De ELISA-methode

De ELISA, of enzyme-linked immunosorbent assay, is een veelgebruikte methode voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van een specifiek doeleiwit.

Via een reeks was- en bindingsstappen zal een antilichaam dat geconjugeerd, of gekoppeld, is aan een enzym een doeleiwit onderin een 96-wells plaat herkennen. Wanneer er substraat aan de monsteroplossing wordt toegevoegd, vindt er een enzymatische reactie plaats, wat leidt tot een kleurverandering waardoor het doeleiwit kan worden geïdentificeerd en gekwantificeerd.

Voordat we bespreken hoe u een ELISA uitvoert, maken we eerst kennis met de benodigde apparatuur en reagentia.

De setting voor een ELISA-reactie is doorgaans een 96-well plaat met een platte bodem. De platte bodems van de wells helpen bij een gelijkmatige verdeling van uw experimentele monster, evenals uw capture- en detectieantilichamen.

ELISA's detecteren de aanwezigheid van specifieke doelproteïnen in experimentele waterige oplossingen. Urine, celcultuurmedia en serum zijn veelvoorkomende experimentele monsters.

Bij een ELISA is het antilichaam dat direct bindt aan het doelproteïne het primaire antilichaam. Het heeft een hoge affiniteit, dat wil zeggen een groot vermogen om stevig te binden aan een epitoop - een specifiek gebied - van het doelproteïne. Het primaire antilichaam is gewoonlijk ongelabeld, of niet-geconjugeerd.

Zoals vermeld, binden antilichamen hoofdzakelijk aan hun doelproteïnen via binding met een hoge affiniteit aan een specifiek epitoop. Het experimentele monster kan echter celresten bevatten die aspecifieke bindingsplaatsen tot expressie brengen; plaatsen die kunnen binden aan de constante, of niet-epitoopspecifieke, regio van uw detectieantilichamen.

Daarom is de toevoeging van een blokkeringsbuffer essentieel bij een ELISA om eventuele aspecifieke bindingsplaatsen in uw experimentele monsters af te dekken. Anders kunnen er enzymatische reacties optreden in wells die geen doelproteïne bevatten, wat leidt tot fout-positieve gegevens!

Het secundaire antilichaam in een ELISA is het antilichaam dat wordt gebruikt om het primaire antilichaam te herkennen. Dit antilichaam is gewoonlijk geconjugeerd aan een enzym. Soms heeft het secundaire antilichaam een specifieke naam. Als het secundaire antilichaam bijvoorbeeld is gemaakt, of is opgewekt, in een ezel om een primair antilichaam te herkennen dat is opgewekt in een geit, dan wordt het secundaire antilichaam een ezel anti-geit antilichaam genoemd. Bij het benoemen van secundaire antilichamen geeft de eerste naam het organisme aan dat het secundaire antilichaam heeft geproduceerd, en de tweede naam vertegenwoordigt het organisme dat het primaire antilichaam produceert.

Er is ook een substraat nodig dat bindt aan de actieve site van het enzym dat is gekoppeld aan het secundaire antilichaam. De chemische reactie die tijdens dit proces plaatsvindt, veroorzaakt een kleurverandering in het oorspronkelijk kleurloze substraat. Deze zogenaamde colorimetrische assay maakt de identificatie en kwantificatie van de aanwezigheid van het doelproteïne mogelijk.

De enzymatische reactie gaat door zolang er substraat beschikbaar is. Daarom wordt er na een korte incubatieperiode een stopoplossing aan de wells toegevoegd, die een verdere kleurverandering veroorzaakt om aan te geven dat de reactie inderdaad is gestopt.

Een microplaatlezer wordt gebruikt om de concentratie van het proteïne van belang in elke well te kwantificeren door de absorbentie, oftewel de hoeveelheid gekleurd product, in elke well af te lezen. De absorbentie is proportioneel aan de hoeveelheid aanwezige doelproteïne.

Nu al uw benodigdheden klaarstaan, gaan we een ELISA uitvoeren!

Om een standaard, of directe, ELISA uit te voeren, coatet u eerst de wells van de 96-wells plaat met het gewenste doeleiwit verdund in coatingbuffer. Breng op dit moment ook uw positieve en negatieve controles aan op de plaat.

Nadat de gecoate plaat lang genoeg is geïncubeerd om het eiwit de tijd te geven volledig te adsorberen, of te hechten, aan de bodem van de plaat, giet u de overtollige coatingoplossing af met een snelle knik van de pols.

Blokkeer vervolgens eventuele mogelijke aspecifieke binding of achtergrondsignaal door elke well te incuberen in blokkeringsbuffer.

Giet nu de blokkeringsbuffer af en was de wells met een korte incubatie bij kamertemperatuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS, en 1% BSA.

Terwijl de wells met PBS worden gespoeld, bereidt u verdunningen voor van een bekende concentratie van het doeleiwit om een standaardcurve te maken. De absorbentie van de wells van de standaardcurve, die bekende concentraties van het doeleiwit bevatten, wordt gebruikt om de concentratie van het doeleiwit in uw experimentele monsterwells te berekenen, op basis van een vergelijking tussen de absorbentie van de monsterwells en die van de wells van de standaardcurve.

Nu is het tijd om het detectie- of primaire antilichaam toe te voegen!

De plaat wordt vervolgens geïncubeerd, gewoonlijk bij kamertemperatuur, om een voldoende hoeveelheid antilichaam te laten binden aan het doeleiwit voor latere detectie en kwantificatie van het eiwit.

Na deze incubatie wordt het overtollige antilichaam verwijderd en worden de wells kort gewassen met PBS.

Vervolgens wordt het secundaire antilichaam aan de plaat toegevoegd en wordt de plaat opnieuw geïncubeerd – doorgaans op een roterend platform – om het secundaire antilichaam te laten binden. De wasstappen worden herhaald zoals eerder.

Voeg daarna het substraat toe aan de plaat om te zien welke wells uw doeleiwit bevatten. Dek de plaat af om de reactie tegen licht te beschermen, en stop na een korte incubatie de reactie met stopoplossing.

Plaats tot slot uw plaat in de microplate reader om de absorbentie of de hoeveelheid gekleurde oplossing in elke well te meten. U moet selecteren welke wells u door de reader wilt laten analyseren. Wanneer het instrument klaar is met het uitlezen van de plaat, wordt een weergave van de absorbentie voor elke well getoond.

Het is belangrijk om op te merken dat elke ELISA-kit een detectielimiet heeft. Dat wil zeggen dat alleen eiwitconcentraties boven en onder specifieke limieten nauwkeurig kunnen worden bepaald. Zeer kleine concentraties eiwit liggen meestal te dicht bij de achtergrondniveaus van aspecifieke kleuring, terwijl zeer hoge concentraties kunnen wijzen op het feit dat overtollig eiwit of antilichaam in die monsterwell niet correct is weggewassen.

Waarom zou u een ELISA uitvoeren? Laten we naar een paar veelvoorkomende toepassingen kijken.

Waarschijnlijk is de sandwich-ELISA het meest uitgevoerde type ELISA.

Bij een sandwich-ELISA wordt een 96-wells plaat eerst gecoat met een primair antilichaam dat het doeleiwit van belang herkent.

In dit experiment werd celkweekmedium, geoogst uit menselijke antilichaam-producerende cellijnen, door een geautomatiseerd systeem op 96-wells platen geplaatst die vooraf waren gecoat met een primair antilichaam dat menselijke antilichamen herkent.

Na het uitwassen van het overtollige monster met PBS wordt een enzymgekoppeld secundair antilichaam toegevoegd, gevolgd door een colorimetrisch substraat.

De absorbantie wordt vervolgens op dezelfde manier gemeten als bij een typische ELISA. In dit experiment zullen deze ELISA-gegevens bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen welke cellijnen het menselijke antilichaam produceren met de hoogste affiniteit voor – dat wil zeggen het beste vermogen om nauwkeurig te binden aan – het doelantigeen.

De vrij verkrijgbare zwangerschapstest is een type sandwich-ELISA.

Wanneer de urine van een potentieel zwangere vrouw aan de test wordt toegevoegd, zullen enzymgekoppelde primaire antilichamen die aan de test zijn bevestigd, het zwangerschapshormoon hCG binden als dit aanwezig is. Als de vrouw zwanger is, vindt er een substraat-enzymreactie plaats wanneer de primaire antilichamen worden herkend door substraatgebonden secundaire antilichamen op de testlocatie, waardoor er een gekleurde lijn verschijnt.

Een ander type ELISA is de competitieve ELISA, die kan worden gebruikt om de aanwezigheid van antilichamen aan te tonen.

Als de antilichamen van belang aanwezig zijn in het monster, zullen ze binden aan het doeleiwit dat aan de bodem van de plaat is bevestigd. Wanneer later enzymgekoppelde detectieantilichamen aan de plaat worden toegevoegd, zullen deze enzymgekoppelde antilichamen weinig tot geen eiwitten vinden om aan te binden; ze zijn "uitgeconcurreerd" door de antilichamen van belang in het experimentele monster.

Bij een competitieve ELISA geven de gekleurde wells dus de monsters aan die juist het antilichaam van belang niet bevatten! Plasmaproeven van patiënten worden doorgaans in een competitieve ELISA geanalyseerd om te bepalen of antilichamen tegen bepaalde pathogenen, zoals het HIV-virus, in het monster aanwezig zijn.

U heeft zojuist de JoVE-introductie over het uitvoeren van een ELISA bekeken. In deze video hebben we besproken: wat een ELISA is en hoe het werkt; welke apparatuur en reagentia u nodig heeft om een ELISA uit te voeren; en enkele verschillende toepassingen van de assay. Bedankt voor het kijken, en vergeet niet om te voorkomen dat uw substraat overontwikkelt!