Gelzuivering

Gelzuivering is een standaardprocedure die wordt uitgevoerd om gewenste DNA-fragmenten uit agarosegels te herstellen na elektroforetische scheiding. Na het oplossen van het gelfragment en het passeren hiervan door een gespecialiseerd filter, levert deze procedure DNA op dat vrij is van onzuiverheden zoals zouten, vrije nucleotiden en enzymen, wat geschikt is voor downstream-applicaties.

Het basisprincipe achter het terugwinnen van DNA uit agarosegel omvat een reeks stappen van binding, wassen en elutie. Zodra de gel zich in de solubiliseringsbuffer bevindt, wordt deze op een "spincolumn" aangebracht, waarbij DNA-moleculen bij centrifugatie selectief aan een silicafilter binden, terwijl de onzuiverheden doorstromen naar een opvangbuis.

DNA is in staat om aan silica te binden dankzij een hoge zoutconcentratie in de gel-solubiliseringsbuffer. Men gaat ervan uit dat deze buffer de hydratatiestructuur rond het filter verstoort en een kationische zoutbrug vormt tussen de sterke negatieve ladingen op het filter en de negatieve ladingen op het DNA. Residuele onzuiverheden worden verwijderd door te wassen met ethanol.

Water of een buffer met een laag zoutgehalte wordt aan de column toegevoegd om het DNA eruit te "elueren" of te bevrijden, vermoedelijk door de kationische brug te verbreken. Het DNA is nu gezuiverd van de gel.

De eerste stap in de procedure voor gelzuivering omvat het gieten van de agarosegel en het uitvoeren van elektroforese van de DNA-monsters. Zodra de gelrun is voltooid, worden de gewenste DNA-fragmenten gevisualiseerd onder UV-licht en worden fragmenten geselecteerd na vergelijking met een moleculaire gewichtsstandaard.

Als de gel niet is gekleurd, kan de locatie van de band bij benadering worden bepaald op basis van een vergelijking met de DNA-ladder. Bij het uitsnijden van de gel met een scheermes moet men er zorg voor dragen zoveel mogelijk DNA te herwinnen met zo min mogelijk agarose.

Bij het hanteren van met ethidiumbromide gekleurde gelen en bij het werken voor UV-licht moeten handschoenen en een beschermende bril worden gebruikt. Na het uitsnijden van het gewenste DNA uit de gel moeten de gel en de loopbuffer correct worden afgevoerd, in overeenstemming met de institutionele veiligheidsprotocollen.

Zodra het fragment is geïsoleerd, wordt het stukje gel in een microcentrifugebuisje geplaatst en op een balans gewogen. Uitgaande van de benadering dat 100 mg gel een volume van 100 µL inneemt, wordt een volume solubilisatiebuffer dat 4X het gewicht van de gel bedraagt, aan het stukje gel toegevoegd. Na plaatsing in de buffer wordt het stukje gel geïncubeerd bij rond 50 °C om de agarose te smelten.

Zodra de gel is gesmolten, wordt de gesolubiliseerde gel op een spincolumn overgebracht en wordt de oplossing gecentrifugeerd, waardoor al het DNA en andere partikels aan het filter blijven kleven.

Vervolgens wordt het gebonden DNA gewassen door 70% ethanol aan het filter toe te voegen, gevolgd door centrifugatie, wat resterende onzuiverheden uit het filter verwijdert. De doorstroomvloeistof wordt weggegooid en deze wasstap wordt over het algemeen tot drie keer herhaald. Het lege filter wordt opnieuw gecentrifugeerd om resterende ethanol te verwijderen, waarna het silicafilter aan de kamertemperatuur mag drogen. Water of elutiebuffer wordt aan het filter toegevoegd en na nog een ronde centrifugatie wordt het gezuiverde DNA onderin de buis opgevangen.

De methode die u zojuist heeft gezien, is van toepassing op gelzuivering met silica spincolumnfilters. Er bestaan andere methoden die gebruikmaken van dezelfde basisprincipes van DNA-binding aan silica, gevolgd door was- en elutiestappen. Silica kan bijvoorbeeld worden gemengd met DNA in een suspensie die "glassmilk" wordt genoemd, welke kan worden gepellet en gewassen, en later geëlueerd. Ook kan zuiging worden gebruikt om DNA door silicafilters te trekken en dit later te elueren. Zorg ervoor dat u de gelzuiveringsprocedures van uw laboratorium begrijpt.

Nu u heeft geleerd hoe u DNA uit agarosegels kunt terugwinnen, bekijken we een paar downstream-toepassingen die gebruikmaken van DNA verkregen via gelzuivering.

Gelzuivering is bijvoorbeeld een tussenstap bij chromatinimmunoprecipitatie, een techniek die erop gericht is de regulerende eiwitten te isoleren die genomisch DNA bundelen, om vast te stellen welke sequenties worden gereguleerd. De geïsoleerde fragmenten worden via gelzuivering gezuiverd en gesequenced, om vervolgens in kaart te worden gebracht op de individuele chromosoomregio's.

Subklonering - het proces waarbij een gen van de ene vector naar een andere wordt overgebracht - kan gelzuivering omvatten. Zo kunnen gensequenties uit een vector worden uitgeknipt via digestie uit een construct en via PCR worden samengevoegd tot chimerische sequenties, waarna ze via gelzuivering worden gezuiverd en in andere constructen worden geplaatst.

Wellicht de eenvoudigste toepassing van gelzuivering is het gebruik ervan na langdurige bewaring bij -80 ˚C van uitgesneden DNA-banden na elektroforese.

U heeft nu geleerd hoe u DNA-fragmenten uit agarosegel kunt extraheren, wat de variaties zijn in de bind-, was- en elutieprocedures op basis van individuele gebruikersvoorkeuren, en tot slot wat de mogelijke downstream-toepassingen van deze methode zijn. Zoals altijd, bedankt voor het kijken.