
- Het systeem toonde veelzijdigheid in het hanteren van verschillende reagentia.
Conclusies
- Het geautomatiseerde platform is geschikt voor studies met kostbare cellen.
- Het biedt een betrouwbare methode voor het analyseren van cellulaire reacties op stimuli.
- Deze technologie kan onderzoek in de celbiologie en aanverwante gebieden bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This platform addresses the need for precise, reproducible manipulation of micro-scale cell cultures, reducing reagent and cell consumption while minimizing experimental variability. It enables reliable transcriptional response profiling in limited cell populations, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery workflows. The automation and versatility improve throughput and resource efficiency for immunology and infectious disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in immune cells to bacterial stimuli with high reproducibility.
- Operational Value: Reduces cell and reagent consumption by up to 50-fold, supporting precious sample studies.
- Strategic Value: Facilitates target hypothesis testing in limited-cell scenarios, improving go/no-go decision confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative gene expression readouts via qRT-PCR for stimulus-response profiling.
- Operational Value: Standardizes micro-scale culture and stimulation through automated fluid handling and scripting.
- Strategic Value: Enables assay miniaturization for screening compounds or stimuli in low-volume formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking of immune pathways by comparing micro-scale and conventional culture responses.
- Operational Value: Maintains comparable variability to macro-scale systems while using far fewer cells.
- Strategic Value: Enables preclinical-like stimulus testing in systems optimized for limited primary cell availability.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into early discovery workflows by enabling controlled stimulation and lysis of small cell populations for downstream molecular analysis, particularly in target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune cell responses to infectious agents via precise stimulus delivery and timing.
- Screening: Delivers reproducible micro-scale culture conditions suitable for compound or stimulus screening in low-cell-number formats.
- Analytics: Generates lysates compatible with qRT-PCR for quantitative transcriptional profiling and pathway analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent immune response modeling in scaled-down systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable microfluidic hub adaptable to various cell types, stimuli, and analytical endpoints via script-driven automation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced variability and precise stimulus control.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of micro-scale cell culture and stimulation workflows.
- Strategic Value: Improved capital efficiency via reduced reagent use and hands-on time, enabling more data points per sample.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on reliable micro-scale functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, fibronectin coating, and syringe pump programming.
- Needs digital microfluidics module, perfusion chambers, high-precision pump, and electronic interface with scripting capability.
- Demands standardization of coating, seeding, and stimulation protocols across users and labs.
- Must adapt extracellular matrix or tethering strategies for non-adherent or sensitive cell types.
- Limited to adherent cell types or those amenable to surface tethering; passivation and cleaning steps required between runs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:59
Assembly and Population of the Cell Perfusion Chambers
4:28
Fabrication of the Digital Microfluidic (DMF) Module and Assembly of the Hub Architecture
6:37
Stimulation of Cell Populations
7:45
Terminate Stimulation and Recovery of Cell Lysates
11:16
Conclusion
9:19
Results: Micro-scale Cell Stimulation Produces Results Similar to Conventional Cultures
