Name: CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hoe je DNA-schade meet in zoogdiercellen met de CometChip, een high-throughput 96-well platform. Deze methode verbetert doorvoer en gevoeligheid voor grootschalig onderzoek naar DNA-herstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd in de eerste plaats steunen door 5-UO1-ES016045 met gedeeltelijke steun van 1-R21-ES019498 en R44-ES021116. DMW werd gesteund door de NIEHS Training Grant in Environmental Toxicology T32-ES007020. Apparatuur werd verstrekt door het Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.

1 Voorbereiding van de Spaander <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder chip gel uit de verpakking en plaats in een een-goed rechthoekige plaat, gel film naar beneden. </li><li> Was gel in 25 ml 1x PBS gedurende 15 min, tweemaal herhalen. </li><li> Stel gel op glasplaat en label oriëntatie van gel dienovereenkomstig. </li><li> Druk voorzichtig een omgekeerde bodemloze 96-well plaat op de gel; Zorg ervoor dat alle putjes van de bodemloze put plaat zijn binnen het gebied van de gel. </li><li> Gebruik 1.5&#39;&#39; binder clips aan weerszijden van de plaat klemming vast met het glas. </li><li> Zuig overtollige PBS buffer in elk putje. </li></ol> 2 laden Cellen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bereiden celsuspensies: <ol><li> Verende cellijnen celsuspensie verdund in medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 5 -10 6 cellen / ml te verkrijgen. </li><li> Voor aanhangend cellijnen, volgt normaal losmaken / trypsinisatie protocollen en dilute vrijstaande cellen in medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 5 -10 6 cellen / ml. Indien cellen aggregeren passen celsuspensie in een cel filter om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. </li></ol></li><li> Voeg 100 ul celsuspensie aan elk putje van de 96-well plaat. </li><li> Afdekplaat met de gel film om verdamping van media te voorkomen. </li><li> Laat cellen te laden ten minste 30 min bij 37 ° C incubator. </li><li> Verwijder chip van incubator en zuig media uit elk putje. </li><li> Verwijder bindmiddel clips bodemloze 96-well plaat; Houd de chip met de glasplaat schuin en voorzichtig spoelen met 1x PBS om overmaat cellen in agarose te verwijderen. </li><li> Controleer cel inladen met een helder veld microscoop met een 4x objectief. Als er onvoldoende lading wordt waargenomen, herhaal vanaf stap 2.1. </li><li> Plaats geladen chip op een vlakke ondergrond (lab bench). Overlay chip met 1% laag smeltpunt (LMP) agarose die vooraf verwarmd bij 37 ° C. Gebruik ongeveer 2̵1, 3 ml LMP agarose is nodig voor elke chip. </li><li> Laat overlay eerste stollen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en vervolgens naar 4 ° C koelkast 5 minuten voor volledige gelering. </li></ol> 3 Doseren en Reparatie OPMERKING: Om de uitgangssituatie DNA-schade niveau studeren, ga dan naar stap 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lijn de putjes van de chip (gemaakt van eerdere klemming) met de putjes van een nieuwe bodemloze 96-well plaat. Re-press de bodemloze 96-well plaat aan de bovenkant en veilige klemming met bindmiddel clips. </li><li> Voeg 100 ul van chemische of de gewenste dosis aan elk putje van de plaat met 96 putjes; uitvoeren dosering / behandeling op ijs of 4 ° C koelkast gewenste tijdsduur. </li><li> Na het doseren, aspireren chemicaliën uit elk putje en spoel resterende chemische weg met 1x PBS. Als directe schade hier wordt bestudeerd, ga verder met stap 4. </li><li> Om herstelkinetiek bestuderen, zodat cellen in de chip te reparerenmedia bij 37 ° C. Lyse (ga verder met stap 4) op specifieke tijdstippen. OPMERKING: Repair kan worden uitgevoerd on-chip met een bodemloze 96-well plaat bevestigd, of de chip kan in afzonderlijke stukken knippen na verwijdering van de bodemloze 96-well plaat. </li></ol> 4 Lysis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Om alkaline comet assay uit te voeren: <ol><li> Voeg werken alkalische lysis buffer toevoegen van 1% Triton X-100 lysis voorraadoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10) alkalisch. Bereid ongeveer 25 ml lysis buffer werken voor elke chip. </li><li> Pre-chill werken alkalische lysis buffer bij 4 ° C. </li><li> Dompelen chip in koele werken alkalische lysis buffer en laat lysis tot O / N presteren in 4 ° C koelkast. </li></ol></li><li> Naar neutraal comet assay uit te voeren: <ol><li> Voeg werken neutraal lysis buffer door het toevoegen van 1% Triton X-100 en 10% DMSO tot neutrale lysis voorraadoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Bereid ongeveer 25 ml lysis buffer werken voor elke chip. </li><li> Voorverwarmen werkende neutraal lysis buffer bij 43 ° C. </li><li> Dompel chip in warme werkende neutrale lysis buffer en laat lysis O / N uitvoeren 43 ° C incubator. </li></ol></li></ol> 5 Elektroforese <ol style="margin-left: 40px;"><li> Om alkaline comet assay uit te voeren: <ol><li> Verwijder lysis buffer en snel spoel chip met 1x PBS. </li><li> Beveiligde chip in een elektroforese kamer met gelfilm zijde naar beneden met behulp van dubbelzijdige tape. </li><li> Breng de kamer tot een 4 ° C koude kamer. </li><li> Vul de kamer met koud alkalische elektroforese buffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na2 EDTA) tot een niveau dat net voldoende de gel. </li><li> Zorgen voor alkalische afwikkelen voor 40 min. </li><li> Run elektroforese op 1 V / cm en 300 mA gedurende 30 minuten in de koude kamer. Pas het volume van elektroforese buffer in de chaember gewenste bedrijfsstroom bereiken. </li></ol></li><li> Naar neutraal comet assay uit te voeren: <ol><li> Verwijder lysis buffer en spoel chip met neutrale elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boorzuur, pH 8,5) gedurende 2 x 15 min bij 4 ° C. </li><li> Beveiligde chip in een elektroforese kamer met gelfilm zijde naar beneden met behulp van dubbelzijdige tape. </li><li> Breng de kamer tot een 4 ° C koude kamer. </li><li> Vul de kamer met koud neutrale elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boorzuur, pH 8,5) tot een niveau dat net voldoende de gel. </li><li> Laat de gel te zitten in koude kamer gedurende 60 minuten. </li><li> Run elektroforese 0.6 V / cm en 6 mA gedurende 60 minuten in de koude kamer. Pas het volume van elektroforese buffer in de kamer om de gewenste stroomsterkte bereiken. </li></ol></li></ol> 6 Fluorescent Imaging <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder chip van elektroforese kamer van cold kamer. </li><li> Neutraliseer de gels neutralisatie buffer (0,4 M Tris, pH 7,5) gedurende 2 x 15 min bij 4 ° C koelkast. </li><li> Vlekken op de chip met fluorescerende DNA beits naar keuze (dat wil zeggen, SYBR Gold, ethidiumbromide) onder de fabriek aanbevolen procedures. Beeld met behulp van fluorescentie microscopie. </li></ol> 7 Data Analysis Analyseer komeet Afbeeldingen door standaard komeettest software zoals Komet 5.5.

<ol><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles%2C+Applications%2C+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li>
<li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li>
<li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+comet+assay%3A+use+and+status+in+genotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li>
<li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toxicity+assessment%3A+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III%3A+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+sciences+%3A+an+official+journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Møller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+%26+clinical+pharmacology+%26+toxicology%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).</li>
<li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA%3A+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li>
<li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG%E2%80%A0+inter-laboratory+validation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li>
<li>Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li>
<li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+research+in+toxicology%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li>
<li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+%28comet+assay%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).</li>
<li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li>
<li>Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li>
<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li>
<li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li>
<li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li>
</ol>

De CometChip is in licentie gegeven aan Trevigen, Inc. op basis van een octrooiaanvraag die Wood, Weingeist, Bhatia en Engelward omvat.

Ubiquitous genotoxinen in het milieu en ook op menselijke cellen uitoefenen onvermijdelijke stress en schade aan cellulaire DNA. In feite, het is geschat dat er 1.000 s van DNA-beschadigingen aanwezig in menselijke cellen bij steady state 18. Inzicht schade gevoeligheid en reparatie kinetiek bij de mens brengt niet alleen inzicht in fundamenteel onderzoek, maar profiteert ook de ontwikkeling van geneesmiddelen. Ironisch, ondanks het vermogen van DNA schade bevorderen kanker, DNA beschadigende agentia gebruikt worden bij zeer hoge niveaus aan kanker, waardoor kennis DNA schade en gepersonaliseerde geneeskunde relevant herstellen. De CometChip is een nieuwe onderzoek apparaat dat microfabrication praktijken gebruikt om een ​​reeds lang bestond DNA-schade assay revolutie. Voortbouwend op dezelfde principes van de traditionele komeet assay, de chip zorgt voor significant hogere doorvoer en een betere reproduceerbaarheid. We beschrijven hier werkwijzen voor het gebruik van deze chip. Om het nut en de robuustheid te verduidelijken, laten we de resultaten weerm verscheidene experimenten waarbij de chip is gebruikt om schade geïnduceerd door verschillende DNA-beschadigende agentia te beoordelen, en indien het is gebruikt voor DNA herstel te evalueren. Samen hier gepresenteerde resultaten bieden u nuttige informatie over het gebruik van de chip en tonen haar brede toepasbaarheid op het onderzoek naar DNA-schade en herstel. Een van de belangrijkste stappen in dit protocol is om effectieve cel laden volbrengen. Veel cellijnen werden getest op dit systeem, zowel suspensie en hechtende cellen. Laden met efficiëntie hangt af van vele variabelen zoals celtype, celgrootte, loading concentratie en tijd. Schorsing cellijnen zoals lymfoblastoïdcellen zijn het makkelijkst om mee te werken. Concentratie van de celsuspensie kan variëren van 10 april - 10 juni cellen per 96 putjes en laden voltooid gewoonlijk in 15-30 min. Hogere dichtheid cel vergemakkelijkt het laden en verkort de hoeveelheid tijd die nodig is voor de cellen om zich te vestigen in de microwells. Geladen parameters voor hechtende cellen kunnen van suspensiecellen. Cellijnen zoals Chinese Hamster Ovarium (CHO) cellen bleken dezelfde beladingsrendement als suspensie cellen (na behandeling met trypsine) hebben gewonnen en aldus soortgelijke belastingsomstandigheden. Andere celtypen zoals tumorcellen die gemakkelijk cel aggregaten in suspensie, vereisen extra behandeling. Passen celsuspensies via een enkele cel filter en het toevoegen van trypsine om de schorsing media kan de vorming van cel clusters te onderdrukken tijdens het laden. Tenslotte, wat betreft laadtijd, de tijd nodig voor het vastleggen hechtende cellijnen in microputjes kan variëren van 20 minuten tot 1 uur. Als gevolg hiervan, is het aanbevolen dat gebruikers proefprojecten uit te voeren om optimale belading voorwaarden bepalen alvorens tot verder onderzoek. Loading werkzaamheid onder een helderveld microscoop worden gevisualiseerd of nauwkeuriger geopenbaard door het kleuren van de ingekapselde cellen met DAPI of andere DNAvlekken voorafgaand aan de evaluatie onder de fluorescentiemicroscoop. Een groot voordeel van deze werkwijze en chip veelzijdigheid. Ten eerste zijn de onderzoekers niet beperkt tot een specifieke werkende cel concentratie omdat overtollige cellen worden weggespoeld, en de microarray zorgt voor een gelijkmatige komeet-dichtheid. Ten tweede kan de microputjes worden gemaakt met verschillende afmetingen aan celtypes van verschillende afmetingen op. Onder omstandigheden die meerdere cellen worden vastgelegd in een enkele microwell, multi-cell kometen zijn self-gekalibreerd en de opbrengst consistente resultaten in vergelijking met enkele cel kometen 6,7. Een ander voordeel van patroonvorming cellen in een microarray is dat alle kometen dan tevens focal plane met vaste posities, geluiddempende door ongericht kometen en geautomatiseerde beeldvorming en analyse te vergemakkelijken. De significante verbeteringen in de capaciteit en de gevoeligheid door de CometChip staat de toepassing van de test voor grootschalige studies. Tezamen verlenen de chipsa waardevol instrument voor DNA-schade-onderzoek voor onderzoekers, toxicologen, medici en epidemiologen. Terwijl de comet assay is bekend om zijn uitstekende gevoeligheid in het detecteren van een groot aantal DNA schade, deze bepaling ook last van lage specificiteit. Met dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid en de productie van de assay, maar niet aantonen vooruitgang in specificiteit. Niettemin multiplexen de test met andere methoden gerapporteerd efficiënt om hogere specificiteit zijn. Een voorbeeld is de opname van gezuiverde letselspecifieke enzymen. Deze enzymen kunnen anders niet op te sporen voet laesies omzetten in aantoonbare breuken en abasische locaties 1,19-21. Een veelgebruikt voorbeeld is de reparatie endonuclease formamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG), die oxidatieve DNA modificaties 19,22 onthult. Omdat het enzym digestie stap wordt aangebracht na cellysis, kan het systeem op dezelfde manier een behandeldsa traditionele agarose slide zonder aanpassingen aan het protocol. Hoewel de gedetailleerde protocol hier niet wordt beschreven, heeft deze aanpak is aangepast door vele traditionele comet assay gebruikers in het verleden en de protocollen kan gemakkelijk worden gevonden. In een eerdere publicatie we deze methode fluorescerende licht geïnduceerde schade 22 identificeren. Het grote voordeel van deze werkwijze is de omzet biedt, die toegang geeft tot studies die voorheen vrijwel onmogelijk waren. De mogelijkheid om 96 monsters worden verwerkt op hetzelfde platform vermindert niet alleen arbeid en tijd, maar vermindert ook experimentele geluiden en verbetert reproduceerbaarheid. Inter sample variatie is aanzienlijk lager dan de traditionele dia naar dia variant, die 2 maal hoger dan de variabilteit deze chip 6,7 zijn. Geruisloos leidt ook tot verbeterde gevoeligheid, waardoor detectie van subtiele verschillen tussen monsters. Omdat het apparaat maakt gebruik van een standard 96-well formaat, het is compatibel met de algemene onderzoeksapparatuur en HTS-technologieën. Beschouw een studie die evaluatie van 100 monsters vereist, ervan uitgaande dat een gemiddelde onderzoeker kan verwerken ~ 30 glaasjes in de loop van enkele dagen. Aangezien elk monster moet in drievoud worden uitgevoerd, zou het ongeveer een maand naar dergelijke studie, die ook onvermijdelijk zou lijden van monster tot monster variatie voltooien. Daarentegen verwerking 100 omstandigheden, elk in drievoud deze chip vereist slechts enkele borden en kan in drie dagen uitgevoerd. Deze belangrijke verbetering van de overslag opent de deur naar studies die voorheen onbereikbaar waren. De hier gepresenteerde protocol beschrijft zowel de basis-procedures voor het uitvoeren van de standaard comet assay en de gewijzigde stappen die nodig zijn om de CometChip platform te gebruiken. Met de mogelijkheid om zowel intrinsieke DNA schade niveaus en de daaropvolgende reparatie respons te bepalen, de assay is zeer relevant voorverschillende biologische en klinische toepassingen. Informatie over de gevolgen van specifieke chemische blootstellingen op het genoom faciliteert preventie van ziekte en behandeling. Verder is er ook significant belang dat er variaties in DNA schade gevoeligheid en herstelcapaciteit tussen individuen 23,24. Deze techniek levert de doorvoer die voor dergelijke grootschalige studies. Kennis over inter-individuele variaties is van cruciaal belang voor het identificeren van gevoelige mensen en voor het ontwerpen van geïndividualiseerde therapieën of ziektes te voorkomen strategieën. Samengevat, de hier gepresenteerde technologie een hoge doorvoer, objectieve kwantitatieve DNA schade analyse platform dat de potentie om een ​​standaardmethode nabije toekomst is.

De eencellige gelelektroforese (SCGE) assay (aka de komeet assay) is een veel gebruikte techniek voor de kwantificering van een breed spectrum van DNA laesies, waaronder base laesies, abasische locaties, enkele breuken, dubbele breuken, crosslinks en alkali gevoelige sites. Het onderliggende principe van de test is dat beschadigd DNA migreert sneller dan onbeschadigd DNA als gevolg van fragmentatie en verlies van superhelische structuur. De mate van migratie is evenredig met de hoeveelheid DNA schade en kan worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Beeld-opnemen en intensiteitprofiel analyse van individuele comet-vormige DNA leveren dan parameter metingen zoals staartlengte, staartmoment en% DNA in de staart naar het niveau van DNA schade in een cel 1-4 onthullen. Momenteel zijn er twee veelgebruikte versies van de komeet assay: a) alkaline comet assay en b) neutraal comet assay. De alkaline comet assay is de meestgebruikte versie met een hoge pH buffer gebruikt om DNA ontspannen voor elektroforese en dus detecteert alle soorten breuken en alkali-gevoelige plaatsen. De neutrale comet assay, daarentegen, is onervaren omdat het een neutrale buffer om een dubbele helices behouden en alleen detecteren dubbelstrengsbreuken 2,5. Voor chemische en fysische agentia die DSB&#39;s veroorzaken, worden SSBS gemaakt in onderling overleg, en worden gevormd op een veel hoger niveau (bijvoorbeeld γIR-geïnduceerde SSBS zijn een orde van grootte meer gemeen dan DSB&#39;s). Voor de meeste DNA-beschadigende blootstellingen, DSB&#39;s zijn veel minder vaak voor dan andere klassen van DNA-schade, en zijn daardoor moeilijker te ontdekken. We hebben de detectie raam van beide versies aangetoond in eerdere publicaties. 6,7 Hoewel de komeet assay is routinematig gebruikt voor fundamenteel onderzoek op DNA-schade en herstel en genotoxiciteitsonderzoeken 1,2,8-15, is de test gemeld een slechte reproduceerbaarheid te wijten aan sample-to-monster persoon tot persoon lab tot lab variabiliteit. Bovendien is de test lage doorvoer, mede omdat beeldacquisitie en gegevensanalyse omslachtig. Samen vormen deze beperkingen bijdragen aan de relatief lage aanvaarding grootschalige studies. Door de integratie van techniek technologieën en principes, de CometChip brengt een oplossing voor de problemen van de doorvoer en inconsistenties die worden geassocieerd met de traditionele komeettest 6,7. In het kort, de chip maakt, wordt een mal microfabricated met fotolithografie om micropalen met een diameter zo klein als die van een enkele cel te creëren. De mal wordt vervolgens gebruikt om het stempel op gesmolten agarose, resulterend in een array van microputjes na de gel stolt. Chips worden ontwikkeld om onderzoekers met variabele afmetingen putten te verstrekken aan compatibel met verschillende celtypen. Om de chip te laden, worden de cellen in de media mogen vestigen in de putten door de zwaartekracht; overtollige cellen worden weggespoeld. Gevangen cellen worden ons dan ingekapselding een dunne laag smeltpunt agarose, en een bodemloze 96 putjes plaat wordt vervolgens geklemd aan het gel oppervlak 96 macrowells maken met ieder honderden microputjes op het bodemoppervlak. Dit protocol beschrijft de algemene procedures voor experimenten met deze chip, die gelbereiding, celbelasting, dosering en reparatie, cellysis, elektroforese en fluorescentie beeldvorming omvatten. We tonen twee voorbeelden van dosis respons experimenten met lymfoblast cellen blootgesteld bekende DNA beschadigende agentia, met alkalische en neutrale versies van de test respectievelijk. Twee reparatie experimenten worden ook getoond te beschrijven hoe reparatie respons na belichting kan worden geëvalueerd met behulp van het systeem.

<table><tbody><tr><td>UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>Kristalline NaCl</td><td>Macron Chemicals</td><td>7581-06</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>Kristalline Na2EDTA</td><td>Macron Chemicals</td><td>4931-04</td><td>Meerdere leveranciers, Irritante stof</td></tr><tr><td>Kristalline Tris (base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Meerdere leveranciers, Irritante stof</td></tr><tr><td>Kristalline Tris (zuur)</td><td>J.T.Baker</td><td>4106</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>Kristalline N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td>Meerdere leveranciers, Zeer giftig bij inademing, Irritante stof</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Meerdere leveranciers, Schadelijk bij inslikking, Irritante stof</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Meerdere leveranciers, Ontvlambare vloeistof, Effect op specifiek orgaan</td></tr><tr><td>Kristalline NaOH</td><td>Macron Chemicals</td><td>7708-06</td><td>Meerdere leveranciers, Corrosieve stof</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>VWR</td><td>BDH3871</td><td>Meerdere leveranciers, Corrosieve stof</td></tr><tr><td>Kristalline boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>Meerdere leveranciers, Effect op specifiek orgaan, Teratogeen, Reproductief gevaar</td></tr><tr><td>CometChip</td><td>Trevigen</td><td></td><td>In ontwikkeling voor distributie, neem direct contact op met Trevigen om de benodigde materialen te verkrijgen</td></tr><tr><td>1-wells schaal</td><td>Thomas Scientific</td><td>73521-420</td><td></td></tr><tr><td>96-wells plaat zonder bodem</td><td>VWR</td><td>655000-06</td><td></td></tr><tr><td>1,5' bindclips</td><td>Staples</td><td></td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>Glazen plaat</td><td>Tag Hardware</td><td></td><td>Aangepast op de grootte van een 96-wells plaat</td></tr><tr><td>Owl Horizontal Electrophoresis System</td><td>VWR</td><td>27372-131</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Meerdere leveranciers</td></tr></tbody></table>

cometchip: een high-throughput 96-well platform voor het meten van dna-schade in microarrayed menselijke cellen

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA-schadigende agentia kunnen veroudering, ziekte en kanker bevorderen en ze zijn alomtegenwoordig in het milieu en worden geproduceerd binnen menselijke cellen als normale cellulaire metabolieten. Ironisch genoeg worden DNA-schadigende agentia in hoge doses ook gebruikt om kanker te behandelen. Het vermogen om DNA-schadereacties te kwantificeren is dus van cruciaal belang in de volksgezondheid, farmaceutische en klinische domeinen. Hier beschrijven we een nieuw platform dat microfabricagetechnieken gebruikt om cellen in een vaste microarray te patrouilleren. De ‘CometChip’ is gebaseerd op de goed gevestigde single cell gel elektroforese assay (a.k.a. de komeet assay), die het niveau van DNA-schade schat door de mate van DNA-migratie door een matrix in een elektrisch veld te evalueren. Het type schade dat door deze assay wordt gemeten, omvat abasic sites, crosslinks en strengbreuken. In plaats van willekeurig verspreid te worden in agarose in de traditionele assay, worden cellen gevangen in een agarose microwell array door zwaartekracht. Het platform breidt ook uit van de grootte van een standaard microscoopglaasje naar een 96-well formaat, waardoor parallelle verwerking mogelijk is. Hier beschrijven we de protocollen voor het gebruik van de chip om DNA-schade veroorzaakt door bekende genotoxische agentia te evalueren en de cellulaire reparatiereactie die volgt na blootstelling. Door de integratie van biologische en technische principes, potentieert deze methode robuuste en gevoelige metingen van DNA-schade in menselijke cellen en biedt de noodzakelijke doorvoer voor genotoxiciteitstesten, geneesmiddelontwikkeling, epidemiologische studies en klinische assays.

In dit eerste voorbeeld beschrijven we de aanpak voor het kwantificeren beginsituatie van DNA schade in humane lymfoblastoïde cellen na blootstelling aan oxidatieve schade met H 2 O 2. Om H 2 O 2 geïnduceerde basis letsels en enkele breuken te evalueren, worden alkaline comet voorwaarden gebruikt. Nadat het laden is voltooid en cellen zijn ingekapseld met agarose overlay wordt een bodemloze 96-well plaat geperst op het oppervlak met 96 compartimenten op de chip te maken. Elk van de 96-wells gedoseerd worden met een ander type of concentratie van chemicaliën. Hier vier verschillende doses H 2 O 2 werden gebruikt en 1x PBS werd gebruikt als negatieve controle. Representatieve beelden van array kometen getoond in Figuur 1A, wanneer onbehandeld (boven), 50 uM (midden) en 100 uM (onderste) H 2 O 2 -exposed monsters toonden verschillende komeetstaarten. Analyse van de komeet beelden kunnen worden performed behulp van commercieel verkrijgbare software, die in het algemeen gekwantificeerd schade aan op basis van de totale fluorescentie intensiteit en migratie afstand van elke komeetstaartkanon. De metingen worden meestal uitgevoerd op 50 tot 100 kometen per staat en de mediane waarde (ofwel% staart DNA of staartlengte) wordt berekend. Figuur 1B toont het percentage staart DNA-respons curve van de TK6 lymfoblastcellijn kometen blootgesteld aan vier verschillende concentraties van H geanalyseerd 2 O 2. De samenhang tussen onafhankelijke experimenten toont de effectiviteit van deze benadering bij de beoordeling DNA schade respons van verschillende niveaus van chemische behandelingen in cellen. Om te leren over variatie tussen de monsters (bijvoorbeeld onder macrowells) en tussen herhalingen van hetzelfde experiment werd inter-sample en inter-experimentele variabiliteit in figuur 2A en 2B respectievelijk uitgezet. In elk experiment elk putje van de 96-well chip is gelijk aan een ander monster en dus de variatie well-to-well onthult de inter-sample variatie van de inrichting. Hier TK6 cellen in 12 putjes van de 96-well chip geladen werden met dezelfde dosis H 2 O 2 en onmiddellijk gelyseerd na de behandeling. Alle andere experimentele stappen werden parallel uitgevoerd en de medianen van ten minste 50 kometen van elk macrowell zijn in figuur 2A uitgezet. Het gemiddelde van de medianen is 77.53% DNA in de staart, met een standaarddeviatie is 3,99%. Uit deze gegevens berekenen we de variatiecoëfficiënt tussen monsters 5,2%, die verscheidene malen hoger dan de traditionele test tonen de verbeterde robuustheid van deze assay 6,16. Voor informatie over de reproduceerbaarheid van de test, we blootgesteld TK6 cellen in een chip met 75 uM H 2 O 2 en de onmiddellijke niveau van DNA te beschadigen. Dit experiment werd zesmaal herhaald en gegevens van elk experiment werd in F uitgezetigure 2B. Onder dezelfde experimentele omstandigheden wij gevonden variërend van 41.76% 57.87% verkregen, getoond als grijze balken in de figuur. Het gemiddelde van zes herhalingen is 49.57%, met standaardfout van het gemiddelde van slechts 2,04%. De lage variatie onder repeats impliceert dat de comet assay uitgevoerd op dit nieuwe toestel is zeer reproduceerbaar. Tot reparatie kinetiek evalueren, worden de cellen toegestaan ​​om hun DNA te repareren in vers medium na de behandeling. Lyseren macrowells op verschillende tijdstippen toont de verandering in DNA-schade in de tijd. Een voorbeeld is getoond in figuur 3. In dit experiment werden TK6 cellen eerst ingekapseld in de chip, behandeld met 50 uM H 2 O 2 en toegestaan ​​te herstellen tot 60 min na blootstelling. Cellen werden gelyseerd op 0, 20, 45 en 60 minuten respectievelijk. Representatieve comet beelden op verschillende tijdstippen weergegeven in figuur 3A, en de verandering in DNA schade niveaus tijd wordt uitgezet in figuur3B. Hieruit bleek dat bijna alle van de schade is hersteld binnen 45 min na H 2 O 2 behandeling. Veel variabelen invloed hebben op de snelheid van herstel, zoals het type cellijn en chemische agentia worden gebruikt. Vandaar dat onderzoekers kunnen veranderingen aan het protocol (dat wil zeggen, de uitbreiding van reparatietijd) om extra behoeften in hun onderzoek tegemoet. Hier bieden we een ander voorbeeld van de reparatie experiment met behulp van deze chip, waarin TK6 cellen worden uitgedaagd met een andere genotoxische stof N-methyl-N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) is een alkylerende stof waarvan bekend is dat base letsels waaronder 7-methylguanine induceren en 3-methyladenine. Deze letsels worden omgezet naar sites hetzij door spontane depurinatie of door enzymatische verwijdering door DNA glycosylases abasische. De verkregen basische plaats kan onder alkalische omstandigheden worden gesplitst en derhalve gedetecteerd op de chip. Eerste blootstelling veroorzaakt een aanzienlijke toename van de schade, blijkt uit de langestaarten, en na verloop van tijd deze staarten worden verminderd als de cellen te herstellen intact DNA tijdens de reparatie. Hoewel alkylering en oxidatieve schade zijn beide voornamelijk gerepareerd door de base excisie reparatie route, het aantal letsels gegenereerd en die betrokken zijn bij reparatie-eiwitten variëren. Deze variaties kunnen leiden tot verschillende tarieven van de conversie naar sites, evenals verschillende tarieven van de reparatie van de resulterende abasische locaties abasische. In figuur 4, herstelkinetiek van TK6 cellen blootgesteld aan 0,1, 1, en ​​3 ug / ml MNNG getoond. In dit experiment, we uitgebreid de experimenteertijd tot 2 uur na blootstelling omdat MNNG-geïnduceerde schade langer blijkt te bestaan ​​en verwijdering trager in vergelijking met H 2 O 2 geïnduceerde schade. Analyse van de DSB&#39;s met neutrale condities is zeer vergelijkbaar met het protocol voor de analyse van enkelstrengs laesies met behulp van de alkalische omstandigheden. Om aanvankelijke schade niveaus tonen, werden TK6 cellen blootgesteld aan variabele niveaus van Gir,<html> en de resulterende cellen werden gelyseerd en geëlektroforeerd bij een neutrale pH (Figuur 5A). Het is opmerkelijk dat de morfologie van de komeetstaarten verschilt van de alkalische testomstandigheden. Om waarneembare gefragmenteerd DNA behalen met deze assay, de IR gebruikte dosis significant hoger (0-100 Gy) dan de dosis vereist om schade zien met de alkalische omstandigheden. Bovendien vonden we dat de staartlengte is de meest gevoelige parameter die de mate van DNA-beschadiging bij gebruik van de neutrale comet assay 7. De geanalyseerde dosis-responscurve wordt getoond in figuur 5B. Reparatie van de dubbele DNA breuken in cellen kunnen ook worden beoordeeld, en is aangetoond door Weingeist et. al. 7. Samen genomen, de neutrale CometChip biedt een waardevol instrument voor hoge doorvoer analyse van DNA-DSB&#39;s. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 1. H 2 O 2 dosisrespons van TK6 cellen middels alkaline comet assay. (A) groepsaccommodatie microwell kometen van onbehandelde TK6 lymfoblasten (boven) en TK6 cellen blootgesteld aan 50 uM (midden) en 100 uM (onderste) H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Schaalbalk is 100 urn. (B) H 2 O 2 dosisrespons van TK6 cellen blootgesteld aan verschillende niveaus van H 2 O 2. Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, waarbij het mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen in elk experiment. Error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2. Inter-Steekproef en Inter-experimentele variabiliteit. (A) Sample-to-Sample variatie. TK6 humane lymfoblast cellen werden in 12 putjes van de 96-well chip geladen. Elk putje werd blootgesteld aan 100 pl 50 pM H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Cell werden direct gelyseerd en onderzocht% Staart DNA. Gegevens van elk putje wordt hier getoond. Elke rechthoek is de mediaan van ten minste 50 afzonderlijke kometen uit elk putje. Het gemiddelde van 12 putjes is 77,53%, standaarddeviatie is 3,99% en de variatiecoëfficiënt wordt berekend 5,2% te zijn. (B) Experiment-to-Experiment variatie. TK6 humane lymfoblast cellen werden in 96-well chip geladen blootgesteld aan 100 ul 75 uM H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Cell werden direct gelyseerd en onderzocht% Staart DNA.Hetzelfde experiment werd 6 keer herhaald en de gegevens van elke herhaling wordt weergegeven als een grijze balk. Elke rechthoek is de mediaan% staart DNA van ten minste 100 afzonderlijke kometen uit elke herhaling. Het gemiddelde van 6 herhalingen is 49.57%, getoond als de achterkant bar hier. De standaardafwijking van 6 herhalingen is 4,99%, en de standaardfout van het gemiddelde wordt berekend 2,04% te zijn, weergegeven als de fout bar in de figuur. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3. Reparatie van H 2 O 2 geïnduceerde schade in TK6 lymfoblasten. (A) Schematische voorstelling van reparatie onderzoek met representatieve kometen. TK6 cellen worden behandeld met beschadigende agentia en liet repareren media bij 37 ° C vóór lyse. (B) Reparatie kinetiek van TK6 cellen na behandeling met 50 uM H 2 O 2 gedurende 20 minuten bij 4 &amp; #176, C. Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, waarbij het mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen in elk experiment. Error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde van een herhaling van experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4. Reparatie MNNG veroorzaakte schade TK6 lymfoblasten. TK6 cellen behandeld met 0,1, 1, en ​​3 ug / ml MNNG gedurende 30 min bij 4 ° C en men liet herstellen in media bij 37 ° C tot 120 min na blootstelling. De mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen voor elk van drie onafhankelijke experimenten. Error bars geven de standaardfoutvan het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Figuur 5. IR dosisrespons van TK6 cellen met neutrale comet assay. (A) groepsaccommodatie microwell kometen van onbehandelde TK6 lymfoblasten (boven) en TK6 cellen blootgesteld aan 40 Gy (midden) en 80 Gy (onderste) gammastraling. Schaalbalk is 100 urn. (B) IR dosisrespons van TK6 cellen blootgesteld aan verschillende niveaus van gamma bestraling. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de mediaan staartlengte (micrometer) van ten minste 300 kometen gepoolde van zes macrowells op de chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Het algemene doel van deze procedure is om te demonstreren hoe de COMET-chip kan worden gebruikt voor het uitvoeren van high-throughput metingen van DNA-schade in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen in de COMET-chip te laden. De tweede stap is het behandelen van de cellen met chemicaliën waarvan bekend is dat ze DNA-schade veroorzaken.Vervolgens worden de cellen gelyseerd en geëlektroforeseerd met behulp van traditionele COMET-assayprotocollen. De laatste stap is fluorescentie-imaging van het cellulair DNA om de migratie van beschadigd DNA te visualiseren. Ten slotte wordt software voor beeldanalyse gebruikt om de mate van DNA-schade te kwantificeren.De comet-assay bestaat al zeer lang en is een zeer nuttige methode om naar veel verschillende soorten DNA-schade te kijken. Het probleem was echter dat de doorvoer erg laag is en de gevoeligheid ontbreekt. Daarom hebben we de COMET-chip ontwikkeld, wat in feite een versie van de comet-assay is met een zeer hoge doorvoer, waardoor high-throughput screening mogelijk wordt voor bijvoorbeeld het screenen van geneesmiddelen en voor epidemiologische studies.Jing GA, een promovendus in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. De coma-chip is een gel met een array van microwells, vervaardigd met een gemicrofabriceerde stempel met microposten met diameters die zo klein zijn als die van een enkele cel; plaats deze als eerste met de gelbond-zijde naar beneden in een rechthoekige plaat met één well. Na het tweemaal wassen van de gel in 25 milliliters 1x PBS, plaatst u de coma-chip op een glasplaat en labelt u vervolgens de oriëntatie van de gel dienovereenkomstig.Druk nu voorzichtig een omgekeerde bodemloze 96-wellplaat in de gel, waarbij u erop let dat alle 96 wells zich binnen het geloppervlak bevinden. Klem vervolgens beide zijden van de 96-wellplaat met 1,5 inch binderclips aan de glasplaat. Aspireer tot slot alle overtollige PBS uit elke well.Oogst suspensiecellen of adherente cellen volgens standaardprocedures en verdun de cellen met medium tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 tot 1 miljoen cellen per milliliter. Zorg ervoor dat een enkelcellesuspensie wordt verkregen door, indien nodig, de cellen door een celfilter te halen. Pipetteer 100 microliters van de celsuspensie in elke put van de Comet Chip 96-well plaat zodra deze gereed is.Bedek de plaat met de gel-bondfilm om verdamping te voorkomen en plaats deze vervolgens gedurende 30 minuten in een incubator die is ingesteld op 37 °C nadat de plaat uit de incubator is gehaald. Wanneer de 30 minuten zijn verstreken, aspireer dan het medium uit elke put en verwijder vervolgens de klemmen en de bodemloze 96-wellplaat. Houd de comet-chip met de glasplaat onder een hoek en spoel deze voorzichtig met 1x PBS om eventuele overtollige cellen bovenop de agar te verwijderen. Bekijk de plaat nu via een 4x objectieflens op een lichtveldmicroscoop om de optimale celbelading te controleren. Nadat er voldoende cellen zijn geladen, wordt een comet-chip op een vlak oppervlak geplaatst en bedekt met een overlay van 1% laagsmeltende agar die is voorverwarmd tot 37 °C.Laat de overlay drie minuten lang stollen bij kamertemperatuur en plaats deze vervolgens vijf minuten lang bij 4 °C voor volledige fixatie voordat de cellen met de gewenste chemicaliën worden behandeld. Lijn eerst de wells van de comet-chip zorgvuldig uit met de wells van een nieuwe bodemloze 96-wells plaat en druk deze aan. Bevestig de 96-wells plaat zoals voorheen met klemmen aan de glasplaat.Plaats de plaat vervolgens op ijs en voeg aan elke put 100 µL van de gewenste chemische stof toe in de beoogde dosis. Laat de te onderzoeken chemische stof gedurende de gewenste periode na dosering op de cellen inwerken, aspireer de chemische oplossing uit elke put en spoel indien nodig met één keer XPBS. Snijd de gel in afzonderlijke stukken. Voeg vervolgens, om de reparatiekinetiek te bestuderen, kweekmedium toe aan de putten, incubeer deze en ga over tot cellysis op specifieke tijdstippen om de cellen te lyseren voor de alkalische komeetassay.Bereid ongeveer 25 milliliter werkingsalkalische lysisbuffer voor per chip door 1% Triton X 100 toe te voegen aan de alkalische lysis-stockoplossing. Laat dit vervolgens voorkoelen op vier graden Celsius. Giet de alkalische lysisbuffer over in een bakje dat net iets groter is dan de comet-chip.Dompel de alkalische chip vervolgens onder in de gekoelde werkende alkalische lysisbuffer, plaats deze in de koelkast en laat de lysis gedurende de nacht doorgaan bij 4 °C. Verwijder de volgende dag de comet-chip uit de lysisbuffer en spoel deze snel af met 1 XPBS. Plaats de chip vervolgens in een elektroforesekamer met de gelzijde naar beneden en bevestig deze met dubbelzijdige tape.Breng de kamer naar de koelruimte van 4 °C en vul de kamer met koud alkalisch elektroforesebuffer tot een niveau dat de gel net bedekt. Laat de chip vervolgens 40 minuten bij 4 °C staan om alkalische ontwinding mogelijk te maken. Run de gel tot slot gedurende 30 minuten bij 1 V/cm en 300 mA.Pas in de koelruimte het volume van de elektroforesebuffer in de kamer aan om de gewenste loopstroom te bereiken. Maak voor de neutrale comet-assay een werkzame neutrale lysisbuffer door 1% Triton X 100 en 10% DMSO toe te voegen aan de neutrale lysis-stockoplossing. Bereid opnieuw ongeveer 25 milliliter werkzame lysisbuffer voor elke chip.Plaats de werkende neutrale lysisbuffer in de incubator die is ingesteld op 43 graden Celsius om voor te verwarmen. Nadat de neutrale lysisbuffer is opgewarmd, wordt de comma chip ondergedompeld in de neutrale lysisbuffer en gedurende de nacht geplaatst in een incubator van 40 graden Celsius. Verwijder de volgende dag de neutrale lysisbuffer en spoel vervolgens twee keer met neutrale elektroforesebuffer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Bevestig de chip telkens in de elektroforesekamer en breng deze over naar de koelruimte.Vul de elektroforesekamer opnieuw met koude neutrale elektroforesebuffer tot een niveau dat de gel net bedekt en laat de gel 60 minuten rusten in een koelruimte; voer de elektroforese uit bij 0,6 volt per centimeter en zes milliampère gedurende 60 minuten in de koelruimte. Pas indien nodig opnieuw het volume van de elektroforesebuffer in de kamer aan om de gewenste loopstroom te bereiken. Neutraliseer de gels na het uitnemen van de com-chip uit de koelruimte door deze twee keer gedurende 15 minuten te wassen met neutralisatiebuffer bij vier graden Celsius.Kleur de chip met een fluorescente DNA-kleuring zoals cyberg gold of iridiumbromide. Volgens de instructies van de fabrikant en vastgelegd met fluorescentiemicroscopie, worden in het bovenste paneel van dit diagram representatieve microwell-cometen van onbehandelde TK six lymfoblasten getoond. In het middelste paneel zijn die van TK six cellen getoond die zijn blootgesteld aan 50 micromolar waterstofperoxide, en in het onderste paneel die van cellen blootgesteld aan 100 micromolar waterstofperoxide.Alle blootstellingen duurden 20 minuten bij vier graden Celsius. Deze lijngrafiek toont de dosisrespons van TK6-cellen op waterstofperoxide. Elk datapunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, waarbij in elk experiment het mediane percentage tail-DNA van ten minste 50 individuele kometen werd bepaald.Deze grafiek toont de variatie tussen monsters van de comma chip-assay voor TK6-cellen die zijn blootgesteld aan waterstofperoxide; de data van het percentage tail DNA per well wordt hier weergegeven. Elke box representeert de mediaan van ten minste 50 individuele kometen per well. Het gemiddelde van 12 wells is 77,53%, de standaarddeviatie is 3,99% en de variatiecoëfficiënt is 5,2%. Deze grafiek toont de variatie tussen experimenten.Dezelfde blootstelling aan waterstofperoxide werd zes keer herhaald, en de gegevens van elke herhaling worden weergegeven als een grijze balk. Elke box vertegenwoordigt het mediane percentage staart-DNA van ten minste 100 individuele cometten per herhaling. Het gemiddelde van zes herhalingen is 49,57%, weergegeven als de zwarte balk.De standaarddeviatie van zes herhalingen is 4,99% en de foutenbalk van het gemiddelde is 2,04%, weergegeven als de foutenbalk in de figuur, zoals bij de traditionele gangbare assay. Onderzoekers zijn vrij om aanpassingen aan deze procedure aan te brengen of andere methoden te gebruiken, zoals het toevoegen van gezuiverde laesiespecifieke enzymen om aanvullende vragen te beantwoorden over het type DNA-schade dat in cellen wordt geproduceerd. De comet chip-techniek heeft de weg vrijgemaakt voor studies naar zoogdiercellen om meer te leren over DNA-schade en -herstel.En omdat het een hoge doorvoersnelheid heeft, maakt het klinische en epidemiologische studies mogelijk die voorheen ondoenlijk waren vanwege het aantal monsters.

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We demonstreren het gebruik van DNA-microarrays voor expressie profilering van het zenuwstelsel. We beschrijven RNA kwaliteitscontrole, monster etikettering, en array-hybridisatie en scannen.

DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen

In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

We presenteren een snelle en efficiënte methode om veel voorkomende fragiele breuken te detecteren door middel van natieve γH2A.X chromatine immunoprecipitatie (ChIP). Deze aanpak vermindert aanzienlijk zowel de tijd als de arbeid die gepaard gaan met traditionele γH2A.X ChIP-assays, terwijl de hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten behouden blijven.

Het vastleggen van veelvoorkomende fragiele site-onderbrekingen door native γH2A. X Kanaal

Leer hoe je DNA-schade meet in zoogdiercellen met de CometChip, een high-throughput 96-well platform. Deze methode verbetert doorvoer en gevoeligheid voor grootschalig onderzoek naar DNA-herstel.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Meer video's verkennen