CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Het algemene doel van deze procedure is om te demonstreren hoe de COMET chip kan worden gebruikt om met hoge doorvoer DNA-schademetingen in zoogdiercellen uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen in de COMET chip te laden. De tweede stap is om cellen te behandelen met chemicaliën die bekend zijn om DNA-schade te veroorzaken.

Vervolgens worden de cellen gelyseerd en Electro East volgens traditionele COMET-assayprotocollen. De laatste stap is fluoresceine beeldvorming van cellulair DNA om de migratie van beschadigd DNA te visualiseren. Uiteindelijk wordt beeldanalysesoftware gebruikt om de mate van DNA-schade te kwantificeren.

Dus de com-test is al heel lang beschikbaar en het is een zeer nuttige test om naar veel verschillende soorten DNA-schade te kijken. Maar het probleem is dat het echt een lage doorvoer heeft en het mist gevoeligheid. Dus we hebben de COMET chip gemaakt, die eigenlijk een zeer hoge doorvoerversie van de COMET-test is die het mogelijk maakt om hoge doorvoer screening voor geneesmiddelenscreening, bijvoorbeeld, en voor epidemiologische studies uit te voeren.

Jing, een afstudeerstudent in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. De coma chip is een gel met een reeks microputjes geproduceerd uit een microfabricated stempel met micro posten met diameters die zo klein zijn als die van een enkele cel om in een rechthoekige plaat met één put gelbond film naar beneden te plaatsen. Na het wassen van de gel twee keer in 25 milliliter in één XPBS, zet de komma chip op een glazen plaat en label vervolgens de oriëntatie van de gel dienovereenkomstig.

Druk nu voorzichtig een omgekeerde bodemloze 96-well plaat in de gel en zorg ervoor dat alle 96 putjes zich binnen het gebied van de gel bevinden. Knip vervolgens aan beide zijden van de 96-well plaat met 1,5 inch binder clips aan de glazen plaat. Zuig ten slotte eventueel overtollig PBS van elk weg.

Haal de suspensie of hechtende cellen volgens standaardprocedures en verdun de cellen met media tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 tot 1 miljoen cellen per milliliter. Zorg ervoor dat een enkele celsuspensie wordt verkregen door deze indien nodig door een celfilter te halen. Pipetteer 100 microliter celsuspensie in elke put, de comet chip 96-well plaat wanneer u klaar bent.

Bedek de plaat met de gelbond film om verdamping te voorkomen en plaats deze vervolgens in een incubator ingesteld op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten na het verwijderen van de plaat uit de incubator. Wanneer de 30 minuten zijn verstreken, zuig het media uit elke put weg, verwijder vervolgens de binder clips en de bodemloze 96 Well plaat. Houd de comet chip met de glazen plaat schuin en spoel voorzichtig af met één XPBS om eventuele overtollige cellen bovenop de aros te verwijderen. Bekijk nu de plaat door een viervoudige objectieflens op een lichtveldmicroscoop om te controleren op optimale celbelasting. Nadat voldoende cellen zijn geladen, plaatst u een com chip op een gelijkmatige ondergrond, een overlay met 1% low melting point agros dat is voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Laat de overlay drie minuten bij kamertemperatuur stollen en plaats hem vervolgens vijf minuten op vier graden Celsius voor volledige dation om de cellen te doseren met chemicaliën van belang. Richt eerst voorzichtig de putjes van de comet chip uit op de putjes van een nieuwe bodemloze 96-well plaat en druk ze naar beneden. Bevestig de 96-well plaat aan de glazen plaat met binder clips zoals eerder.

Plaats vervolgens de plaat op ijs en voeg 100 microliter van de chemicaliën van belang toe bij de gewenste dosis aan elke put. Laat de onderzochte chemische stof de gewenste periode op de cellen blijven na dosering, zuig de chemische oplossing uit elke put en spoel indien nodig met één XPBS. Snijd de gel in afzonderlijke stukken. Om vervolgens reparatiekinetiek te bestuderen, voegt u kweekmedia toe aan de putjes, incubeer en ga door met cellyse op specifieke tijdstippen om cellen te LY voor de alkalische comet-test.

Bereid ongeveer 25 milliliter werkzame alkalische lysebuffer voor elke chip door 1% Triton X 100 toe te voegen aan de alkalische lyse-stockoplossing. Koel vervolgens voor op vier graden Celsius. Giet de alkalische lysebuffer in een container die iets groter is dan de comet chip.

Dompel vervolgens de alkalische chip onder in de gekoelde werkzame alkalische lysebuffer, plaats in de koelkast en laat de lyse overnacht bij vier graden Celsius verlopen. Verwijder de volgende dag de comet chip uit de lysebuffer en spoel snel af met één XPBS. Plaats vervolgens de chip in een elektroforesekamer met de gelfilmzijde naar beneden en bevestig deze met dubbelzijdig plakband.

Neem de kamer mee naar de koude kamer van vier graden Celsius en vul de kamer met koud alkalisch elektroforesebuffer tot een niveau dat net de gel bedekt. Laat vervolgens de chip gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius staan om alkalische ontwinding mogelijk te maken. Ten slotte draait u de gel gedurende 30 minuten bij één volt per centimeter en 300 milliampère.

In de koude kamer, pas het volume van de elektroforesebuffer in de kamer aan om de gewenste stroomsnelheid te bereiken. Voor de neutrale comet-test, maak werkzame neutrale lysebuffer door 1%Triton X 110%DMSO toe te voegen aan de neutrale lyse-stockoplossing. Bereid weer ongeveer 25 milliliter werkzame lysebuffer voor voor elke chip.

Plaats de werkzame neutrale lysebuffer in de incubator ingesteld op 43 graden Celsius om voor te warmen. Nadat de neutrale lysebuffer is opgewarmd, dompel de komma chip onder in de neutrale lysebuffer en plaats deze in een 40 graden Celsius incubator overnacht. De volgende dag verwijdert u de neutrale lysebuffer en spoelt u vervolgens twee keer met neutraal elektroforesebuffer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Stel de chip elke keer vast in de elektroforesekamer en breng hem over naar de koude kamer.

Zoals eerder, vul de elektroforesekamer met koud neutraal elektroforesebuffer tot een niveau dat net de gel bedekt en laat de gel 60 minuten in een koude kamer zitten, draai de gel bij 0,6 volt per centimeter en zes milliampère gedurende 60