Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Het algemene doel van het volgende experiment is om pH-responsieve nanosensors en zelf rapporterende skeletten te produceren die in real time en in situ kunnen worden gemonitord om te helpen bij het begrijpen van omstandigheden die cellulaire groei beïnvloeden. Dit wordt bereikt door eerst biocompatibele analyt-responsieve nanosensors te bereiden, die pH kunnen monitoren via fluorescentie-uitvoer. Als tweede stap worden pH-responsieve nanosensors in polymere elektrogespunnen skeletten opgenomen, waardoor een 3D-omgeving ontstaat waarop cellen kunnen worden gekweekt en gemonitord.

Vervolgens worden zoogdiercellen op de elektrogespunnen skeletten geplaatst en worden nanosensors ook in hun intracellulaire omgeving gebracht om de intracellulaire pH te monitoren. Tijdens het experiment worden resultaten verkregen die de mogelijkheid van intracellulaire nanosensors en zelf rapporterende skeletten aantonen om pH binnen weefselgeëngredierde omgevingen te monitoren op basis van fluorescentie-verhoudingen verkregen door confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het gebruik van elektronische pH-sondes, is dat metingen in situ en in real time kunnen worden uitgevoerd zonder de cellulaire groei te verstoren.

Om te beginnen, bereid de fluoroforen voor door 1,5 milligram fam SE op te lossen in één milliliter dimethylformamide, bekend als DMF, in een ronde bodem. Los ook 1,5 milligram Tamara SE op in één milliliter DMF in een tweede flacon. Voeg vervolgens 1,5 milliliter van drie aminopropyltrietyl toe aan elke flacon en roer continu in het donker onder een droge stikstofsfeer bij 21 graden Celsius gedurende 24 uur.

Voeg vervolgens 250 microliter van beide kleurstofoplossingen toe aan een mengsel dat zes milliliter ethanol en vier milliliter ammoniumhydroxide bevat in een ronde bodemkolf. Roer dit nieuwe mengsel gedurende één uur bij 21 graden Celsius. Voeg langzaam 0,5 milliliter tetraethylorthosilicaat toe aan het mengsel en roer het nog eens twee uur.

Gedurende deze tijd verwacht u dat het mengsel troebel wordt, verzamel vervolgens de nanosensors door rotatie-evaporatie en bewaar ze in een glazen flesje bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik. Voeg vervolgens de gedroogde pH-nanosensors toe bij vijf milligram per milliliter in Sorenson's fosfaatbuffers, variërend van pH 5,5 tot pH 7,5 in incrementen van pH 0,5. Breng de nanosensors opnieuw in suspensie door de monsters gedurende drie minuten te vortexen en soniceer ze vervolgens gedurende vijf minuten of totdat de oplossing troebel wordt.

Verzamel kalibratiegegevens door de monsters te meten bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer voor FAM en 568 nanometer. Voor Tamara, verzamel de emissie tussen 500 tot 530 nanometer voor FAM en 558 tot 580 nanometer voor Tamara, en bereken de verhouding van emissiemaxima geproduceerd bij elke pH-waarde. Bereid vervolgens het monster voor voor SEM-beeldvorming door een monster van nanosensors op een met koolstof bekleed elektronenmicroscoop te plaatsen, stub en sputtercoat de deeltjes met goud gedurende vijf minuten onder een argonsfeer.

Nadat ze zijn gecoat, plaats de monsters in de elektronenmicroscoop en pas de werkafstand, spanning en vergroting aan om elektronenlading te minimaliseren en de beste beelden te produceren in een afzuigputje. Maak een 20% PLGA-oplossing in di-chloormethaan met 1% perineumformaat. Laad de oplossing in een 10 milliliter spuit met een 18 gauge stompe vulnaald en plaats deze veilig op een spuitpomp.

Deze oplossing zal worden gebruikt om controle PLGA-skeletten te maken. Houd de naaldpunt 20 centimeter van een 20 bij 15 centimeter aluminium opvangplaat en bevestig de elektrode van een hoogspanningsvoeding aan de punt van de spuit en aarde de draad naar de aluminium opvangplaat. Zet vervolgens de voeding aan en pas de spanning aan op 12 kilovolt. Zet vervolgens de spuitpomp aan en lever de oplossing met een constante stroomsnelheid van 3,5 milliliter per uur gedurende twee uur.

Dit zal een skeletdiepte van ongeveer 60 micron produceren. Zodra u klaar bent, zet u de apparatuur uit en laat u het skelet 24 uur in de afzuigputje staan om het oplosmiddelresidu te laten verdampen. Om skeletten te bereiden die zijn geïncorporeerd met pH-responsieve nanosensors, bereidt u de PLGA-oplossing voor zoals eerder, maar voeg deze keer ook vijf milligram per milliliter van de nanosensors toe.

Spin vervolgens de pH-responsieve met dezelfde instellingen als eerder. Kalibreer vervolgens de pH-responsiviteit van het skelet door kleine monsters van het gedroogde skelet met geïntegreerde nanosensors in 35 millimeter kweekplaten te plaatsen en ze onder te dompelen in twee milliliter Sorenson-fosfaatbuffers tussen pH 5,5 en 7,5 in incrementen van 0,5 op een confocale microscoop. Gebruik een 488 nanometer argonlaser om FAM aan te prikkelen en een 568 nanometer kryptonlaser om Tamara aan te prikkelen binnen de nanosensors.

Observeer de emissie bij 500 tot 530 nanometer voor FAM en 558 tot 580 nanometer voor Tamara, en bereken vervolgens de verhouding van emissiemaxima geproduceerd bij elke pH-waarde. Steriliseer eerst de oppervlakken van de skeletten met een UV-lichtbron op een afstand van acht centimeter gedurende 15 minuten aan elke kant. Breng vervolgens de skeletten sterieel over naar een 12-wels kweekplaat en plaats een stalen ring met een binnendiameter van één centimeter en buitendiameter van twee centimeter over het skelet.

Voeg vervolgens PBS met 5%pen strip toe aan de binnen- en buitenkant van de stalen ring en incubeer de monsters een nacht. De volgende dag. Verwijder de PBS met 5%pen strep en was de skeletten met PBS.

Voeg vervolgens 500 microliter celkweekmedium toe aan de binnen- en buitenkant van de stalen ring en verwarm de plaat in een incubator. Verzamel vervolgens de cellen van belang en bereid een celsuspensie voor van eenmaal 10 tot zes cellen per milliliter. Wanneer de cellen klaar zijn, verwijdert u het medium uit de put en voegt u één milliliter vers medium toe aan de buitenkant van de stalen