Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Het algemene doel van het volgende experiment is het produceren van pH-responsieve nanosensoren en zelfrapporterende steigers die in realtime en in situ kunnen worden gemonitord om te helpen bij het begrijpen van omstandigheden die de cellulaire groei beïnvloeden. Dit wordt bereikt door eerst biocompatibele, analC-responsieve nanosensoren voor te bereiden, die de pH kunnen monitoren via fluorescentie-outputs. Als tweede stap worden de pH-responsieve nanosensoren geïntegreerd in polymere, elektrogesponnen steigers, waardoor een 3D-omgeving ontstaat waarop cellen kunnen worden gekweekt en gemonitord.

Vervolgens worden zoogdiercellen geplaatst op de elektrogesponnen scaffolds en worden nanosensoren eveneens afgeleverd in hun intracellulaire omgeving om de intracellulaire pH te bewaken. Tijdens de experimenten worden resultaten behaald die aantonen dat intracellulaire nanosensoren en zelfrapporterende scaffolds in staat zijn de pH binnen weefseltechnische omgevingen te bewaken, op basis van fluorescentieratio's verkregen via confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van elektronische pH-sondes, is dat metingen in situ en in real-time kunnen worden uitgevoerd zonder de celgroei te verstoren.

Begin met het prepareren van de fluoroforen door 1,5 mg fam SE op te lossen in 1 ml dimethylformamide (DMF) in een rondbodemkolf. Los daarnaast 1,5 mg Tamara SE op in 1 ml DMF in een tweede kolf. Voeg vervolgens 1,5 ml 3-aminopropyltriethoxysilaan toe aan elke kolf en roer continu in het donker onder een droge stikstofatmosfeer bij 21 °C gedurende 24 uur.

Voeg vervolgens 250 µL van beide kleurstofoplossingen toe aan een mengsel van zes milliliter ethanol en vier milliliter ammoniumhydroxide in een rondbodemkolf. Roer dit nieuwe mengsel gedurende één uur bij 21 °C. Voeg langzaam 0,5 milliliter tetraethylorthosilicaat toe aan het mengsel en blijf dit nog twee uur roeren.

Verwacht dat het mengsel in deze tijd troebel wordt, verzamel vervolgens de nanosensoren door middel van rotatieverdamping en bewaar ze in een glazen vial bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik. Voeg daarna de gedroogde pH-nanosensoren toe in een concentratie van vijf milligram per milliliter in Sorenson's fosfaatbuffers, variërend van pH 5.5 tot pH 7.5 in stappen van pH 0.5. Resuspendeer de nanosensoren door de monsters drie minuten te vortexen en soniceren ze vervolgens gedurende vijf minuten of tot de oplossing troebel wordt.

Verzamel kalibratiedata door de monsters te meten bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer voor FAM en 568 nanometer. Voor Tamara worden de emissies verzameld tussen 500 en 530 nanometer voor FAM en tussen 558 en 580 nanometer voor Tamara, waarna de ratio van de emissiemaxima wordt berekend voor elke pH-waarde. Bereid vervolgens het monster voor op SEM-beeldvorming door een monster van nanosensoren op een met koolstof gecoate elektronenmicroscoopstub te plaatsen en de deeltjes vijf minuten lang met goud te sputtercoaten onder een argonatmosfeer.

Plaats de gecoate monsters in de elektronenmicroscoop en stel de werkafstand, het voltage en de vergroting in om elektronische oplading te minimaliseren en de beste beelden te verkrijgen in een zuurkast. Maak een 20% PLGA-oplossing in dichloormethaan met 1% perineumformiaat. Laad de oplossing in een spuit van 10 milliliter met een stompe vulnaald van 18 gauge en bevestig deze stevig op een spuitpompsysteem.

Deze oplossing zal worden gebruikt om controle PLGA-steigers te maken; plaats de naaldpunt op een afstand van 20 centimeter van een aluminium opvangplaat van 20 bij 15 centimeter, en bevestig de elektrode van een hoogspanningsvoeding aan de punt van de spuit en aard de draad aan de aluminium opvangplaat. Zet vervolgens de voeding aan en stel de spanning in op 12 kilovolt. Zet daarna de spuitpomp aan en breng de oplossing toe met een constante stroomsnelheid van 3,5 milliliter per uur gedurende twee uur.

Dit zal een scaffolddiepte van ongeveer 60 microns opleveren. Schakel de apparatuur na voltooiing uit en laat de scaffold 24 uur in de zuurkast staan om het resterende oplosmiddel te laten verdampen. Om scaffolds te bereiden waarin pH-responsieve nanosensoren zijn geïncorpereerd, bereidt u de PLGA-oplossing zoals voorheen, maar voegt u deze keer ook vijf milligram per milliliter van de nanosensoren toe.

Voer vervolgens electrospinning uit voor de pH-responsieve variant met dezelfde instellingen als voorheen. Kalibreer daarna de pH-responsiviteit van het scaffold door kleine monsters van het gedroogde scaffold met ingebouwde nanosensoren in 35 millimeter kweekplaten te plaatsen en deze onder te dompelen in twee milliliters Sorensen-fosfaatbuffers tussen pH 5,5 en 7,5 in stappen van 0,5 op een confocale microscoop. Gebruik een 488 nanometer argonlaser om FAM te exciteren en een 568 nanometer kryptonlaser om Tamara binnen de nanosensoren te exciteren.

Observeer de emissie bij 500 tot 530 nanometer voor FAM en 558 tot 580 nanometer voor Tamara, en bereken vervolgens de ratio van de emissiemaxima die bij elke pH-waarde zijn geproduceerd. Steriliseer eerst de oppervlakken van de scaffolds met een UV-lichtbron op een afstand van acht centimeter gedurende 15 minuten aan elke zijde. Draag de scaffolds vervolgens steriel over naar een kweekplaat met 12 wells en plaats een stalen ring met een binnendiameter van één centimeter en een buitendiameter van twee centimeter over de scaffold.

Voeg vervolgens PBS met 5% pen strip toe aan de binnen- en buitenkant van de stalen ring en incubeer de monsters een nacht. Verwijder de volgende dag de PBS met 5% pen strep en was de scaffolds met PBS.

Voeg vervolgens 500 µL celkweekmedium toe aan de binnen- en buitenkant van de stalen ring en laat de plaat voorverwarmen in een incubator. Oogst daarna de gewenste cellen en bereid een celsuspensie voor van 1 × 10⁶ cellen per mL. Zodra de cellen gereed zijn, wordt het medium uit de well verwijderd en wordt er 1 mL vers medium aan de buitenkant van de stalen ring toegevoegd.

Voeg vervolgens 300 µL van de celsuspensie toe aan de binnenkant van de stalen ring en schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Plaats de plaat in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en incubeer de cellen gedurende de benodigde tijd. Ververs het medium elke twee tot drie dagen; zaai de cellen op de scaffolds zoals beschreven in de vorige sectie en laat ze 72 uur ongestoord groeien.

Spoel de cellen vervolgens met PBS en voeg 500 µL serumvrij medium toe aan de buitenkant van de ring en 300 µL binnen de ring. Incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C. Bereid oplossing A voor door vijf mg van de nanosensoren aan 50 µL optimum toe te voegen en kortstondig te vortexen.

Meng vervolgens oplossing B door vijf µL lipectomy 2000 toe te voegen aan 45 µL Optum, en laat het mengsel vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg daarna oplossing A toe aan het mengsel van oplossing B en laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur om oplossing C te vormen, wat het nanosensor-liposoomcomplex is. Haal de plaat uit de incubator en voeg 100 µL van de complexoplossing toe aan de binnenkant van de stalen ring.

Plaats de plaat vervolgens terug in de incubator en incubeer de cellen gedurende drie uur met de lipectomie-reagenscomplexen. Aspireer het medium en was de cellen tweemaal met opgewarmde PBS voordat het scaffold met cellen wordt ondergedompeld in buffers met verschillende pH-waarden om de respons van de nanosensoren te monitoren. Beeld de cellen vervolgens in situ af met fluorescentie-confocale microscopie om de locatie van de nanosensoren in zoogdiercellen te volgen.

Bereid eerst uitsluitend fam-bevattende nanosensoren voor en breng deze aan bij cellen op PLGA-steigers. Voeg vervolgens 2 µL LysoTracker Red (50 nM) toe aan 300 µL medium en incubeer dit gedurende één uur bij 37 °C na de incubatieperiode. Verwijder het medium en was de cellen tweemaal met PBS.

Voeg vervolgens twee µL PBS of een ander medium zonder fenolrood toe om de cellen te bedekken tijdens de confocale beeldvorming. Voeg daarna vijf µM van de kernkleuring, Draq5, toe aan de PBS en incubeer dit drie minuten met de cellen bij 37 °C. Haal de plaat na drie minuten uit de incubator en plaats deze op de confocale tafel voor beeldvorming. Beeld de zure organellen en de celkern van de nanosensoren af met behulp van diverse excitatie- en emissiegolflengten zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, waarbij sequentiële scanning wordt gebruikt om de detectie van excitatiegolflengten te voorkomen. De grootteverdeling van de geprepareerde pH-responsieve nanosensoren werd gekarakteriseerd met SEM, waarbij de afmetingen van de gefotografeerde populatie nanosensoren werden gemeten en bleken te liggen in het bereik van 240 tot 470 nm.

Links is een afbeelding te zien van elektrogesponnen PLGA-vezels, en rechts zijn elektrogesponnen PLGA-vezels met nanosensoren afgebeeld. De SEM-micrografieën van de vezels leveren bewijs voor de associatie van nanosensoren op het oppervlak van de vezels. Ze kunnen echter ook in de scaffoldvezels zijn ingebed.

Zodra ze zijn ge-elektrogesponnen, behouden de nanosensoren hun vermogen om optisch en chemisch actief te blijven en worden hier getoond in associatie met de scaffoldvezels. Links is de fam-kleurstof in het groen weergegeven, en rechts de Tamara-kleurstof in het rood. De fluorescentie-intensiteitsverhouding resulteert in een kalibratiecurve zoals hier getoond.

Nanosensoren die afzonderlijk werden beoordeeld en nanosensoren die waren ingebed in elektrogesponnen PLGA-scaffolds vertoonden een gelijke respons, wat aantoont dat de nanosensoren hun optische activiteit behouden na incorporatie in de scaffolds. De ingebedde nanosensoren reagerden bovendien reversibel en adequaat op veranderende pH-waarden wanneer de buffer werd afgewisseld tussen een pH van 5,5 en 7,5. De fam-Tamra ratio reageerde telkens voorspelbaar zoals getoond.

Hier zijn confocale beelden van fibroblasten waarin nanosensoren intracellulair zijn afgeleverd via een transfectiereagens. De punctate colokalisatie van de fam- en Tamara-kleurstoffen suggereert dat de kleurstoffen ingesloten bleven in de nanosensormatrix. De intracellulaire aflevering van de nanosensoren kan worden bevestigd door de fam-Tamara-ratio te meten van cellen die in verschillende buffers zijn geplaatst.

Zoals hier te zien is, stijgt de ratio bij het meten van de op steigers gebaseerde nanosensoren, maar blijft deze stabiel bij het meten van de sensoren binnen de cellen. Na de ontwikkeling van deze techniek kunnen onderzoekers op het gebied van tissue engineering in situ en in real-time micro-omgevingen van intracellulaire pH-veranderingen binnen 3D-cellulaire constructen onderzoeken, zonder het lopende experiment te verstoren.