Genetische Manipulatie in

Het algemene doel van deze procedure is een efficiënte en betrouwbare genvervanging met gebruik van type één en type twee delta twee 80-stammen van Toxoplasmic ndii. Dit wordt bereikt door eerst een targeting-DNA-molecuul te construeren dat de HX GPRT-selecteerbare marker in de voorwaartse oriëntatie fuseert tussen verschillende five prime en three prime gen-targeting DNA-flanken. De tweede stap van de procedure is het transfecteren van het targeting-DNA-molecuul in een type één of type twee toxoplasma DYI-stam.

De derde stap is om geduldig te selecteren op dubbele crossover homologe recombinatiegebeurtenissen en individuele klonen te isoleren. De laatste stap is om de aanwezigheid van de gene targeting-gebeurtenis in de geïsoleerde mutantklonen te valideren. Uiteindelijk kunnen de resultaten van deze procedure de functie van parasietgenen aantonen door de analyse van gerichte gene knockouts, genvervangingen en getagde genen via een verscheidenheid aan downstream applicaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die gebruikmaken van wild-type stammen van deze parasiet, is dat de type één en type twee delta twee 80 parasietachtergronden nu een uiterst betrouwbare selectie mogelijk maken van gerichte double crossover homologe recombinatie-gebeurtenissen om nauwkeurig genetisch gedefinieerde stammen te produceren. Deze techniek zal de ontdekking van nieuwe targets voor antitoxine plasma-drugtherapie en de ontwikkeling van veilige en effectieve geattenueerde vaccinstammen aanzienlijk versnellen, vooral in combinatie met de goed doordachte genomische bronnen die online beschikbaar zijn op toxodb.org. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het engineeren van gerichte DNA-moleculen of genetische manipulaties met Toxoplasma Gandhi.

Echter, patiëntenpraktijk en het ontwerp van betrouwbare targetmoleculen zullen het succes waarborgen. Begin het protocol door de 5'- en 3'-genomische targetflanken voor het gen van interesse via PCR te amplificeren vanuit genomisch DNA. Amplificeer vervolgens via PCR de HX GPRT selecteerbare marker met de bijbehorende 5'- en 3'-DHFR flanken vanuit de HX GPRT CD NA mini-gen cassette.

Gebruik gist-recombinatie of een soortgelijke methode om de 3D NA-moleculen in hun juiste 5' naar 3' oriëntatie te fuseren met plasmide PRS four 16, om zo plasmide p delta GOI te genereren dat de deletie bij het gen van interesse zal targeten. Bereid vervolgens een monster van 100 µL voor dat 15 tot 30 µg gelineariseerd targeting-plasmide bevat voor transfectie in T gia 68 tot 72 uur na het inoculeren van een 25 cm kolf met confluente HFF-cellen. Verifieer de aanwezigheid van vers gelyseerde parasieten door visueel te bevestigen dat 90 tot 95% van de HFF-cellen is gelyseerd; levensvatbare parasieten zijn essentieel voor gene targeting.

Agiteer de levensvatbare parasieten in de oplossing door de gesloten kolf krachtig te schudden, zonder vloeistof op de binnenkant van de dop of de hals van de kolf te spatten. Oogst de parasieten uit de kolf en bereid ze voor op transfectie zoals beschreven in het tekstprotocol. Elektroporeer het targeting-plasmide in de delta CO 80 toxoplasma-stam.

Overbreng het geëlektroporeerde mengsel naar een kolf van 150 centimeter met confluente HFF-cellen en 30 milliliters infectiemedium. Incubeer de geïnfecteerde cultuur gedurende de nacht bij 37 °C, ongeveer 20 uur na transfectie. Vervang het medium door MPA plus X selectiemedium.

Laat de parasieten nu ongeveer acht dagen incuberen bij 37 °C, zonder verstoring. Zodra plaques zichtbaar zijn, schudt u de kolf om extracellulaire parasieten van de monocultuur los te maken, waardoor een parasietoplossing ontstaat. Breng ongeveer 0,5 mL van de parasietoplossing over naar een nieuwe 25 cm kolf met confluente HFF-cellen die vijf mL MPA plus X selectiemedium bevat.

Benoem deze cultuur ongeveer drie dagen later als PAs een A. Herhaal de overdracht van een halve milliliter van de parasietenoplossing van de oorspronkelijke fles naar een andere fles met HFF-cellen met hetzelfde selectiemedium. Benoem deze cultuur gedurende de volgende vijf dagen als PAs een B.

Controleer passage één A en één B op pfu. Selecteer op basis van een adequaat aantal van meer dan 25 infectiezones ofwel passage één A of passage één B voor subklonering. Zodra de parasieten de HFF-cellen lyseren, wordt de cultuur overgezet naar een nieuwe fles van 25 centimeter met confluente HFF-cellen met selectiemedium. Drie weken na transfectie worden vers aangebrachte parasieten gesubkloneerd door de parasieten te verdunnen tot de juiste concentratie in MPA plus X-medium en de parasietenoplossing gelijkmatig te verdelen over een 96-wellplaat met confluente HFF-cellen.

Bereid één tray voor met een concentratie van één parasiet per well en bereid een tweede tray voor met een concentratie van twee parasieten per well. Incubeer beide trays bij 37 °C na de oorspronkelijke transfectiedatum. Subcloneer de parasieten niet vóór dag 20 voor type één parasieten of dag 25 voor type twee parasieten.

Zet de 25 centimeter kolf wekelijks over volgens het schema in de onlinetekst tot de knockout-stam is gevalideerd. Evalueer na ongeveer een week de 96-wells platen bij een vergroting van 40 tot 60 x. Selecteer uitsluitend wells die een enkele PFU bevatten, geïdentificeerd als een enkele infectiezone, met een pipet ingesteld op 50 µL.

Meng de inhoud van deze wells door de vloeistofstroom over de PFU te richten om de parasieten over de well te verspreiden. Vier tot vijf dagen na het mengen van de geselecteerde wells kiest u een dozijn klonen met gelyste cellen. Draag 12 klonen over van de 96-well tray naar 12 wells van een 24-well tray. Doe dit door met een pipetpunt over de bodem van de well te schrapen en zes µL op te zuigen.

Breng de oplossing over naar een well van een 24-well tray met confluente HFF-cellen in één milliliter MPA plus X-selectiemedium. Incubeer de 24-well tray bij 37 °C en monitor op lysis van de HFF-cellen. Passageer de parasieten uit een gelyseerde well in de 24-well tray volgens een wekelijks schema.

Gebruik de kras-en-tekenmethode om twee µL van de parasietenoplossing over te brengen naar een nieuwe plaat met MPA en X-selectie. Oogst na passage de parasieten uit het oorspronkelijke 24-wells plaatje en breng deze over naar kleine buisjes voor DNA-verzameling.

Gebruik ten slotte PCR om te testen op de deletie van het gen van interesse, om zo de integratie van de 5'- en 3'-doelsequenties te controleren. Controleer daarnaast op de aanwezigheid van de HX GPRT-selecteerbare marker. Dit protocol is bedoeld voor het verwijderen van de HX GPRT-marker uit de gemanipuleerde delta Q 80-stam en wordt beschreven in de onlinetekst.

P delta GOYC is gericht op het verwijderen van HX GPRT uit de parasiet door middel van negatieve selectie met gebruik van zes TX-media. Vervolgens wordt PCR gebruikt om het verlies van HX GPRT te bevestigen; een band van 1,2 Kilobase pair geeft aan dat HX GPRT niet uit de locus is verwijderd. Er is een band van 3,4 kilobase pair.

Het laatste deel van dit protocol, het C-terminaal labelen van eiwitten, wordt eveneens gedetailleerd beschreven in de onlinetekst. Nadat het beschreven protocol voor een gerichte gen deletie was gevolgd, werd PCR gebruikt om de deletie van een knock-out van type one R 18 te valideren, een locus die over het algemeen moeilijk te targeten is. PCR 1 toont de afwezigheid van het R 18-gen PCR-product.

PCR twee toont de aanwezigheid van de 3'-R18 genomische targetflank aan; PCR drie en PCR vier tonen aan dat de selecteerbare marker correct is geïntegreerd tussen de 5'- en 3'-genomische targetflanken, wat de R18-deletie definieert. Om de selecteerbare marker opnieuw te kunnen gebruiken voor volgende deleties in een stam, moet de oorspronkelijke HX GPRT eerst uit de locus worden verwijderd. Volg hiervoor het beschreven protocol.

HX GPRT werd verwijderd uit de gedelete GRA twee locus in stam delta twee 80 delta GRA twee HX. G-P-R-T-P-C-R werd gebruikt om het verlies van HX GPRT te bevestigen, wat werd aangetoond door een band van 1,2 KILOBASE. Wanneer H-X-G-P-R-T niet was verwijderd, was er een band van 3,4 kilobase na de initiële stap van gene targeting. Aanvullende methoden voor gene targeting kunnen worden toegepast om meerdere knock-outs te construeren in hetzelfde type één of type twee stam, of om een mutante stam te taggen of te complementeren om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: waar lokaliseert dit eiwit zich in de cel?

Of wat is het belangrijkste domein of de activiteit van dit eiwit of deze route die de biologische functie verklaart? Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het vakgebied om de exploratie van parasitaire genfuncties in het model AP-complex en de parasiet Toxoplasma te intensiveren. Gandhi eye.

Vergeet niet dat het werken met Toxoplasma gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van alle BSL-2 richtlijnen, gedurende de gehele procedure in acht moeten worden genomen.