Bacteriële transformatie: elektroporatie
Bacteriële transformatie is een natuurlijk proces waarbij bacteriën vreemd DNA opnemen en vervolgens amplifieren of klonen. In het laboratorium kan dit proces kunstmatig worden geïnduceerd door gebruik te maken van elektrische velspulsen met een hoog voltage om poriën in het bacteriële celmembraan te creëren, waardoor plasmid DNA kan passeren. Electroporatie verwijst naar deze methode en de volgende video zal de principes, de stapsgewijze procedure en de toepassingen hiervan demonstreren.
Voordat we spreken over de elektroporatie van bacteriën, is het belangrijk om het type DNA te begrijpen dat in deze experimenten wordt gebruikt: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, extrachromosomaal stuk DNA dat fungeert als een vector, een drager van uw specifieke DNA-sequentie.
Of deze sequentie nu een gen is voor een fluorescentie-eiwit in kwallen of een enzym uit planten, het wordt in het plasmide ingevoegd via een gebied dat de multiple cloning site of MCS wordt genoemd. Dit gebied bevat specifieke sequenties die worden gesplitst door restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen. Dezelfde restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt om uw sequentie van belang uit te snijden, zodat de uiteinden complementair zijn aan de nieuw gesneden uiteinden van het plasmide.
Plasmiden bevatten ook een replicatieoorsprong, afgekort ORI, die het punt aangeeft waarop het gerepliceerd zal worden. Wanneer het gaat om transformatie, is het antibioticaresistentiegen van essentieel belang. Zoals de naam al aangeeft, stelt dit gen de bacteriën in staat om een enzym te produceren dat antibiotica neutraliseert, waardoor ze kunnen overleven in media die antibiotica bevatten.
Elektroporatie maakt gebruik van een gespecialiseerd apparaat, een elektroporator genoemd. Doorgaans worden cellen in een elektroporatiecuvet geplaatst, die aan beide zijden elektroden heeft die elektrisch contact maken met de machine zodra deze is ingevoerd.
Bacteriële cellen gemengd met DNA worden in de elektroporatiecuvet geladen en er wordt gedurende enkele milliseconden een elektrisch veld van ongeveer 1000 tot 10,000 volts per centimeter aangelegd. Dit zorgt ervoor dat het potentiaalverschil over het membraan 0,5-1 volts bereikt, wat naar verluidt leidt tot een herschikking van de fosfolipide dubbellaag waaruit het celmembraan bestaat, waardoor poriën worden gevormd. In deze toestand zal plasmid DNA door het membraan passeren en wanneer de puls is voltooid, zal de dubbellaag zichzelf herstellen.
Nadat ze het plasmide hebben opgenomen, kunnen de bacteriën groeien op agarplaten die antibiotica bevatten.
Nu we hebben geleerd over plasmiden en het electroporatiemechanisme, bekijken we hoe de procedure wordt uitgevoerd.
Cellen die gemakkelijk DNA kunnen opnemen, worden competente cellen genoemd. Het meest voorkomende type competente bacteriën dat in moleculair-biologisch onderzoek wordt getransformeerd, is E. coli, de prokaryotische bacteriën die in de onderste darmen leven. E. coli die zijn voorbereid voor electroporatie worden electrocompetente cellen genoemd.
Zorg er bij het werken met bacteriën altijd voor dat het werkvlak zo schoon mogelijk is.
Het werken met bacteriën vereist tevens het toepassen van aseptische technieken. Meestal houdt dit in dat een Bunsenbrander wordt gebruikt om instrumenten te steriliseren en om een convectiestroom te creëren, die luchtgedragen contaminanten wegstuurt van de werkplek.
Verwarm media direct vóór de electroporatie voor tot kamertemperatuur, breng agarplaten met antibiotica naar 37°C en koel electroporatiecuvetten op ijs.
Ontdooi vervolgens gewassen electrocompetente cellen op ijs.
Voeg 1-5uL koud, zoutvrij plasmide van 1ng/μL toe aan de bacteriële cellen, meng voorzichtig en voeg het mengsel toe aan de koude cuvet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Stel het voltage en de veldsterkte van de electroporator in op de juiste instellingen voor uw cellen. Hier ziet u een electroporator die wordt ingesteld op 1700 volt, wat resulteert in een veldsterkte van 17kV/cm.
Veeg de buitenkant van de cuvet droog en plaats deze in de electroporator. Geef de cellen een puls totdat u een pieptoon hoort.
Een mislukte puls veroorzaakt een elektrische ontlading, die waarneembaar is als een zichtbare vonk en een hoorbare knal. Deze ontlading, ook wel arcing genoemd, kan het gevolg zijn van een te hoge zoutconcentratie in de competente cellen of het DNA.
Het succes van uw transformatie kan worden voorspeld door de tijdconstante te noteren; dit is de duur die het voltage nodig heeft om af te nemen na het geven van de puls. Wanneer er zout aanwezig is en de electroporatieoplossing zeer geleidend is, vindt het verval snel plaats, wat de ontlading veroorzaakt en daarmee veel van uw cellen doodt. Voor bacteriën liggen goede tijdconstanten tussen de 5-10 milliseconden.
Verwijder direct na de puls de cuvet en voeg 1 ml medium direct toe aan de cellen. Dit medium met cellen wordt in een buis geplaatst en 1 uur lang bij 37°C geïncubeerd onder schudcondities, zodat de cellen kunnen herstellen.
Voeg vervolgens, met behulp van aseptische techniek, 20-200uL van de cellen toe aan een agarplaat met antibiotica. Keer de platen om zodat de agar bovenop ligt en condenswater niet op de cellen valt, en incubeer deze gedurende de nacht bij 37°C.
Bacteriën die met het plasmide zijn getransformeerd, zouden kolonies moeten vormen. Tel de kolonies en bereken de transformatie-efficiëntie, wat het aantal succesvolle transformanten is gedeeld door de totale hoeveelheid geplaatst DNA.
De agar en de media, die de voeding voor uw bacteriën leveren, moeten vooraf zijn bereid en gesteriliseerd via autoclavering. Laat vloeibare media afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik en laat de agar afkoelen tot 50-55˚C – de temperatuur waarbij antibiotica kunnen worden toegevoegd en platen kunnen worden gegoten. Laat de platen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur om te stollen.
Aangezien bacteriën die voor transformatie worden gebruikt in de vriezer worden bewaard, moeten ze eerst op ijs worden ontdooid, op een agarplaat zonder antibiotica worden uitgezaaid en vervolgens gedurende de nacht bij 37˚C worden gekweekt.
Selecteer met behulp van aseptische techniek een bacteriële kolonie van de agarplaat en kweek deze uit in een grotere cultuur van 500mL gedurende de nacht bij 37°C in een schudincubator.
Terwijl de cellen groeien, bereidt u ongeveer een liter gedeïoniseerd water voor en maakt u een 10% glycerol- en wateroplossing, volume per volume. Autoclaveer de oplossingen en laat ze afkoelen bij 4˚C.
Absorbantiemetingen worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën zich in hun midden-logaritmische groeifase bevinden, wat betekent dat ze gemakkelijk DNA opnemen. Zodra de cellen deze fase hebben bereikt, plaatst u ze op ijs en houdt u ze daar gedurende de hele procedure.
Was vervolgens de cellen door ze te verdelen over twee grote centrifugebuizen en centrifugeer bij 4°C; giet het supernatant af en resuspendeer in koude 100mL steriel gedeïoniseerd water. Herhaal deze stap nog ten minste één keer. Het doel van deze specifieke stap is om zout te verwijderen, wat de elektroporatietechniek sterk zou beïnvloeden.
Voer twee extra wasbeurten uit in 50 ml van 10% glycerol in water en resuspendeer de bacteriën tot slot in deze zelfde oplossing.
Voeg 50μL cellen toe aan meerdere Eppendorf-buisjes. Deze cellen zijn nu klaar voor gebruik bij elektroporatie en moeten bij 4˚C worden bewaard. Ze kunnen ook snel worden ingevroren en worden bewaard bij -80˚C.
Zoals u zult zien, heeft electroporatie vele toepassingen.
Een alternatief voor electroporatie is hitte-shocktransformatie, waarbij de bacteriën worden blootgesteld aan zowel calciumchloride als hitte om DNA in de cellen te introduceren.
In het algemeen is hitte-shock milder voor de bacteriën dan electroporatie en is er geen laag zoutgehalte vereist. Ligatiereacties, waarbij het doelgen in het plasmide wordt ingebracht, kunnen direct worden gebruikt bij hitte-shocktransformatie. Hitte-shocktransformatie is goedkoper dan electroporatie en vereist geen dure apparatuur of cuvetten. Aan de andere kant leidt hitte-shock tot lagere transformatie-efficiënties dan electroporatie en duurt het langer. Bovendien is het beperkt tot bacteriën, gisten en plantenprotoplasten, terwijl electroporatie kan worden toegepast op zoogdiercellen.
Hier ziet u muis-embryonale fibroblasten die in een electroporatiecuvet worden geladen. Zodra de electroporatie is voltooid, kunnen de transformatie-efficiënties worden bepaald door te observeren in welke mate de cellen een groen fluorescent eiwit produceren dat door het plasmide wordt gecodeerd. Transfectie is de term voor de transformatie van zoogdiercellen, waarvoor doorgaans lagere veldsterktes en hogere tijdconstanten nodig zijn dan bij bacteriële cellen.
Electroporatie kan ook worden uitgevoerd in complete dieren, zoals het ontwikkelende kiजenembryo dat u hier ziet. Plasmide-DNA wordt in de hersenen van het kuiken geïnjecteerd, waarna een electroporatieprobe wordt gebruikt om een elektrisch veld aan het hersenweefsel toe te passen. Na een dag of twee worden er door neuronen groene en rode fluorescerende eiwitten geproduceerd - gecodeerd door het plasmide - waarna wetenschappers structurele veranderingen in de ontwikkelende hersenen van het kuiken kunnen observeren.
U heeft zojuist de JoVE-introductie tot bacteriële transformatie via elektroporatie bekeken. Deze video introduceerde het plasmide als het meest getransformeerde type DNA, besprak het biofysische mechanisme dat ten grondslag ligt aan elektroporatie, toonde een algemene procedure voor het uitvoeren van elektroporatie en beschreef hoe elektroporatie kan worden toegepast in zoogdiersystemen. Bedankt voor het kijken!
De term “transformatie” verwijst naar de cellulaire opname van vreemd DNA. In de natuur kan transformatie voorkomen bij bepaalde typen bacteriën. In d…
Bacteriële transformatie is een natuurlijk proces waarbij bacteriën vreemd DNA opnemen en vervolgens amplifieren of klonen. In het laboratorium kan dit proces kunstmatig worden geïnduceerd door gebruik te maken van elektrische velspulsen met een hoog voltage om poriën in het bacteriële celmembraan te creëren, waardoor plasmid DNA kan passeren. Electroporatie verwijst naar deze methode en de volgende video zal de principes, de stapsgewijze procedure en de toepassingen hiervan demonstreren.
Voordat we spreken over de elektroporatie van bacteriën, is het belangrijk om het type DNA te begrijpen dat in deze experimenten wordt gebruikt: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, extrachromosomaal stuk DNA dat fungeert als een vector, een drager van uw specifieke DNA-sequentie.
Of deze sequentie nu een gen is voor een fluorescentie-eiwit in kwallen of een enzym uit planten, het wordt in het plasmide ingevoegd via een gebied dat de multiple cloning site of MCS wordt genoemd. Dit gebied bevat specifieke sequenties die worden gesplitst door restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen. Dezelfde restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt om uw sequentie van belang uit te snijden, zodat de uiteinden complementair zijn aan de nieuw gesneden uiteinden van het plasmide.
Plasmiden bevatten ook een replicatieoorsprong, afgekort ORI, die het punt aangeeft waarop het gerepliceerd zal worden. Wanneer het gaat om transformatie, is het antibioticaresistentiegen van essentieel belang. Zoals de naam al aangeeft, stelt dit gen de bacteriën in staat om een enzym te produceren dat antibiotica neutraliseert, waardoor ze kunnen overleven in media die antibiotica bevatten.
Elektroporatie maakt gebruik van een gespecialiseerd apparaat, een elektroporator genoemd. Doorgaans worden cellen in een elektroporatiecuvet geplaatst, die aan beide zijden elektroden heeft die elektrisch contact maken met de machine zodra deze is ingevoerd.
Bacteriële cellen gemengd met DNA worden in de elektroporatiecuvet geladen en er wordt gedurende enkele milliseconden een elektrisch veld van ongeveer 1000 tot 10,000 volts per centimeter aangelegd. Dit zorgt ervoor dat het potentiaalverschil over het membraan 0,5-1 volts bereikt, wat naar verluidt leidt tot een herschikking van de fosfolipide dubbellaag waaruit het celmembraan bestaat, waardoor poriën worden gevormd. In deze toestand zal plasmid DNA door het membraan passeren en wanneer de puls is voltooid, zal de dubbellaag zichzelf herstellen.
Nadat ze het plasmide hebben opgenomen, kunnen de bacteriën groeien op agarplaten die antibiotica bevatten.
Nu we hebben geleerd over plasmiden en het electroporatiemechanisme, bekijken we hoe de procedure wordt uitgevoerd.
Cellen die gemakkelijk DNA kunnen opnemen, worden competente cellen genoemd. Het meest voorkomende type competente bacteriën dat in moleculair-biologisch onderzoek wordt getransformeerd, is E. coli, de prokaryotische bacteriën die in de onderste darmen leven. E. coli die zijn voorbereid voor electroporatie worden electrocompetente cellen genoemd.
Zorg er bij het werken met bacteriën altijd voor dat het werkvlak zo schoon mogelijk is.
Het werken met bacteriën vereist tevens het toepassen van aseptische technieken. Meestal houdt dit in dat een Bunsenbrander wordt gebruikt om instrumenten te steriliseren en om een convectiestroom te creëren, die luchtgedragen contaminanten wegstuurt van de werkplek.
Verwarm media direct vóór de electroporatie voor tot kamertemperatuur, breng agarplaten met antibiotica naar 37°C en koel electroporatiecuvetten op ijs.
Ontdooi vervolgens gewassen electrocompetente cellen op ijs.
Voeg 1-5uL koud, zoutvrij plasmide van 1ng/μL toe aan de bacteriële cellen, meng voorzichtig en voeg het mengsel toe aan de koude cuvet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Stel het voltage en de veldsterkte van de electroporator in op de juiste instellingen voor uw cellen. Hier ziet u een electroporator die wordt ingesteld op 1700 volt, wat resulteert in een veldsterkte van 17kV/cm.
Veeg de buitenkant van de cuvet droog en plaats deze in de electroporator. Geef de cellen een puls totdat u een pieptoon hoort.
Een mislukte puls veroorzaakt een elektrische ontlading, die waarneembaar is als een zichtbare vonk en een hoorbare knal. Deze ontlading, ook wel arcing genoemd, kan het gevolg zijn van een te hoge zoutconcentratie in de competente cellen of het DNA.
Het succes van uw transformatie kan worden voorspeld door de tijdconstante te noteren; dit is de duur die het voltage nodig heeft om af te nemen na het geven van de puls. Wanneer er zout aanwezig is en de electroporatieoplossing zeer geleidend is, vindt het verval snel plaats, wat de ontlading veroorzaakt en daarmee veel van uw cellen doodt. Voor bacteriën liggen goede tijdconstanten tussen de 5-10 milliseconden.
Verwijder direct na de puls de cuvet en voeg 1 ml medium direct toe aan de cellen. Dit medium met cellen wordt in een buis geplaatst en 1 uur lang bij 37°C geïncubeerd onder schudcondities, zodat de cellen kunnen herstellen.
Voeg vervolgens, met behulp van aseptische techniek, 20-200uL van de cellen toe aan een agarplaat met antibiotica. Keer de platen om zodat de agar bovenop ligt en condenswater niet op de cellen valt, en incubeer deze gedurende de nacht bij 37°C.
Bacteriën die met het plasmide zijn getransformeerd, zouden kolonies moeten vormen. Tel de kolonies en bereken de transformatie-efficiëntie, wat het aantal succesvolle transformanten is gedeeld door de totale hoeveelheid geplaatst DNA.
De agar en de media, die de voeding voor uw bacteriën leveren, moeten vooraf zijn bereid en gesteriliseerd via autoclavering. Laat vloeibare media afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik en laat de agar afkoelen tot 50-55˚C – de temperatuur waarbij antibiotica kunnen worden toegevoegd en platen kunnen worden gegoten. Laat de platen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur om te stollen.
Aangezien bacteriën die voor transformatie worden gebruikt in de vriezer worden bewaard, moeten ze eerst op ijs worden ontdooid, op een agarplaat zonder antibiotica worden uitgezaaid en vervolgens gedurende de nacht bij 37˚C worden gekweekt.
Selecteer met behulp van aseptische techniek een bacteriële kolonie van de agarplaat en kweek deze uit in een grotere cultuur van 500mL gedurende de nacht bij 37°C in een schudincubator.
Terwijl de cellen groeien, bereidt u ongeveer een liter gedeïoniseerd water voor en maakt u een 10% glycerol- en wateroplossing, volume per volume. Autoclaveer de oplossingen en laat ze afkoelen bij 4˚C.
Absorbantiemetingen worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën zich in hun midden-logaritmische groeifase bevinden, wat betekent dat ze gemakkelijk DNA opnemen. Zodra de cellen deze fase hebben bereikt, plaatst u ze op ijs en houdt u ze daar gedurende de hele procedure.
Was vervolgens de cellen door ze te verdelen over twee grote centrifugebuizen en centrifugeer bij 4°C; giet het supernatant af en resuspendeer in koude 100mL steriel gedeïoniseerd water. Herhaal deze stap nog ten minste één keer. Het doel van deze specifieke stap is om zout te verwijderen, wat de elektroporatietechniek sterk zou beïnvloeden.
Voer twee extra wasbeurten uit in 50 ml van 10% glycerol in water en resuspendeer de bacteriën tot slot in deze zelfde oplossing.
Voeg 50μL cellen toe aan meerdere Eppendorf-buisjes. Deze cellen zijn nu klaar voor gebruik bij elektroporatie en moeten bij 4˚C worden bewaard. Ze kunnen ook snel worden ingevroren en worden bewaard bij -80˚C.
Zoals u zult zien, heeft electroporatie vele toepassingen.
Een alternatief voor electroporatie is hitte-shocktransformatie, waarbij de bacteriën worden blootgesteld aan zowel calciumchloride als hitte om DNA in de cellen te introduceren.
In het algemeen is hitte-shock milder voor de bacteriën dan electroporatie en is er geen laag zoutgehalte vereist. Ligatiereacties, waarbij het doelgen in het plasmide wordt ingebracht, kunnen direct worden gebruikt bij hitte-shocktransformatie. Hitte-shocktransformatie is goedkoper dan electroporatie en vereist geen dure apparatuur of cuvetten. Aan de andere kant leidt hitte-shock tot lagere transformatie-efficiënties dan electroporatie en duurt het langer. Bovendien is het beperkt tot bacteriën, gisten en plantenprotoplasten, terwijl electroporatie kan worden toegepast op zoogdiercellen.
Hier ziet u muis-embryonale fibroblasten die in een electroporatiecuvet worden geladen. Zodra de electroporatie is voltooid, kunnen de transformatie-efficiënties worden bepaald door te observeren in welke mate de cellen een groen fluorescent eiwit produceren dat door het plasmide wordt gecodeerd. Transfectie is de term voor de transformatie van zoogdiercellen, waarvoor doorgaans lagere veldsterktes en hogere tijdconstanten nodig zijn dan bij bacteriële cellen.
Electroporatie kan ook worden uitgevoerd in complete dieren, zoals het ontwikkelende kiजenembryo dat u hier ziet. Plasmide-DNA wordt in de hersenen van het kuiken geïnjecteerd, waarna een electroporatieprobe wordt gebruikt om een elektrisch veld aan het hersenweefsel toe te passen. Na een dag of twee worden er door neuronen groene en rode fluorescerende eiwitten geproduceerd - gecodeerd door het plasmide - waarna wetenschappers structurele veranderingen in de ontwikkelende hersenen van het kuiken kunnen observeren.
U heeft zojuist de JoVE-introductie tot bacteriële transformatie via elektroporatie bekeken. Deze video introduceerde het plasmide als het meest getransformeerde type DNA, besprak het biofysische mechanisme dat ten grondslag ligt aan elektroporatie, toonde een algemene procedure voor het uitvoeren van elektroporatie en beschreef hoe elektroporatie kan worden toegepast in zoogdiersystemen. Bedankt voor het kijken!
Bacteriële transformatie is een natuurlijk proces waarbij bacteriën vreemd DNA opnemen en vervolgens amplifieren of klonen. In het laboratorium kan dit proces kunstmatig worden geïnduceerd door gebruik te maken van elektrische velspulsen met een hoog voltage om poriën in het bacteriële celmembraan te creëren, waardoor plasmid DNA kan passeren. Electroporatie verwijst naar deze methode en de volgende video zal de principes, de stapsgewijze procedure en de toepassingen hiervan demonstreren.
Voordat we spreken over de elektroporatie van bacteriën, is het belangrijk om het type DNA te begrijpen dat in deze experimenten wordt gebruikt: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, extrachromosomaal stuk DNA dat fungeert als een vector, een drager van uw specifieke DNA-sequentie.
Of deze sequentie nu een gen is voor een fluorescentie-eiwit in kwallen of een enzym uit planten, het wordt in het plasmide ingevoegd via een gebied dat de multiple cloning site of MCS wordt genoemd. Dit gebied bevat specifieke sequenties die worden gesplitst door restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen. Dezelfde restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt om uw sequentie van belang uit te snijden, zodat de uiteinden complementair zijn aan de nieuw gesneden uiteinden van het plasmide.
Plasmiden bevatten ook een replicatieoorsprong, afgekort ORI, die het punt aangeeft waarop het gerepliceerd zal worden. Wanneer het gaat om transformatie, is het antibioticaresistentiegen van essentieel belang. Zoals de naam al aangeeft, stelt dit gen de bacteriën in staat om een enzym te produceren dat antibiotica neutraliseert, waardoor ze kunnen overleven in media die antibiotica bevatten.
Elektroporatie maakt gebruik van een gespecialiseerd apparaat, een elektroporator genoemd. Doorgaans worden cellen in een elektroporatiecuvet geplaatst, die aan beide zijden elektroden heeft die elektrisch contact maken met de machine zodra deze is ingevoerd.
Bacteriële cellen gemengd met DNA worden in de elektroporatiecuvet geladen en er wordt gedurende enkele milliseconden een elektrisch veld van ongeveer 1000 tot 10,000 volts per centimeter aangelegd. Dit zorgt ervoor dat het potentiaalverschil over het membraan 0,5-1 volts bereikt, wat naar verluidt leidt tot een herschikking van de fosfolipide dubbellaag waaruit het celmembraan bestaat, waardoor poriën worden gevormd. In deze toestand zal plasmid DNA door het membraan passeren en wanneer de puls is voltooid, zal de dubbellaag zichzelf herstellen.
Nadat ze het plasmide hebben opgenomen, kunnen de bacteriën groeien op agarplaten die antibiotica bevatten.
Nu we hebben geleerd over plasmiden en het electroporatiemechanisme, bekijken we hoe de procedure wordt uitgevoerd.
Cellen die gemakkelijk DNA kunnen opnemen, worden competente cellen genoemd. Het meest voorkomende type competente bacteriën dat in moleculair-biologisch onderzoek wordt getransformeerd, is E. coli, de prokaryotische bacteriën die in de onderste darmen leven. E. coli die zijn voorbereid voor electroporatie worden electrocompetente cellen genoemd.
Zorg er bij het werken met bacteriën altijd voor dat het werkvlak zo schoon mogelijk is.
Het werken met bacteriën vereist tevens het toepassen van aseptische technieken. Meestal houdt dit in dat een Bunsenbrander wordt gebruikt om instrumenten te steriliseren en om een convectiestroom te creëren, die luchtgedragen contaminanten wegstuurt van de werkplek.
Verwarm media direct vóór de electroporatie voor tot kamertemperatuur, breng agarplaten met antibiotica naar 37°C en koel electroporatiecuvetten op ijs.
Ontdooi vervolgens gewassen electrocompetente cellen op ijs.
Voeg 1-5uL koud, zoutvrij plasmide van 1ng/μL toe aan de bacteriële cellen, meng voorzichtig en voeg het mengsel toe aan de koude cuvet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Stel het voltage en de veldsterkte van de electroporator in op de juiste instellingen voor uw cellen. Hier ziet u een electroporator die wordt ingesteld op 1700 volt, wat resulteert in een veldsterkte van 17kV/cm.
Veeg de buitenkant van de cuvet droog en plaats deze in de electroporator. Geef de cellen een puls totdat u een pieptoon hoort.
Een mislukte puls veroorzaakt een elektrische ontlading, die waarneembaar is als een zichtbare vonk en een hoorbare knal. Deze ontlading, ook wel arcing genoemd, kan het gevolg zijn van een te hoge zoutconcentratie in de competente cellen of het DNA.
Het succes van uw transformatie kan worden voorspeld door de tijdconstante te noteren; dit is de duur die het voltage nodig heeft om af te nemen na het geven van de puls. Wanneer er zout aanwezig is en de electroporatieoplossing zeer geleidend is, vindt het verval snel plaats, wat de ontlading veroorzaakt en daarmee veel van uw cellen doodt. Voor bacteriën liggen goede tijdconstanten tussen de 5-10 milliseconden.
Verwijder direct na de puls de cuvet en voeg 1 ml medium direct toe aan de cellen. Dit medium met cellen wordt in een buis geplaatst en 1 uur lang bij 37°C geïncubeerd onder schudcondities, zodat de cellen kunnen herstellen.
Voeg vervolgens, met behulp van aseptische techniek, 20-200uL van de cellen toe aan een agarplaat met antibiotica. Keer de platen om zodat de agar bovenop ligt en condenswater niet op de cellen valt, en incubeer deze gedurende de nacht bij 37°C.
Bacteriën die met het plasmide zijn getransformeerd, zouden kolonies moeten vormen. Tel de kolonies en bereken de transformatie-efficiëntie, wat het aantal succesvolle transformanten is gedeeld door de totale hoeveelheid geplaatst DNA.
De agar en de media, die de voeding voor uw bacteriën leveren, moeten vooraf zijn bereid en gesteriliseerd via autoclavering. Laat vloeibare media afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik en laat de agar afkoelen tot 50-55˚C – de temperatuur waarbij antibiotica kunnen worden toegevoegd en platen kunnen worden gegoten. Laat de platen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur om te stollen.
Aangezien bacteriën die voor transformatie worden gebruikt in de vriezer worden bewaard, moeten ze eerst op ijs worden ontdooid, op een agarplaat zonder antibiotica worden uitgezaaid en vervolgens gedurende de nacht bij 37˚C worden gekweekt.
Selecteer met behulp van aseptische techniek een bacteriële kolonie van de agarplaat en kweek deze uit in een grotere cultuur van 500mL gedurende de nacht bij 37°C in een schudincubator.
Terwijl de cellen groeien, bereidt u ongeveer een liter gedeïoniseerd water voor en maakt u een 10% glycerol- en wateroplossing, volume per volume. Autoclaveer de oplossingen en laat ze afkoelen bij 4˚C.
Absorbantiemetingen worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën zich in hun midden-logaritmische groeifase bevinden, wat betekent dat ze gemakkelijk DNA opnemen. Zodra de cellen deze fase hebben bereikt, plaatst u ze op ijs en houdt u ze daar gedurende de hele procedure.
Was vervolgens de cellen door ze te verdelen over twee grote centrifugebuizen en centrifugeer bij 4°C; giet het supernatant af en resuspendeer in koude 100mL steriel gedeïoniseerd water. Herhaal deze stap nog ten minste één keer. Het doel van deze specifieke stap is om zout te verwijderen, wat de elektroporatietechniek sterk zou beïnvloeden.
Voer twee extra wasbeurten uit in 50 ml van 10% glycerol in water en resuspendeer de bacteriën tot slot in deze zelfde oplossing.
Voeg 50μL cellen toe aan meerdere Eppendorf-buisjes. Deze cellen zijn nu klaar voor gebruik bij elektroporatie en moeten bij 4˚C worden bewaard. Ze kunnen ook snel worden ingevroren en worden bewaard bij -80˚C.
Zoals u zult zien, heeft electroporatie vele toepassingen.
Een alternatief voor electroporatie is hitte-shocktransformatie, waarbij de bacteriën worden blootgesteld aan zowel calciumchloride als hitte om DNA in de cellen te introduceren.
In het algemeen is hitte-shock milder voor de bacteriën dan electroporatie en is er geen laag zoutgehalte vereist. Ligatiereacties, waarbij het doelgen in het plasmide wordt ingebracht, kunnen direct worden gebruikt bij hitte-shocktransformatie. Hitte-shocktransformatie is goedkoper dan electroporatie en vereist geen dure apparatuur of cuvetten. Aan de andere kant leidt hitte-shock tot lagere transformatie-efficiënties dan electroporatie en duurt het langer. Bovendien is het beperkt tot bacteriën, gisten en plantenprotoplasten, terwijl electroporatie kan worden toegepast op zoogdiercellen.
Hier ziet u muis-embryonale fibroblasten die in een electroporatiecuvet worden geladen. Zodra de electroporatie is voltooid, kunnen de transformatie-efficiënties worden bepaald door te observeren in welke mate de cellen een groen fluorescent eiwit produceren dat door het plasmide wordt gecodeerd. Transfectie is de term voor de transformatie van zoogdiercellen, waarvoor doorgaans lagere veldsterktes en hogere tijdconstanten nodig zijn dan bij bacteriële cellen.
Electroporatie kan ook worden uitgevoerd in complete dieren, zoals het ontwikkelende kiजenembryo dat u hier ziet. Plasmide-DNA wordt in de hersenen van het kuiken geïnjecteerd, waarna een electroporatieprobe wordt gebruikt om een elektrisch veld aan het hersenweefsel toe te passen. Na een dag of twee worden er door neuronen groene en rode fluorescerende eiwitten geproduceerd - gecodeerd door het plasmide - waarna wetenschappers structurele veranderingen in de ontwikkelende hersenen van het kuiken kunnen observeren.
U heeft zojuist de JoVE-introductie tot bacteriële transformatie via elektroporatie bekeken. Deze video introduceerde het plasmide als het meest getransformeerde type DNA, besprak het biofysische mechanisme dat ten grondslag ligt aan elektroporatie, toonde een algemene procedure voor het uitvoeren van elektroporatie en beschreef hoe elektroporatie kan worden toegepast in zoogdiersystemen. Bedankt voor het kijken!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary