Name: Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer microglia kweken uit het neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel van muizen. Deze methode isoleert primaire cellen binnen 90 minuten en behoudt hun rustende toestand voor nauwkeurig onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen de leden van de Tsirka lab bedanken voor hun advies en behulpzaam opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door R01NS42168 naar SET, 12PRE12060489 aan RB, een NSF-3MT IGERT en een Turner Proefschrift fellowship aan LT, en NSF-3MT IGERT te JCN.

1. Dissectie (Dag 0) <ol><li> Induceren anesthesie aan p0-2 muis pups met onderkoeling. Veeg de hoofden van de pups met een Kimwipe gedrenkt in 70% ethanol om het weefsel te desinfecteren. </li><li> Verwijder de koppen met een schaar, met 4 pups per 10 cm petrischaal. Plaats de hoofden in een petrischaaltje met buffer ijskoude Hank&#39;s. </li><li> Veranker de koppen met gebogen pincet door de oogkassen en verwijder voorzichtig de huid die de schedel met rechte microforceps. </li><li> Verwijder de schedelbeenderen met rechte microforceps, met behulp van voorzichtigheid om niet doorboren of beschadiging van de cortex. De meest effectieve manier is om de verwijdering te beginnen bij het cerebellum, dat zich aan de voet van de kop, omdat dit gebied worden genegeerd beginnen. </li><li> Verwijder de hersenen met een kleine spatel, en plaats de (4) hersens in een frisse petrischaaltje met buffer ijskoude Hank&#39;s. </li><li> Alle stappen vanaf dit moment benutten microforceps en worden uitgevoerd onder een dissectie microscoop. Beginnend op de ventrale kant van de hersenen, het weefsel verankeren van die van het cerebellum en maak twee kleine insnijdingen aan weerszijden van de middenhersenen. Wees voorzichtig niet om helemaal te snijden door het weefsel, zoals de cortex hebben betrekking op de middenhersenen in deze regio. </li><li> Zachtjes plagen de middenhersenen en de kleine hersenen in een stuk van de twee cortex. De twee cortex zou een concave vorm. </li><li> Scheid de twee cortex en oriënteren een enkele cortex met de mediale zijde voor verdere dissectie. De hippocampus is moeilijk waar te nemen, maar het ligt tegenover de bulbus olfactorius die verschijnt als een klein knobbeltje op het puntige uiteinde van de cortex. </li><li> Verwijder de hippocampus, die een halve maan-vorm heeft. Flip de cortex naar de dorsale zijde bekijken. </li><li> Gebruik van de bulbus olfactorius als uitgangspunt, verwijder alle meninges en de bulbus olfactorius zich van de cortex. </li><li> De ontleed cortex moet in 15 ml conische buizen geplaatst worden met 14 ml van colDe d Hank gebufferde zoutoplossing op ijs. </li></ol> 2. Cel Cultuur (Dag 0) <ol><li> Grondlaag 10 cm weefselkweek schalen met 5 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL) verdund in geautoclaveerd water gedurende 3 uur bij 37 ° C. </li><li> Aspireren PDL, en wassen platen eenmaal met geautoclaveerd water. Droge plaat onder de UV in de weefselkweek kap voor 20 minuten. Deze stap moet alleen worden verricht voorafgaand aan de dissectie proces. </li><li> Aspireren Hank&#39;s buffer van buisjes die de cortex van 4 hersens elk, gelden 4 ml 1x trypsine / EDTA-oplossing, vermaal weefsel met p1000 tip, en plaats buizen in 37 ° C incubator gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 4 ml van complete microglia media per buis aan de enzymatische spijsvertering, mix, stop en spin down inhoud op 1.5K rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren supernatant en herhaal wassen met 4 ml van complete media. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet microgliale medium (DMEM met 10% FBS, 1% natrium pyruvaat, 0.08% gentamycine) en filtreer door een 40 micron mesh cel zeef. </li><li> Plaat bij een dichtheid van 8 cortex per 10 ml in een 10 cm weefselkweek plaat en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (zie Adult Microglia protocol). </li></ol> (Dag 3) <ol><li> Verander media in alle celkweek gerechten met volledige microglia media. </li></ol> (Dag 10) <ol><li> Voeg 400 microliter 60 mM lidocaïne in HBSS (tot microglia los) in medium 10-cm weefselkweek platen en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10-15 minuten. </li><li> Verzamel de media / celsuspensie van de plaat, en een keer was de plaat met buffer Hank&#39;s. Verzamel de wasbuffer om de resterende microglia herstellen. </li><li> Voeg 5 mM EDTA (pH 8,0) aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 50 uM of een 1/100 verdunning. </li><li> Spin down celsuspensie bij 1000 xg (1500 rpm) gedurende 5 min en resuspendeer in 1 ml DMEM met 1% FBS. </li><li> Tel het aantal levensvatbare cellen (zoals per volwassene Microglia 3.1/3.2) en splitsen cellen in weefselkweek platen bij de gewenste experimentele dichtheid. Ongeveer 1x10 6 microglia worden geoogst van een 10 cm plaat met de cortex van 4 hersenen. Voor immunofluorescentie, is een dichtheid van 2.5x10 4 cellen per 18 mm dekglaasje aanbevolen. </li><li> Laat minstens 24 uur voor microgliacellen vooraf volledig terugkeren naar hun vertakte, rusttoestand te gebruiken. </li></ol> Protocol Tekst: (Adult Microglia) 1. Tissue Collection <ol><li> Coat weefselkweekplaten met Poly-D-Lysine (PDL) gedurende 3 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. Was de plaatjes een keer met geautoclaveerd water onmiddellijk vóór gebruik. </li><li> Euthanaseren muis door CO 2 stikken en gaan na of euthanasie is voltooid. Reinig ruggenmerg met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een schaar snijden de huid op de top van het ruggenmerg, dan overgaan tot het ruggenmerg geknipt uit regio T1 tot T12. Snijdende resterende spier uit van de zijden van het ruggenmerg. </li><li> Langzaam snijd de wervels met microscissors als je houd het ruggenmerg zachtjes met je vingertoppen. Wees voorzichtig niet te doorboren het ruggenmerg als het weefsel is erg zacht. Extract langzaam het ruggenmerg met behulp microforceps. </li><li> Dompel het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude HBSS. Met behulp van een lichtmicroscoop verwijder alle zichtbare hersenvliezen behulp microforceps </li><li> Snijd het ruggenmerg in transversale segmenten klein genoeg om meerdere fragmenten te genereren. De dikte van de fragmenten niet meer dan 2 mm zijn om efficiënte spijsvertering. Breng het ruggenmerg stukken aan een 15 ml conische buis met 1 ml ijskoude HBSS. Houd de buis op ijs tot de spijsvertering stap. </li></ol> 2. Vertering van Tissue <ol><li> Aspireren HBSS van 15 ml conische buis met ruggenmergweefsel. Wees voorzichtig om geen stukje weefsel te zuigen. </li><li> Voeg 1 ml van trypsine (2.5 g / L bestraalde varkens trypsine en 0,2 g / L EDTA in HBSS) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Om te stoppen met de spijsvertering verwijder de trypsine en voeg 3 ml van de primaire microglia medium dat serum om de enzymatische afbraak te stoppen bevat. </li><li> Pipet op en neer om het weefsel te verwijderen. Filter de celsuspensie met behulp van een 40 um cel zeef. </li></ol> 3. Cel Tellen en Plating <ol><li> Meng gelijke hoeveelheid celsuspensie en DAPI oplossing. </li><li> Telling cellen met een hemocytometer. </li><li> Plaat bij een dichtheid tussen 5-7x10 5 cellen / ml in PDL-gecoate 35 x 10 mm schalen. Plating een lagere dichtheid voorkomen celgroei zelfs wanneer cellen werden gekweekt in platen met 12 putjes die een kleiner gebied moeten tegen 35 x 10 mm schalen. </li></ol>

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Physiology%3A+Unique+Stimuli%2C+Specialized+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Env.+Res.+Pub.+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li>
<li>Emmetsberger, J., Tsirka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inhibitory+factor+%28MIF%2FTKP%29+mitigates+secondary+damage+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury.</a> Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).</li>
<li>Gao, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+MS+Reveal+Multiple+Roles+of+Microglia+in+Disease+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis.</a> Neurol Res. Int. , 383087(2011).</li>
<li>Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4R%2B+microglia+drive+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2X4R+ microglia drive neuropathic pain.</a> Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).</li>
<li>Olson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+by+microglia+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune response by microglia in the spinal cord.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).</li>
<li>Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li>
<li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li>
<li>Brannan, C. A., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia+from+adult+mice+are+refractory+to+nitric+oxide-inducing+stimuli+due+to+impaired+NOS2+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression.</a> Glia. 48, 120-131 (2004).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> J. Vis. Exp. (66), e3814(2012).</li>
<li>Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293(2013).</li>
<li>Tremblay, M. -È, Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Comm.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li>
<li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expt.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li>
<li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li>
<li>Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia%3A+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li>
<li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14(2012).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia moduleren CNS normale werking en ontstekingsreacties verschillende pathologieën. Functionele synaptische remodeling door microglia is betrokken bij het ​​handhaven van normale hersenen homeostase 15. Tijdens de neurogene cascade zij deelnemen aan de klaring van neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 4, 16. Daarom is het noodzakelijk om een ​​kweeksysteem waarin neonatale en volwassen microglia, waarvan de grote strook van en volwassen, gedurende welke microglia meerder...

Microglia vormen de bewoner immune cellen van het CNS, de meeste overeenkomst vertonen perifere macrofagen in structuur en functie 1. Het is onlangs aangetoond dat postnatale microgliale cellen afkomstig uit primitieve myeloïde progenitoren en worden gegenereerd voordat de achtste embryogenese, upending de vorige idee dat postnatale hematopoietische voorlopers zijn de bron van microglia in de volwassen hersenen 2. Zij spelen belangrijke rollen in verscheidene neurologische ziekten en kunnen snel inspelen op infectie of letsel door het vrijgeven van pro-inflammatoire of anti-inflammatoire cytokines 3. Aldus omvatten microglia een zelfstandige eenheid in het CZS kan worden gemanipuleerd ziekteprogressie beïnvloeden. Ontwikkelen van robuuste, reproduceerbare methoden het isoleren en kweken neonatale of volwassen microgliale cellen belangrijk voor toekomstige studies. Microglia is bekend kritisch spelers in een aantal hersenen pathologieën. Recenter roles zijn in opkomst voor de cellen in de normale ontwikkeling van de hersenen en de functie als microglia fagocyteren overtollige neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 1, 4. Microglia kan ook moduleren verschillende neurologische aandoeningen die het ruggenmerg beïnvloeden, zoals MS, neuropathische pijn, en dwarslaesie 5-7. Ruggenmerg microglia reageren verschillend tegenover hersenen microglia in response op activering signalen 8, 9, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in de lokale omgeving. Dus is het belangrijk een geschikte stand in vitro systeem voor cultuur en studie ruggenmerg microglia. Neonatale microglia tot significant meer van de pro-inflammatoire cytokine stikstofoxide dan bij volwassen cellen na in vitro stimulatie met IFN-γ en TNF-a 10,11 verder benadrukt dat volwassen cellen gebruiken om microglia bestuderen in de context van bepaalde ziekten. Het protocol we gebruiken in het lab te culture neonatale microglia is een variant van recente methoden die gebruik schudden van gemengde gliale culturen in een poging om de microglia van het oppervlak van de celkweek kolf 12 verwijderen. Ook beschrijven we een methode om cultuur microglia van de volwassen muis ruggenmerg gebaseerd op een protocol eerst beschreven door Yip, et al. 13. Deze methode levert een snellere manier om de cultuur volwassen cellen in vergelijking met andere beschikbare protocollen 14. De resulterende voorbereiding is 70% microglia, de overige percentage bestaat uit astrocyten. Hoewel de zuiverheid van onze cultuur is lager in vergelijking met andere gepubliceerde methoden 13, dit kweeksysteem is nuttig voor het verkennen van microglia in kweek reactie op diverse activerende stimuli en voor de studie van ziekten die vooral invloed het ruggenmerg en die een sterke ontstekingsreactie is een van de hoofdkenmerken. Al de beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Stony Brook University IACUC.

<table><tbody><tr><td>EDTA, 5mM</td><td>Invitrogen</td><td>15567-028</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine, 60mM</td><td>Sigma</td><td>L-5647</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1X</td><td>Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>Cellgro</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfaat</td><td>Biowittaker</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10mm weefselkweekschaal</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 100 &mu;g/ml</td><td></td><td></td><td>Verdun 1:20</td></tr><tr><td>HBSS, 1X</td><td>Cellgro</td><td>20-023-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

kweken microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia vormen de resident macrofaag-achtige cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en, als zodanig, zijn kritisch belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen zoals CNS rijping in ontwikkeling, multiple sclerose en ruggenmergletsel. Microglia kan worden geactiveerd en aangeworven om actie van neuronale verwonding of stimulatie, zoals axonale schade gezien in MS of ischemische hersentrauma als gevolg van een beroerte. Deze immunocompetente leden van het CZS zijn ook gedacht aan rollen in synaptische plasticiteit onder niet-pathologische omstandigheden. We gebruiken protocollen voor het kweken microglia van de neonatale en volwassen weefsels die bedoeld zijn om het aantal levensvatbare cellen te maximaliseren terwijl het minimaliseren verstorende variabelen, zoals de aanwezigheid van andere CNS celtypes en celkweek vuil. We maken gebruik van grote en duidelijk herkenbaar CNS componenten (bijv. cortex, ruggenmergsegmenten), die het gehele proces haalbaar en reproduceerbaar maakt. Het gebruik van volwassen cels is een geschikt alternatief voor het gebruik van neonatale hersenen microglia, zoals veel ziekten bestudeerde vooral invloed de postnatale ruggenmerg. Deze kweeksystemen zijn ook bruikbaar voor het effect van verbindingen die ofwel kunnen remmen of bevorderen microgliale activering direct testen. Aangezien microgliale activering de resultaten van ziekte kan vormen in het volwassen CZS, is er een behoefte in vitro systemen waarin neonatale en volwassen microglia kunnen worden gekweekt en onderzocht.

<html> Een voorbeeld van rustende en geactiveerde microgliale cellen wordt getoond in figuur 1. De microglia werden gevisualiseerd 24 uur na plating (figuur 1a) en vertonen wijdvertakt (rust) morfologie. Blootstelling aan de priming reagens bacterieel lipopolysaccharide (LPS) resulteert in veranderingen in de morfologie microglia cellen geactiveerd worden (Figuur 1b). Een voorbeeld van het tellen van de cellen voor plating is weergegeven in <...

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van primaire microgliale cellen uit de cortex van pasgeboren muizen of uit het ruggenmerg van een volwassen muis. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van een muizenpuip van nul of twee dagen na de geboorte, of het ruggenmerg van een volwassen muis te verwijderen. Vervolgens worden de cortices geoogst uit het neonatale weefsel of wordt het ruggenmergweefsel gedigesteerd.De corticale en spinale weefselcellen worden vervolgens gekweekt tot aan het experimentele gebruik. Uiteindelijk kunnen de geoogste neonatale en volwassen microgliacellen worden geanalyseerd met immunofluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van ons neonatale microgliacultuurprotocol ten opzichte van bestaande methoden, zoals het schudden van microgliacellen voor gemengde corticale platen, is dat cellen gemakkelijk terugkeren naar een rusttoestand en een nauwkeuriger beeld kunnen geven van het gedrag van microgliacellen in vivo.Het belangrijkste voordeel van het kweken van microglia uit het spinale merg van volwassenen is dat de cellen bestudeerd kunnen worden in de context van pathologieën die voornamelijk het volwassen centrale zenuwstelsel aanta

culturing-microglia-from-the-neonatal-and-adult-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Wij beschrijven een gemodificeerd hot waterige fenol extractie werkwijze voor het zuiveren lipopolysaccharide (LPS) van Gram-negatieve bacteriën. Afgetapt kan de LPS vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE en gevisualiseerd door directe kleuring of Western immunoblot.

Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Leer microglia kweken uit het neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel van muizen. Deze methode isoleert primaire cellen binnen 90 minuten en behoudt hun rustende toestand voor nauwkeurig onderzoek.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Meer video's verkennen