Plasmidzuivering

Plasmiden zijn circulaire, extrachromosomale DNA-moleculen die in de moleculaire biologie dienen als dragers, of vectoren, voor een specifiek DNA-fragment. Bacteriën worden gebruikt om plasmiden te repliceren, zodat het DNA van belang op grote schaal kan worden geproduceerd. Het proces waarmee onderzoekers plasmiden uit bacteriën verkrijgen wordt plasmidpurificatie genoemd, wat in deze video zal worden uitgelegd.

Plasmidezuivering houdt overduidelijk in dat plasmiden worden gezuiverd, maar wat betekent dat precies? Om plasmiden te zuiveren, moeten ze worden geïsoleerd van het bacteriële chromosoom, eiwitten, het bacteriële membraan en bacteriële ribosomen.

Hoewel er veel verschillende kits bestaan voor het zuiveren van plasmiden, blijft het basisprincipe achter plasmidezuivering voor alle kits hetzelfde. Eerst wordt de geselecteerde bacteriële kolonie gekweekt in een geschikt cultuurmedium dat de juiste antibiotica bevat. Dankzij een antibioticaresistentiegen, gecodeerd door het plasmide, zullen alleen bacteriën die het plasmide bevatten in dit medium groeien. De bacteriën worden geoogst en gelyseerd bij een hoge pH. De pH wordt geneutraliseerd, er wordt zout toegevoegd en vervolgens wordt het mengsel gecentrifugeerd om debris en genomisch DNA te verwijderen.

Het geneutraliseerde cellysaat wordt op een silicacolom aangebracht. Men gaat ervan uit dat plasmide-DNA aan de kolom hecht via een mechanisme genaamd anionuitwisseling, waarbij DNA, een sterk anion, bindt aan de negatief geladen kolom via een kationische zoutbrug. Ander materiaal uit het lysaat, zoals eiwitten, wordt met buffers met een hoge zoutconcentratie door de kolom gewassen. Tot slot wordt het gezuiverde plasmide van de kolom vrijgegeven wanneer een buffer met een lage zoutconcentratie wordt toegevoegd, waardoor de zoutbrug wordt verbroken.

Voor deze procedure dient een laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril te worden gedragen.

De bacteriële culturen, die zijn getransformeerd met het gewenste plasmide-DNA, moeten gedurende de nacht worden gekweekt in groeimedium met het juiste antibioticum in een schuddende incubator bij 37°C.

De volgende dag wordt de bacteriecultuur door centrifugatie gepellet en wordt het supernatant verwijderd. De resterende pellet wordt geresuspendeerd in lysisbuffer.

Na resuspensie kunnen de bacteriën worden overgebracht naar een kleinere buis waarin lysisbuffer wordt toegevoegd. Lysisbuffer heeft een hoge pH en bevat detergentia, zoals natriumdodecylsulfaat, die de bacteriële membranen openbreken en zo de bacteriën lyseren. De oplossing zal troebel worden na toevoeging van de lysisbuffer en na menging wordt de oplossing weer helderder. Het mengsel mag niet gevortext worden vanwege de mogelijkheid tot shearing, of het breken, van genomisch DNA, wat vervolgens de zuivering van het plasmide-DNA zou kunnen contamineren.

Vervolgens wordt neutralisatiebuffer toegevoegd om de alkalische condities te neutraliseren en de pH te verlagen. Door voorzichtig mengen zullen het genomisch DNA en alle eraan gebonden eiwitten neerslaan, terwijl het plasmide-DNA in oplossing blijft. Vermijd opnieuw het vortexen, zodat uw plasmiden vrij zijn van genomische DNA-contaminatie.

Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd en het neerslag van genomisch DNA/eiwit wordt gepellet. Het supernatant bevat het plasmide-DNA alsook oplosbare eiwitten.

Dit supernatant wordt op de kolom geplaatst door decanteren, een chique term voor afgieten, of door pipetteren. De pellet kan worden weggegooid.

Vervolgens stroomt een washbuffer met een hoog zoutgehalte door de kolom, terwijl het DNA gebonden blijft aan de silica. Herhaalde wasstappen met een high-salt buffer verwijderen endonucleasen, RNA, eiwitten, kleurstoffen en laagmoleculaire onzuiverheden. De flow-through van de wasstappen moet worden weggegooid. Zorg na de laatste wasstap dat het filter volledig droog is en er geen buffer meer aanwezig is. Het plasmide-DNA bevindt zich nog steeds op het filter.

Het plasmide-DNA wordt geëlueerd met steriel water of een elutiebuffer. Het DNA is direct beschikbaar voor gebruik in een breed scala aan toepassingen.

Er zijn verschillende manieren om de zuiverheid van plasmiden na zuivering te verifiëren. Een spectrometer kan worden gebruikt om de absorptie bij verschillende golflengten te vergelijken om de concentratie van het plasmide-DNA te bepalen. Een agarosegelanalyse van het gezuiverde plasmide kan bepalen of het plasmide de juiste grootte heeft en of er geen contaminanten aanwezig zijn. Deze stap garandeert dat er geen genomische DNA-contaminatie is en dat het plasmide niet is gemodificeerd in de bacteriën.

De procedure voor plasmidzuivering kan worden aangepast aan verschillende plasmidgroottes, kopiegetallen en cultuurvolumes, en kan verschillende apparatuur bevatten voor de bindings-, was- en elutiestappen. Het rendement is een van de meest prominente onderscheidende factoren tussen plasmidpreparaties; deze worden vaak onderverdeeld in de minipreparatie, of miniprep, de midiprep, de maxiprep en de megaprep, afhankelijk van het gewenste rendement.

Wat betreft downstream-toepassingen is transfectie een procedure die vaak volgt op plasmidzuivering, waarbij plasmid-DNA in eukaryote cellen wordt geïntroduceerd. Vaak is het doel van een transfectie-experiment het visualiseren van de structuur van cellen en weefsels met reportereiwitten, zoals die welke de neuronen in de beelden die u hier ziet markeren.

Soms kunnen meerdere plasmiden, gezuiverd via verschillende zuiveringspreps, in dezelfde bacteriën worden geïntroduceerd, waardoor een volledige biosynthetische route wordt gereproduceerd door de productie van een aantal door de plasmiden gecodeerde enzymen. Het eindresultaat is de productie van een complexe verbinding door de cel, zoals het antibioticum dat u hier ziet.

Gezuiverde plasmiden kunnen opnieuw in bacteriën worden geïntroduceerd om grote hoeveelheden van het door het plasmid gecodeerde eiwit te genereren. Hier ziet u bacteriële cellen die worden gehomogeniseerd en gelyseerd voordat een techniek genaamd affiniteitszuivering kan worden uitgevoerd om het doeleiwit te isoleren. Het gezuiverde eiwit wordt gekristalliseerd waarna de structuur ervan wordt geïdentificeerd.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over plasmidpurificatie bekeken. In deze video hebben we de basisprincipes van deze methode besproken, de stapsgewijze beschrijving ervan en een aantal toepassingen van uw plasmidpreparatie. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!