Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Het algemene doel van deze procedure is om een omgekeerde mal te printen om patroonhoudende twee componenten hydrogels voor 3D celkweek te maken. Dit wordt bereikt door eerst een omgekeerde mal te printen van een thermo reversibel polymeer, dat bij vier graden Celsius vloeibaar is, maar bij kamertemperatuur een zachte gel is. Deze omgekeerde mal kan later worden geëlueerd.

De tweede stap is om de omgekeerde mal te vullen met een biopolymeer naar keuze. Hier gebruikten we aros. Het biopolymeer kan worden verkocht door enzymatisch, UV of temperatuurverbinding.

Vervolgens wordt de omgekeerde mal geëlueerd door de mal onder te dompelen in koud water. Na deze stap is de resulterende AROS mal klaar voor verdere verwerking. De laatste stap is om de holtes te vullen met een tweede biopolymeer, dat cellen kan bevatten en kan worden verkocht door middel van enzymen, UV-licht of temperatuur.

Uiteindelijk hebben we een reproduceerbare methode ontwikkeld om ruimtelijk georganiseerde D-celkweekschalen te maken. We hadden het idee voor deze methode toen een collega suggereerde dat we gebruik zouden kunnen maken van de thermo responsieve eigenschappen van Oxr door het als een opofferende mal te gebruiken. Het demonstreren van de procedure zal Misha Muah zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Om te beginnen voegt u 60 milliliter ijskoude PBS-oplossing toe aan een glazen fles en roer krachtig met een magnetische roerder. Weeg vervolgens 24,5 gram Paul ER af en voeg het in kleine hoeveelheden toe aan de koude PBS. Wacht tot de Paul Oxr gedeeltelijk is opgelost in de PBS voordat u er meer aan toevoegt.

Blijf de oplossing roeren totdat alle Paul Oxr is opgelost. Voeg vervolgens extra ijskoude PBS toe tot een eindvolume van 100 milliliter is bereikt, waardoor een eindconcentratie van 24,5% gewicht per volume ontstaat. Roer vervolgens het mengsel tot het goed gemengd is.

Stop met roeren van de oplossing en laat deze overnacht rusten bij vier graden Celsius totdat de bellen en schuim in de oplossing zijn verdwenen. Bellen die in de gel zijn vastgehouden, worden overgebracht naar de printercartridge en zullen leiden tot defecten in de gedrukte opofferende mallen. Filter de oplossing direct in de printcartridge met behulp van een voorgekoelde filter om ongewenste deeltjes te verwijderen die de naald kunnen verstoppen.

Bewaar de cartridge bij vier graden Celsius tot 30 minuten voor het experiment. Bereid de magneetventiel en naald voor op het printen door ze in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter te plaatsen, gevuld met ultrapuur water, en ze 30 minuten te synthetiseren. Spoel vervolgens de gereinigde kleppen af met ethanol en droog ze af met een stikstofpistool.

Installeer vervolgens de schone magneetventiel en naald in de printer. Installeer ook een lege schone printcartridge om het systeem te testen. Breng druk van drie bar aan op het systeem en blaas eventuele restvloeistoffen uit het geïnstalleerde ventield en de naald met perslucht.

Voor kleine naaldameters. Installeer een filter bij de uitgang van de perslucht om binnendringen van kleine deeltjes die de naald kunnen verstoppen te voorkomen. Zet vervolgens de druk uit.

Wanneer de druk tot nul is gedaald, installeert u de voorgeladen cartridge met poly oxr. De cartridge moet ongeveer 30 minuten voordat de cartridge wordt gemonteerd uit de koelkast worden gehaald, zodat de nog vloeibare poly oxr kamertemperatuur en gel kan bereiken voordat het wordt afgedrukt. Controleer of de poly oxr is geleid door de cartridge om te draaien.

Breng vervolgens druk van drie bar aan op het systeem en doseer Paul Emer totdat deze de naaldtip bereikt en in een continue draad wordt uitgedrukt. Gebruik de bio CAD-software om een enkele lijn te tekenen met ongeveer dezelfde lengte als de structuur die u in de printer wilt afdrukken in het menu voor printersoftware-instellingen. Stel de magneetventiel in op een hoge frequentie van 50 hertz in het parametergedeelte en pas de hogedrukinstelling handmatig aan op drie bar.

Stel vervolgens een glazen microscoop in de printer en zet deze op zijn plaats door de vacuüm aan te zetten. Druk vervolgens één laag van een enkele lijn af met een trapelingsnelheid van 300 millimeter per minuut. Bereik de gewenste lijnbreedte door de druk met de hand te verminderen en de frequentie-instellingen in de software voor elke nieuwe lijn te verlagen, zorg ervoor dat de lijn continu blijft.

Als de getekende lijn is gebroken, is de ondergrens bereikt. Zodra een continue lijn met de gewenste breedte is bereikt, bepaalt u de optimale trapelingsnelheid en laagdikte door defecten in de gedrukte constructies te controleren. Om de laagdikte te verfijnen, kunnen de druk en frequentie ook lichtjes opnieuw moeten worden aangepast.

Om de instelling van de laagdikte te testen, drukt u verschillende lagen op elkaar en controleert u of de naald in de juiste positie boven de vorige laag staat. Pas de laagdikte aan zodat elke laag direct op de vorige wordt afgedrukt. Om de trapelingsnelheid te optimaliseren, begint u door de trapelingsnelheid stapsgewijs te verlagen van 300 millimeter per minuut, zodat de uitgedrukte lagen beginnen en eindigen op dezelfde posities als de vorige.

Als de trap te snel beweegt, zal er een golfachtig patroon op de bovenkant van de laag verschijnen. Voor het afdrukken van pilaarstructuren, tekent u een enkel punt in plaats van een lijn in de CAD-software. Stel vervolgens de druk en frequentie fijn af om de laagdikte en pilaardikte te reguleren en de stappentijd van de printkop om de afdruksnelheid te maximaliseren.

Nadat u de parameters hebt geoptimaliseerd, slaat u deze op voor later gebruik. Druk eerst de binnenstructuur zoals deze pilaararray af op een glazen microscoopglaasje en laat het drogen. Droogte overnacht verkleint de grootte en dikte van de structuren en zorgt voor een betere hechting tussen de structuur en het substraat.

De volgende dag tekent u een structuur die bestaat uit een buitenwand die de structuren omringt die u wilt laten elueren en vullen. De polymeerwand moet ten minste 3,5 millimeter van de binnenstructuren worden afgedrukt vanwege de a