Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Het algemene doel van deze procedure is het assembleren en gebruiken van een semi-geautomatiseerd microfluïdisch platform om kleine celpopulaties te kweken en te stimuleren, en om cellysaten terug te winnen voor moleculaire analyses. Dit wordt bereikt door eerst microscale celculturen te vestigen in met fibronectine gecoate microcapillaries, die worden aangeduid als celperfusiekamers. De tweede stap is om de perfusiekamers te verbinden met een digitale microfluïdische module (DMF-module), die een flexibele methode biedt waarmee reagentia naar en van de microscale celculturen worden geleid.

Vervolgens brengt de DMF-module de gewenste stimulus over naar de perfusiekamers en worden de cellen gedurende een vooraf bepaalde blootstellingstijd met de stimulus geïncubeerd. Ten slotte worden de cellen via chemische weg gelyseerd en worden de lysaten op de DMF-module opgevangen voor moleculaire analyse. De opgevangen lysaten worden vervolgens geanalyseerd middels kwantitatieve R-T-P-C-R om de transcriptionele respons van de celpopulatie op de stimulus te karakteriseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele celkweekmethoden is dat het met deze techniek mogelijk is om celstimulatiestudies uit te voeren met kleine hoeveelheden cellen en kleine hoeveelheden reagentia. Ons onderzoek heeft aangetoond dat de nauwkeurige hantering van cellen en reagentia op microschaal met dit platform de variabiliteit tussen experimenten minimaliseert. Het platform is bovendien zeer veelzijdig.

De digitale microstroommodule kan cellen en reagentia met grote flexibiliteit naar en van de perfusiekamers routeren, zodat experimenten snel en gemakkelijk kunnen worden aangepast en geconfigureerd. Begin met het bereiden van een steriele oplossing van 50 µg/mL fibronectine en gebruik een multi-poort spuitenpomp om 30 µL van de oplossing in elke microcapillair te trekken om de coating van de binnenoppervlakken van de microcapillairs te versnellen. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C, trek vervolgens de fibronectine-oplossing eruit om deze weg te gooien en laat de microcapillairs zes uur drogen bij kamertemperatuur.

Sluit vervolgens de met fiber-nin gecoate microcapillairen of perfusiekamers aan op polycarbonaatbuisjes en verbind de buisjes met de spuitpomp met behulp van capillaire koppelingen. De hier getoonde opstelling maakt gebruik van een aid port spuitpomp die zes perfusiekamers ondersteunt. Bevestig de behuizing van elke perfusiekamer met tape aan een warmteblok en stel de temperatuur van de warmteblokken in op 37 °C.

Dompel vervolgens de open uiteinden van de perfusiekamers onder in een reservoir met cellen, gesuspendeerd in vers groeimedium en gelijkmatig verdeeld bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Stel de spuitenpomp zo in dat er 10 µL van de celsuspensie in elke perfusiekamer wordt getrokken. Verwijder vervolgens de open uiteinden van de perfusiekamers uit de celsuspensie en stel de spuitenpomp zo in dat er voldoende lucht wordt getrokken om de vloeistofpluggen naar de secties te verplaatsen die aan het warmteblok zijn bevestigd.

Laat de cellen hechten aan de met fibronectine gecoate binnenoppervlakken van de perfusiekamers door ze één tot twee uur te incuberen bij 37 °C. Verplaats ondertussen de open uiteinden van de perfusiekamers naar een nieuw reservoir met vers groeimedium. Laat de spuitpomp na de adhesieperiode de vloeistofpluggen naar de afvalbak sturen en trek vervolgens 10 µL vers medium in elke perfusiekamer, gevolgd door voldoende lucht om het verse medium over de gehechte cellen te positioneren.

Incubeer de cellen verder bij 37 °C en vervang het medium elke twee uur totdat de culturen voldoende zijn geëquilibreerd en uitgebreid.Patroon. De bodemplaat van de DMF-module met 46 indiumtinoxide-elektroden. Breng met standaard fotolitografische technieken een laag van vijf micron Lene C aan op de bodemplaat van de DMF-module via chemische dampafzetting, en spin-coat vervolgens een laag van 50 nanometer Teflon af.

Pas vervolgens spin-coating toe op een niet-gepatroneerd indiumtinoxide-glassubstraat met 50 nanometers Teflon AF om als bovenplaat te dienen. Gebruik metalen compressieramen om de platen te fixeren in een polymere mal met uitsparingen die een afstand van 400 micron tussen de platen handhaven. Deze afstand, in combinatie met de afmeting van de actuatie-elektrode van 2,5 vierkante millimeters, bepaalt het druppelvolume op 2,5 microliters per elektrode.

Plaats vervolgens Teflon-gecoate transfermicrocapillairen in de ruimte tussen de DMF-platen. Positioneer elke capillair zodanig dat deze zich uitstrekt vanaf de rand van de bijbehorende actuatie-elektrode tot aan het tegenovergestelde uiteinde van elke transfermicrocapillair en bevestig een fitting aan de kopzijde.

Sluit vervolgens de elektrische connectoren aan om spanning aan te leggen op de Indium 10-oxide-elektroden. De activeringssequenties van de elektroden zijn geautomatiseerd via een computergestuurde elektronische interface die vooraf bepaalde scripts uitvoert. Vul daarna de reservoirs aan boord van de DMF-modules met de juiste reagentia voor celstimulatie, wassen en lysis.

In sommige gevallen is het raadzaam om de stimulus zelf in een latere stap te laden, vlak voor gebruik, door gebruik te maken van de geladen boordreservoirs, en microdruppels op de DMF-module te dispenseren. Test de actuatie van de microdruppels, inclusief hun transport tussen de DMF-module en de overdrachtsmicrocapillairen. Blais. Bereid eerst de stimulus voor in vers medium met 0,1%onic F1 27 bij een eindconcentratie van 100 µg/mL.

Laad vervolgens 80 tot 100 µL van de stimulus in het daarvoor bestemde reservoir aan boord. Verwijder daarna de open uiteinden van de perfusiekamers uit het mediumreservoir en plaats deze in de capite-koppelingen die aan de uiteinden van de transfer-microcapillairen zijn bevestigd. Instrueer vervolgens de spuitpomp om de vloeistofpluggen in de perfusiekamers naar de afvalcontainer te sturen. Instrueer daarna de DMF-module om druppels van 10 µL stimulus te genereren en deze via de transfer-microcapillairen naar de perfusiekamers te transporteren.

Incubeer de cellen met de stimulus bij 37 °C gedurende één tot vier uur indien vereist. Vervang de stimulus op regelmatige intervallen na de stimuleringsperiode. Programmeer de spuitpomp om de stimulus naar de afvalbak te sturen en instrueer de DMF-module om een druppel van 10 µL wasbuffer in elke perfusiekamer te brengen.

Incubeer de cellen gedurende vijf minuten met de wasbuffer. Vervang vervolgens de wasbuffer door 10 µL lysiselectie en incubeer nog eens vijf minuten. Instrueer daarna de spuitenpomp om elk cellysaat naar de DMF-module te sturen.

Verwijder de bovenplaat van de DMF-module en let erop dat u de plaat niet zijwaarts kantelt, omdat dit kan leiden tot kruiscontaminatie tussen de druppels. Verzamel tot slot de lysaten uit de open DMF-module met een pipet voor analyse buiten het platform, zoals genexpressie-profilering via kwantitatieve R-T-P-C-R, om het platform voor te bereiden op het volgende experiment. Dompel eerst de overdrachtsmicrocapillairen, CAPITE-koppelingen en DMF-moduleplaten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder in 10% bleekmiddel; de DMF-moduleplaten worden vervolgens gespoeld met isopropanol, gevolgd door gedeïoniseerd water, gedroogd met stikstofgas en daarna 10 minuten gebakken bij 160 °C.

De zaaimethoden die in dit protocol worden beschreven, resulteerden in de aanhechting van ongeveer 500 miren-macrofagen per perfusiekamer. Na incubatie van de cellen met groeimedium bij 37 °C gedurende 16 uur, verdubbelde de populatiegrootte naar ongeveer 1000 cellen per perfusiekamer. Hier worden de resultaten getoond van een kwantitatieve R-T-P-C-R-analyse van vier genen waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in de aangeboren immuunrespons op bacteriën.

De macrofagen werden gekweekt in conventionele of microscale-culturen en gestimuleerd met e coli bio-particles gedurende één of vier uur. De blauwe balken geven de gemiddelde fold-toename in genexpressie aan na stimulatie van conventioneel gekweekte cellen, terwijl de rode balken de geïnduceerde expressie aangeven in cellen die zijn gekweekt en gestimuleerd. In microscale-culturen geven de foutenbalken de standaarddeviaties aan tussen biologische replica's van drie onafhankelijke experimenten.

De resultaten van de genexpressieprofilering waren zeer vergelijkbaar, ondanks dat de conventionele culturen 96-wells platen gebruikten met ongeveer 50.000 cellen per well, terwijl de microscale culturen microcapillairen gebruikten met ongeveer 1000 cellen per perfusiekamer. De variabiliteit tussen experimenten was ten minste vergelijkbaar en vaak lager in microscale culturen, zoals blijkt uit de kortere foutbalken bij het werken op microschaal. Het celverbruik was vijfmaal lager en het verbruik van reagentia was drie tot 50 maal lager in vergelijking met de conventionele experimenten.

De methode kan worden gebruikt om vrijwel elk adherent celtype te kweken, waarbij in sommige gevallen een ander extracellulair matrixcomponent of groeimedium wordt gebruikt. Niet-adherente celtypen kunnen uitdagend zijn, maar celverankeringsstrategieën zijn in soortgelijke contexten succesvol gebleken. De hier beschreven aanpak ondersteunt cultuur op microschaal voor maximaal 24 uur.

Het platform bevat ook alle functies om langetermijnculturen uit te voeren, maar er moet nog een protocol voor het passeren van cellen worden ontwikkeld. Aanvullende modules kunnen via de microcapillaire interconnects in de digitale microfluidische kubus worden geïntegreerd. Op deze manier dient de DMF als een centraal knooppunt voor het verbinden van perifere modules om complexe workflows uit te voeren.

We hebben ons hoofdzakelijk gericht op het karakteriseren van transcriptionele gastheerresponsen op infectieuze agentia, maar het platform is ontworpen om uiterst veelzijdig te zijn en zou daarom een breed scala aan onderzoekstoepassingen moeten ondersteunen.