De ELISA-methode
De ELISA, of enzym-gekoppelde immunosorbeertest, is een veelgebruikt methode om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifiek doelwit-eiwit te bepalen.
Via een reeks was- en bindingsstappen zal een antilichaam, geconjugeerd of gekoppeld aan een enzym, een doelwit-eiwit herkennen op de bodem van een 96-wellplaat. Wanneer substraat aan het monster wordt toegevoegd, zal een enzymatische reactie plaatsvinden, wat een kleurverandering veroorzaakt die de identificatie en kwantificering van het doelwit-eiwit mogelijk maakt.
Voordat we bespreken hoe een ELISA uit te voeren, laten we vertrouwd raken met de apparatuur en reagentia die je nodig hebt.
De setting voor een ELISA-reactie is meestal een 96-wellplaat met platte bodem. De vlakke bodems van de wells helpen bij het vergemakkelijken van een gelijkmatige verdeling van uw experimenteel monster, evenals uw capture en detectie-antilichamen.
ELISA's detecteren de aanwezigheid van specifieke doelwit-eiwitten in experimentele waterige oplossingen. Urine, celkweekmedia en serum zijn gebruikelijke experimentele monsters.
In een ELISA is het antilichaam dat direct bindt aan het doelwit-eiwit het primaire antilichaam. Het heeft een hoge affiniteit, dat wil zeggen een hoge mate van binding, voor een epitope - een specifiek gebied - van het doelwit-eiwit. Het primaire antilichaam is meestal ongelabeld of niet-geconjugeerd.
Zoals gezegd, antilichamen binden meestal aan hun doelwit-eiwitten door hoge affiniteit binding aan een specifiek epitope. Echter, het experimentele monster kan echter cellen bevatten die niet-specifieke bindingsplaatsen tot expressie brengen, plaatsen die het constante of niet-epitope specifieke gebied van uw detectie-antilichamen kunnen binden.
Daarom is toevoeging van een blokkeerbuffer essentieel in een ELISA om eventuele niet-specifieke bindingsplaatsen in uw experimentele monsters te bedekken. Anders kunt u enzymatische reacties krijgen in wells die geen doelwit-eiwit bevatten, waardoor u valse positieve gegevens krijgt!
Het secundaire antilichaam in een ELISA is het antilichaam dat wordt gebruikt om het primaire antilichaam te herkennen. Dit antilichaam is meestal geconjugeerd aan een enzym. Soms heeft het secundaire antilichaam een eigenaardige naam. Bijvoorbeeld, als het secundaire antilichaam gemaakt of opgewekt is in een ezel om een primair antilichaam opgewekt in een geit te herkennen, zou het secundaire antilichaam een ezel-anti-geit antilichaam worden genoemd. Als het gaat om het benoemen van secundaire antilichamen, geeft de eerste naam de organisme aan die het secundaire antilichaam produceerde, en de tweede naam vertegenwoordigt het organisme dat het primaire antilichaam produceert.
Een substraat, dat bindt aan de actieve plaats van het enzym gekoppeld aan het secundaire antilichaam, zal ook nodig zijn. De chemische reactie die optreedt tijdens deze reactie veroorzaakt een kleurverandering in het anders kleurloze substraat. Deze zogenaamde colorimetrische test maakt de identificatie en kwantificering van de aanwezigheid van het doelwit-eiwit mogelijk.
De enzymatische reactie zal doorgaan zolang er beschikbaar substraat is. Daarom wordt na een korte incubatieperiode een stopoplossing, die nog een kleurverandering veroorzaakt om aan te geven dat de reactie in feite is gestopt, toegevoegd aan de wells.
Een microplaatlezer zal worden gebruikt om de concentratie van het eiwit van belang in elk wel te kwantificeren door de absorptie te lezen, dat wil zeggen de hoeveelheid gekleurd product, in elk wel. De absorptie is evenredig aan de hoeveelheid doelwit-eiwit dat aanwezig is.
Nu je al je apparatuur klaar hebt, laten we een ELISA uitvoeren!
Om een standaard of directe ELISA uit te voeren, bekleedt u eerst de wells van de 96-wellplaat met uw doelwit-eiwit van belang verdund in bekleedbuffer. Plateer uw positieve en negatieve controles op dit moment ook.
Nadat de beklede plaat lang genoeg is beïnvloed om het eiwit de tijd te geven om volledig te adsorberen of zich te hechten aan de bodem van de plaat, gooit u de overtollige bekleedoplossing af met een snelle beweging van uw pols.
Blokkeer vervolgens eventuele niet-specifieke binding of achtergrondsignaal door elke well in blokkeerbuffer te incuberen.
Gooi nu de blokkeerbuffer af en was de wells met een korte kamertemperatuurincubatie in fosfaatgebufferd zoutje, of PBS, en 1% BSA.
Terwijl de wells met PBS worden gespoeld, bereidt u verdunningsreeksen van een bekende concentratie van het doelwit-eiwit voor om een standaardcurve te maken. De absorptie van de standaardcurvewells, die bekende concentraties van het doelwit-eiwit bevatten, zal worden gebruikt om de concentratie van doelwit-eiwit in uw experimentele monsterwells te berekenen op basis van een vergelijking van de absorptie van de monsterwells met de absorptie van de standaardcurvewells.
Nu is het tijd om het detectie- of primaire antilichaam toe te voegen!
De plaat wordt vervolgens geïncubeerd, meestal op kamertemperatuur, om voldoende hoeveelheid antilichaam toe te staan om zich te binden aan het doelwit-eiwit voor latere detectie en kwantificering van het eiwit.
Na deze incubatie wordt overtollig antilichaam verwijderd en worden de wells kort met PBS gewassen.
Vervolgens wordt secundair antilichaam aan de plaat toegevoegd, en de plaat wordt opnieuw geïncubeerd - meestal op een roterend platform - om secundair antilichaam toe te staan te binden. Wasstappen worden zoals eerder herhaald.
Voeg vervolgens het substraat toe aan de plaat om te zien welke wells uw doelwit-eiwit bevatten. Bedek de plaat om de reactie tegen licht te beschermen, en na een korte incubatie, stopt u de reactie met stopoplossing.
Plaats tenslotte uw plaat in de microplaat
Een enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) wordt meestal uitgevoerd om de aanwezigheid en/of hoeveelheid van een doelwiteiwit van belang binnen…
De ELISA, of enzym-gekoppelde immunosorbeertest, is een veelgebruikt methode om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifiek doelwit-eiwit te bepalen.
Via een reeks was- en bindingsstappen zal een antilichaam, geconjugeerd of gekoppeld aan een enzym, een doelwit-eiwit herkennen op de bodem van een 96-wellplaat. Wanneer substraat aan het monster wordt toegevoegd, zal een enzymatische reactie plaatsvinden, wat een kleurverandering veroorzaakt die de identificatie en kwantificering van het doelwit-eiwit mogelijk maakt.
Voordat we bespreken hoe een ELISA uit te voeren, laten we vertrouwd raken met de apparatuur en reagentia die je nodig hebt.
De setting voor een ELISA-reactie is meestal een 96-wellplaat met platte bodem. De vlakke bodems van de wells helpen bij het vergemakkelijken van een gelijkmatige verdeling van uw experimenteel monster, evenals uw capture en detectie-antilichamen.
ELISA's detecteren de aanwezigheid van specifieke doelwit-eiwitten in experimentele waterige oplossingen. Urine, celkweekmedia en serum zijn gebruikelijke experimentele monsters.
In een ELISA is het antilichaam dat direct bindt aan het doelwit-eiwit het primaire antilichaam. Het heeft een hoge affiniteit, dat wil zeggen een hoge mate van binding, voor een epitope - een specifiek gebied - van het doelwit-eiwit. Het primaire antilichaam is meestal ongelabeld of niet-geconjugeerd.
Zoals gezegd, antilichamen binden meestal aan hun doelwit-eiwitten door hoge affiniteit binding aan een specifiek epitope. Echter, het experimentele monster kan echter cellen bevatten die niet-specifieke bindingsplaatsen tot expressie brengen, plaatsen die het constante of niet-epitope specifieke gebied van uw detectie-antilichamen kunnen binden.
Daarom is toevoeging van een blokkeerbuffer essentieel in een ELISA om eventuele niet-specifieke bindingsplaatsen in uw experimentele monsters te bedekken. Anders kunt u enzymatische reacties krijgen in wells die geen doelwit-eiwit bevatten, waardoor u valse positieve gegevens krijgt!
Het secundaire antilichaam in een ELISA is het antilichaam dat wordt gebruikt om het primaire antilichaam te herkennen. Dit antilichaam is meestal geconjugeerd aan een enzym. Soms heeft het secundaire antilichaam een eigenaardige naam. Bijvoorbeeld, als het secundaire antilichaam gemaakt of opgewekt is in een ezel om een primair antilichaam opgewekt in een geit te herkennen, zou het secundaire antilichaam een ezel-anti-geit antilichaam worden genoemd. Als het gaat om het benoemen van secundaire antilichamen, geeft de eerste naam de organisme aan die het secundaire antilichaam produceerde, en de tweede naam vertegenwoordigt het organisme dat het primaire antilichaam produceert.
Een substraat, dat bindt aan de actieve plaats van het enzym gekoppeld aan het secundaire antilichaam, zal ook nodig zijn. De chemische reactie die optreedt tijdens deze reactie veroorzaakt een kleurverandering in het anders kleurloze substraat. Deze zogenaamde colorimetrische test maakt de identificatie en kwantificering van de aanwezigheid van het doelwit-eiwit mogelijk.
De enzymatische reactie zal doorgaan zolang er beschikbaar substraat is. Daarom wordt na een korte incubatieperiode een stopoplossing, die nog een kleurverandering veroorzaakt om aan te geven dat de reactie in feite is gestopt, toegevoegd aan de wells.
Een microplaatlezer zal worden gebruikt om de concentratie van het eiwit van belang in elk wel te kwantificeren door de absorptie te lezen, dat wil zeggen de hoeveelheid gekleurd product, in elk wel. De absorptie is evenredig aan de hoeveelheid doelwit-eiwit dat aanwezig is.
Nu je al je apparatuur klaar hebt, laten we een ELISA uitvoeren!
Om een standaard of directe ELISA uit te voeren, bekleedt u eerst de wells van de 96-wellplaat met uw doelwit-eiwit van belang verdund in bekleedbuffer. Plateer uw positieve en negatieve controles op dit moment ook.
Nadat de beklede plaat lang genoeg is beïnvloed om het eiwit de tijd te geven om volledig te adsorberen of zich te hechten aan de bodem van de plaat, gooit u de overtollige bekleedoplossing af met een snelle beweging van uw pols.
Blokkeer vervolgens eventuele niet-specifieke binding of achtergrondsignaal door elke well in blokkeerbuffer te incuberen.
Gooi nu de blokkeerbuffer af en was de wells met een korte kamertemperatuurincubatie in fosfaatgebufferd zoutje, of PBS, en 1% BSA.
Terwijl de wells met PBS worden gespoeld, bereidt u verdunningsreeksen van een bekende concentratie van het doelwit-eiwit voor om een standaardcurve te maken. De absorptie van de standaardcurvewells, die bekende concentraties van het doelwit-eiwit bevatten, zal worden gebruikt om de concentratie van doelwit-eiwit in uw experimentele monsterwells te berekenen op basis van een vergelijking van de absorptie van de monsterwells met de absorptie van de standaardcurvewells.
Nu is het tijd om het detectie- of primaire antilichaam toe te voegen!
De plaat wordt vervolgens geïncubeerd, meestal op kamertemperatuur, om voldoende hoeveelheid antilichaam toe te staan om zich te binden aan het doelwit-eiwit voor latere detectie en kwantificering van het eiwit.
Na deze incubatie wordt overtollig antilichaam verwijderd en worden de wells kort met PBS gewassen.
Vervolgens wordt secundair antilichaam aan de plaat toegevoegd, en de plaat wordt opnieuw geïncubeerd - meestal op een roterend platform - om secundair antilichaam toe te staan te binden. Wasstappen worden zoals eerder herhaald.
Voeg vervolgens het substraat toe aan de plaat om te zien welke wells uw doelwit-eiwit bevatten. Bedek de plaat om de reactie tegen licht te beschermen, en na een korte incubatie, stopt u de reactie met stopoplossing.
Plaats tenslotte uw plaat in de microplaat
De ELISA, of enzym-gekoppelde immunosorbeertest, is een veelgebruikt methode om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifiek doelwit-eiwit te bepalen.
Via een reeks was- en bindingsstappen zal een antilichaam, geconjugeerd of gekoppeld aan een enzym, een doelwit-eiwit herkennen op de bodem van een 96-wellplaat. Wanneer substraat aan het monster wordt toegevoegd, zal een enzymatische reactie plaatsvinden, wat een kleurverandering veroorzaakt die de identificatie en kwantificering van het doelwit-eiwit mogelijk maakt.
Voordat we bespreken hoe een ELISA uit te voeren, laten we vertrouwd raken met de apparatuur en reagentia die je nodig hebt.
De setting voor een ELISA-reactie is meestal een 96-wellplaat met platte bodem. De vlakke bodems van de wells helpen bij het vergemakkelijken van een gelijkmatige verdeling van uw experimenteel monster, evenals uw capture en detectie-antilichamen.
ELISA's detecteren de aanwezigheid van specifieke doelwit-eiwitten in experimentele waterige oplossingen. Urine, celkweekmedia en serum zijn gebruikelijke experimentele monsters.
In een ELISA is het antilichaam dat direct bindt aan het doelwit-eiwit het primaire antilichaam. Het heeft een hoge affiniteit, dat wil zeggen een hoge mate van binding, voor een epitope - een specifiek gebied - van het doelwit-eiwit. Het primaire antilichaam is meestal ongelabeld of niet-geconjugeerd.
Zoals gezegd, antilichamen binden meestal aan hun doelwit-eiwitten door hoge affiniteit binding aan een specifiek epitope. Echter, het experimentele monster kan echter cellen bevatten die niet-specifieke bindingsplaatsen tot expressie brengen, plaatsen die het constante of niet-epitope specifieke gebied van uw detectie-antilichamen kunnen binden.
Daarom is toevoeging van een blokkeerbuffer essentieel in een ELISA om eventuele niet-specifieke bindingsplaatsen in uw experimentele monsters te bedekken. Anders kunt u enzymatische reacties krijgen in wells die geen doelwit-eiwit bevatten, waardoor u valse positieve gegevens krijgt!
Het secundaire antilichaam in een ELISA is het antilichaam dat wordt gebruikt om het primaire antilichaam te herkennen. Dit antilichaam is meestal geconjugeerd aan een enzym. Soms heeft het secundaire antilichaam een eigenaardige naam. Bijvoorbeeld, als het secundaire antilichaam gemaakt of opgewekt is in een ezel om een primair antilichaam opgewekt in een geit te herkennen, zou het secundaire antilichaam een ezel-anti-geit antilichaam worden genoemd. Als het gaat om het benoemen van secundaire antilichamen, geeft de eerste naam de organisme aan die het secundaire antilichaam produceerde, en de tweede naam vertegenwoordigt het organisme dat het primaire antilichaam produceert.
Een substraat, dat bindt aan de actieve plaats van het enzym gekoppeld aan het secundaire antilichaam, zal ook nodig zijn. De chemische reactie die optreedt tijdens deze reactie veroorzaakt een kleurverandering in het anders kleurloze substraat. Deze zogenaamde colorimetrische test maakt de identificatie en kwantificering van de aanwezigheid van het doelwit-eiwit mogelijk.
De enzymatische reactie zal doorgaan zolang er beschikbaar substraat is. Daarom wordt na een korte incubatieperiode een stopoplossing, die nog een kleurverandering veroorzaakt om aan te geven dat de reactie in feite is gestopt, toegevoegd aan de wells.
Een microplaatlezer zal worden gebruikt om de concentratie van het eiwit van belang in elk wel te kwantificeren door de absorptie te lezen, dat wil zeggen de hoeveelheid gekleurd product, in elk wel. De absorptie is evenredig aan de hoeveelheid doelwit-eiwit dat aanwezig is.
Nu je al je apparatuur klaar hebt, laten we een ELISA uitvoeren!
Om een standaard of directe ELISA uit te voeren, bekleedt u eerst de wells van de 96-wellplaat met uw doelwit-eiwit van belang verdund in bekleedbuffer. Plateer uw positieve en negatieve controles op dit moment ook.
Nadat de beklede plaat lang genoeg is beïnvloed om het eiwit de tijd te geven om volledig te adsorberen of zich te hechten aan de bodem van de plaat, gooit u de overtollige bekleedoplossing af met een snelle beweging van uw pols.
Blokkeer vervolgens eventuele niet-specifieke binding of achtergrondsignaal door elke well in blokkeerbuffer te incuberen.
Gooi nu de blokkeerbuffer af en was de wells met een korte kamertemperatuurincubatie in fosfaatgebufferd zoutje, of PBS, en 1% BSA.
Terwijl de wells met PBS worden gespoeld, bereidt u verdunningsreeksen van een bekende concentratie van het doelwit-eiwit voor om een standaardcurve te maken. De absorptie van de standaardcurvewells, die bekende concentraties van het doelwit-eiwit bevatten, zal worden gebruikt om de concentratie van doelwit-eiwit in uw experimentele monsterwells te berekenen op basis van een vergelijking van de absorptie van de monsterwells met de absorptie van de standaardcurvewells.
Nu is het tijd om het detectie- of primaire antilichaam toe te voegen!
De plaat wordt vervolgens geïncubeerd, meestal op kamertemperatuur, om voldoende hoeveelheid antilichaam toe te staan om zich te binden aan het doelwit-eiwit voor latere detectie en kwantificering van het eiwit.
Na deze incubatie wordt overtollig antilichaam verwijderd en worden de wells kort met PBS gewassen.
Vervolgens wordt secundair antilichaam aan de plaat toegevoegd, en de plaat wordt opnieuw geïncubeerd - meestal op een roterend platform - om secundair antilichaam toe te staan te binden. Wasstappen worden zoals eerder herhaald.
Voeg vervolgens het substraat toe aan de plaat om te zien welke wells uw doelwit-eiwit bevatten. Bedek de plaat om de reactie tegen licht te beschermen, en na een korte incubatie, stopt u de reactie met stopoplossing.
Plaats tenslotte uw plaat in de microplaat
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is an ELISA and how does it detect target proteins?
An ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, detects specific target proteins in experimental samples through antibody binding. Antibodies conjugated to enzymes recognize target proteins coating the bottom of a 96-well plate. When substrate is added, an enzymatic reaction occurs, causing a color change that allows identification and quantification of the target protein.
Q2: Why is a blocking buffer essential in ELISA procedures?
A blocking buffer covers nonspecific binding sites in experimental samples that could otherwise bind detector antibodies. Without blocking, enzymatic reactions may occur in wells lacking target protein, producing false positive results. This step prevents background signal and ensures accurate detection of only the target protein of interest.
Q3: How do primary and secondary antibodies work together in an ELISA?
The primary antibody directly binds to the target protein with high affinity for a specific epitope region. The secondary antibody, typically raised in a different organism, recognizes and binds to the primary antibody. The secondary antibody is enzyme-conjugated, enabling the colorimetric reaction when substrate is added.
Q4: What role does the microplate reader play in ELISA analysis?
The microplate reader quantifies protein concentration by measuring absorbance, or the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the target protein present. By comparing sample well absorbance to a standard curve of known protein concentrations, the reader determines the protein concentration in experimental samples.
Q5: What is a sandwich ELISA and how does it differ from a standard ELISA?
In a sandwich ELISA, the 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein, rather than coating with the target protein itself. The target protein binds between the plate-bound primary antibody and an enzyme-linked secondary antibody, creating a sandwich structure. This format is commonly used in pregnancy tests and cell line screening applications.
Q6: How does a competitive ELISA detect antibodies in patient samples?
In a competitive ELISA, antibodies of interest in the sample bind to target protein attached to the plate bottom. When enzyme-linked detection antibodies are added, they find few binding sites because the sample antibodies have already bound the target protein. Colored wells indicate samples without the antibody of interest, making this format useful for detecting pathogen antibodies like HIV.
Q7: What determines the detection limits of an ELISA assay?
Each ELISA kit has specific detection limits based on protein concentration ranges. Very low protein concentrations are too close to background levels of nonspecific staining and cannot be accurately detected. Very high concentrations may indicate excess protein or antibody was not properly washed away, affecting result accuracy.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:43
ELISA: Components and Principles
4:03
Running an ELISA
7:18
Applications
9:53
Summary