Bacteriële transformatie: electroporatie

Bacteriële transformatie is een natuurlijk proces waarbij bacteriën vreemd DNA opnemen en dit vervolgens amplificeren of klonen. In het laboratorium kan dit proces kunstmatig worden opgewekt door elektrische velspulsen met een hoog voltage te gebruiken om poriën in het bacteriële celmembraan te creëren, waardoor plasmid DNA kan passeren. Electroporatie verwijst naar deze methode en de volgende video zal de principes, de stapsgewijze procedure en de toepassingen hiervan demonstreren.

Voordat we spreken over de elektroporatie van bacteriën, is het belangrijk om het type DNA te begrijpen dat in deze experimenten wordt gebruikt: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, extrachromosomaal stuk DNA dat fungeert als een vector, een drager van uw specifieke DNA-sequentie.

Of deze sequentie nu een gen is voor een fluorescentie-eiwit in kwallen of een enzym uit planten, het wordt in het plasmide ingevoegd via een regio die de multiple cloning site of MCS wordt genoemd. Deze regio bevat specifieke sequenties die worden gesplitst door restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen. Dezelfde restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt om uw sequentie van belang uit te snijden, zodat de uiteinden complementair zijn aan de nieuw gesneden uiteinden van het plasmide.

Plasmiden bevatten ook een replicatie-oorsprong, afgekort ORI, die het punt aangeeft waarop het gerepliceerd zal worden. Wanneer het op transformatie aankomt, is het antibioticaresistentiegen van vitaal belang. Zoals de naam al aangeeft, stelt dit gen de bacteriën in staat om een enzym te produceren dat antibiotica neutraliseert, waardoor ze kunnen overleven in media die antibiotica bevatten.

Elektroporatie maakt gebruik van een gespecialiseerd apparaat dat een elektroporator wordt genoemd. Meestal worden cellen in een elektroporatiecuvet geplaatst, die aan elke zijde elektroden heeft die elektrisch contact maken met de machine zodra deze wordt ingevoerd.

Bacteriële cellen gemengd met DNA worden in de elektroporatiecuvet geladen en er wordt gedurende enkele milliseconden een elektrisch veld van circa 1000 tot 10.000 volts per centimeter aangelegd. Dit zorgt ervoor dat de spanning over het membraan 0,5-1 volts bereikt, wat naarstede is van een herrangschikking van de fosfolipiden-dubbellaag waaruit het celmembraan bestaat, zodanig dat er poriën worden gevormd. In deze toestand zal plasmid DNA door het membraan passeren en wanneer de puls voltooid is, herstelt de dubbellaag zich.

Nadat ze het plasmide hebben opgenomen, kunnen de bacteriën vervolgens groeien op agarplaten die antibiotica bevatten.

Nu we hebben geleerd over plasmiden en het mechanisme van electroporatie, kijken we naar hoe de procedure wordt uitgevoerd.

Cellen die gemakkelijk DNA kunnen opnemen, worden competente cellen genoemd. Het meest voorkomende type competente bacteriën dat in moleculaire biologie-onderzoek wordt getransformeerd is E. coli, de prokaryote bacteriën die in de dikke darm voorkomen. E. coli die zijn voorbereid voor electroporatie, worden elektrocompetente cellen genoemd.

Zorg er bij het werken met bacteriën altijd voor dat de werkruimte zo schoon mogelijk is.

Het werken met bacteriën vereist tevens het toepassen van aseptische technieken. Meestal houdt dit in dat er een Bunsenbrander wordt gebruikt om instrumenten te steriliseren en om een convectiestroom te creëren, waardoor luchtgedragen verontreinigingen uit de werkruimte worden gehouden.

Verwarm het medium direct voor electroporatie voor tot kamertemperatuur, breng agarplaten met antibiotica naar 37°C en koel de electroporatie-cuvetten op ijs.

Ontdooi vervolgens de gewassen elektrocompetente cellen op ijs.

Voeg 1-5uL van 1ng/μL koud, zoutvrij plasmide toe aan de bacteriële cellen, meng voorzichtig en voeg het mengsel toe aan de koude cuvet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Stel het voltage en de veldsterkte van de electroporator in op de juiste waarden voor uw cellen. Hier ziet u een electroporator die wordt ingesteld op 1700 volt, wat resulteert in een veldsterkte van 17kV/cm.

Veeg de buitenkant van de cuvet droog en plaats deze in de electroporator. Geef de cellen een puls totdat u een pieptoon hoort.

Een mislukte puls veroorzaakt een elektrische ontlading, die waarneembaar is als een zichtbare vonk en een hoorbare knal. Deze ontlading, ook wel arcing genoemd, kan het gevolg zijn van te veel zout in uw competente cellen of DNA.

Het succes van uw transformatie kan worden voorspeld door de tijdconstante te noteren, oftewel de duur die het voltage nodig heeft om af te nemen na het geven van de puls. Wanneer er zout aanwezig is en de electroporatie-oplossing zeer geleidend is, vindt het verval snel plaats, wat de ontlading veroorzaakt en daarmee veel van uw cellen doodt. Voor bacteriën liggen goede tijdconstanten tussen de 5-10 milliseconden.

Verwijder direct na de puls de cuvet en voeg 1 ml medium direct toe aan de cellen. Dit medium met cellen wordt in een buisje geplaatst en 1 uur lang bij 37°C geïncubeerd onder schudcondities, zodat de cellen kunnen herstellen.

Voeg vervolgens, met behulp van aseptische techniek, 20-200uL van de cellen toe aan een agarplaat met antibiotica. Keer de platen om zodat de agar bovenop ligt en condenswater niet op de cellen valt, en incubeer deze overnacht bij 37°C.

Bacteriën die met het plasmide zijn getransformeerd, zouden kolonies moeten vormen. Tel de kolonies en bereken de transformatie-efficiëntie, wat het aantal succesvolle transformanten is gedeeld door de totale hoeveelheid geplaatste DNA.

De agar en media, die de voeding voor uw bacteriën leveren, moeten vooraf zijn bereid en gesteriliseerd via autoclavering. Laat vloeibare media afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik en laat de agar afkoelen tot 50-55˚C – de temperatuur waarbij antibiotica kunnen worden toegevoegd en platen kunnen worden gegoten. Laat de platen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur om te stollen.

Aangezien bacteriën die gebruikt worden bij transformatie in de vriezer worden bewaard, moeten ze eerst op ijs worden ontdooid, uitgeplaat op een agarplaat zonder antibiotica en vervolgens gedurende de nacht worden gekweekt bij 37˚C.

Selecteer met aseptische techniek een bacteriële kolonie van de agarplaat en kweek deze gedurende de nacht bij 37°C in een schuddende incubator in een grotere cultuur van 500mL.

Terwijl de cellen groeien, bereidt u ongeveer een liter gedeïoniseerd water voor en maakt u een 10% glycerol- en wateroplossing, volume per volume. Autoclaveer de oplossingen en laat ze afkoelen bij 4˚C.

Absorptiemetingen worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën zich in hun mid-log fase van groei bevinden, wat betekent dat ze gemakkelijk DNA zullen opnemen. Zodra de cellen deze fase hebben bereikt, plaatst u ze op ijs en houdt u ze daar gedurende de gehele procedure.

Was daarna de cellen door ze te verdelen over twee grote centrifugebuizen en centrifugeer bij 4°C, giet het supernatant af en resuspendeer in koude 100mL steriel gedeïoniseerd water. Herhaal deze stap minimaal nog één keer. Het doel van deze specifieke stap is om zout te verwijderen, wat de elektroporatietechniek sterk zou beïnvloeden.

Voer twee extra wasbeurten uit in 50 ml van 10% glycerol in water en resuspendeer de bacteriën tot slot in dezezelfde oplossing.

Voeg 50μL cellen toe aan meerdere Eppendorf-buisjes. Deze cellen zijn nu klaar voor gebruik bij elektroporatie en moeten bij 4˚C worden bewaard. Eventueel kunnen ze flash-frozen worden en bij -80˚C worden bewaard.

Zoals u zult zien, heeft elektroporatie vele toepassingen.

Een alternatief voor elektroporatie is heatshock-transformatie, waarbij de bacteriën worden blootgesteld aan zowel calciumchloride als hitte om DNA in de cellen te introduceren.

Over het algemeen is heatshock minder belastend voor de bacteriën dan elektroporatie en is er geen lage zoutconcentratie vereist. Ligatiereacties, waarbij het doelgen in het plasmide wordt ingebracht, kunnen direct worden gebruikt bij heatshock-transformatie. Heatshock-transformatie is goedkoper dan elektroporatie en is niet afhankelijk van dure apparatuur of cuvetten. Aan de andere kant leidt heatshock tot lagere transformatie-efficiënties dan elektroporatie en duurt het langer. Bovendien is het beperkt tot bacteriële cellen, gist en plantenprotoplasten, terwijl elektroporatie kan worden toegepast op zoogdiercellen.

Hier ziet u muis embryonale fibroblasten die in een elektroporatiecuvet worden geladen. Zodra de elektroporatie is voltooid, kunnen de transformatie-efficiënties worden bepaald door te observeren in welke mate de cellen een groen fluorescent eiwit produceren dat door het plasmide wordt gecodeerd. Transfectie is de term voor de transformatie van zoogdiercellen, waarvoor doorgaans lagere veldsterktes dan bij bacteriële cellen en hogere tijdconstanten vereist zijn.

Elektroporatie kan ook worden uitgevoerd in hele dieren, zoals het ontwikkelende kiजenembryo dat u hier ziet. Plasmide-DNA wordt in de hersenen van het kuiken geïnjecteerd, waarna een elektroporatiesonde wordt gebruikt om een elektrisch veld op het hersenweefsel aan te leggen. Na een dag of twee produceren neuronen groene en rode fluorescente eiwitten - gecodeerd door het plasmide - waardoor wetenschappers structurele veranderingen in de ontwikkelende hersenen van het kuiken kunnen observeren.

U heeft zojuist de JoVE-introductie over bacteriële transformatie via electroporatie bekeken. Deze video introduceerde het plasmide als het meest getransformeerde type DNA, besprak het biofysische mechanisme dat ten grondslag ligt aan electroporatie, toonde een algemene procedure voor het uitvoeren van electroporatie en beschreef hoe electroporatie kan worden toegepast in mammaliaanse systemen. Bedankt voor het kijken!