Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie
October 9th, 2013
De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.
Het algemene doel van deze procedure is om de verschillende soorten cellen in de testikels te scheiden. Eerst oogst u een gemengde populatie cellen van de muis. De testikels laden de cellen en BSA-gradient in het stay put-apparaat.
Laat de cellen nu sedimenteren door de BSA-gradient. Verzamel vervolgens de fracties en combineer ze op basis van celsamenstelling. Uiteindelijk wordt snelheidssedimentatie met de stay put gebruikt om verschillende soorten cellen uit de testikels te scheiden op basis van verschillen in grootte en dichtheid.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals facts, is dat men grote hoeveelheden verschillende celtypen met redelijk hoge zuiverheid kan isoleren met behulp van eenvoudige glazen apparatuur en zwaartekracht. Bevestig de twee, tweeduizendlitercilinders en de celbelastingkamer aan het bovenste platform en verbind alles met twee kleine stukken slang met slangklemmen. Klem alle buizen dicht en verzegel de tuit op de twee liter cilinder aan de rechterkant.
Plaats een kleine roerder in de celbelastingkamer en een grotere roerder in de linker tweelitercilinder. Plaats vervolgens de tweeliter sedimentatiekamer op het platform. Plaats de metalen schot rechtstreeks boven de opening in de bodem van de sedimentatiekamer om vortexing van de vloeistof en verstoring van de celgradient tijdens fractie-inzameling te voorkomen.
Plaats nu het deksel op de sedimentatiekamer. Breng een zeer kleine hoeveelheid vacuümvet aan op de geschliffeerde verbinding van de driewegkraan. Klem vervolgens de kraan op de bodem van de sedimentatiekamer, waarbij de geschliffeerde verbindingen van de kraan en de sedimentatiekamer worden verbonden.
Verbind vervolgens de celbelastingkamer met de rechter uitlaat van de kraan met slangen. Sluit de kraan, bevestig vervolgens de cellfractioneringsslang aan de linker uitlaat van de kraan en klemp de kleine buis helemaal onderaan. Giet de 2%BSA-oplossing in de linker tweelitercilinder.
Pour de 4%BSA-oplossing in de rechter tweelitercilinder. Zorg ervoor dat er geen grote bubbels zijn in de slang die deze cilinders verbindt. Giet Krebs-buffer in de celbelastingkamer en vul de slang die deze kamer met de sedimentatiekamer verbindt.
Controleer of er geen grote bubbels zijn die het gradient kunnen verstoren. Knijp of sla de slang voorzichtig om de bubbels te verwijderen indien nodig. Bevestig dat alle crebs in de buis zit en niet in de celkamer.
Laat een kleine hoeveelheid Krebs-buffer in de sedimentatiekamer stromen. Tap vervolgens bijna alle buffer af in de cellfractioneringsbuis. Om de buis te vullen en eventuele grote bubbels te verwijderen, plaats de fractiecollector direct onder de sedimentatiekamer.
Controleer of alle fractiebuizen op hun plaats zitten en bedek ze met plasticfolie om besmetting te voorkomen. Decapsider de testikels in een aparte plaat met acht milliliter Krebs. Maak een insnijding in het dunne membraan dat de seminifere tubuli omringt met een paar pincetten.
Houd het membraan nu met een ander paar pincetten vast. Duw de tubuli uit en weg van het membraan. Breng vier milliliter Krebs met de tubuli over naar elke conische buis met 25 milliliter collageenase-oplossing.
Schud 10 minuten op 33 graden Celsius totdat de tubuli een spaghettiachtig uiterlijk krijgen. Laat de tubuli vervolgens vijf minuten naar de bodem van de buis zakken. Giet de supernatant en was twee keer met 25 milliliter Krebs op kamertemperatuur, waarbij de tubuli elke keer naar de bodem van de buis zakken.
Laat ongeveer vijf milliliter Krebs in elke buis. Na incubatie van de tubuli met trypsine. Gebruik een pijp met een brede opening om de oplossing met de tubuli te agiteren.
Pipetteer ze ongeveer 10 keer in en uit. De oplossing moet er meer uitzien als een enkele celsuspensie. Filtreer nu elke 30 milliliter enkele celsuspensie door een cellezaaifilter met een maaswijdte van 100 micron.
Na het combineren van de celsuspensies, telt u het totale aantal cellen. Zorg ervoor dat de kraan zo is geplaatst dat de stroom van de celkamer naar de sedimentatiekamer wordt geleid. Zet beide roerplaten op een lage stand.
Giet vervolgens de celsuspensie in de celkamer. Open de kraan zodat de cellen langzaam met een snelheid van 10 milliliter per minuut in de sedimentatiekamer stromen. Sluit vervolgens de kraan om de cellen uit de celkamer te spoelen.
Pour vijf milliliter 0,5% BSA-oplossing en tappen in de sedimentatiekamer met een snelheid van 10 milliliter per minuut. Sluit de kraan en herhaal de BSA-was nog vier keer. Open nu de klemmen tussen de celkamer en de twee tweeduizendcentimetercilinders om de vloeistof onmiddellijk in de sedimentatiekamer te tappen met een snelheid van 40 milliliter per minuut, pas de stromingssnelheid aan zodat het ongeveer 20 tot 30 minuten duurt om de BSA-gradient in de sedimentatiekamer te laden.
Controleer op een dunne ongestoord laag cellen die op de BSA-gradient liggen. Zodra het meeste BSA is geladen, sluit u de kraan en draait u deze naar de positie waardoor de vloeistof uit de sedimentatiekamer in de fractioneringsbuis kan lopen. Schakel nu de roerplaten uit en laat de cellen een uur en 45 minuten sedimenteren.
Nadat de sedimentatie is voltooid, bevestigt u de fractiebuis aan de fractiecollector. Pas de stromingssnelheid aan met de kraan zodat er elke 45 seconden 10 milliliter per collectiebuis wordt verzameld. Zodra alle fracties zijn verzameld, analyseert u de fracties microscopisch voor verschillende celpopulaties.
Verschillende celtypen kunnen worden onderscheiden op basis van celgrootte en nucleaire morfologie om de zuiverheid van elke fractie te bepalen. Breng 10 microliter DPI-gekleurde cellen over op een dia. Plaats een dekglas en analyseer met een fluorescentiemicroscoop.
Trek de fracties die qua grootte en nucleaire morfologie vergelijkbaar zijn om populaties cellen te creëren. Een typische bereiding van ongeveer 22 testikels. Met deze stay put-procedure levert ongeveer 10 tot de achtste cel.
Perper metagene celtypefracties kunnen snel worden geanalyseerd met behulp
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De STA-PUT-methode maakt de scheiding mogelijk van verschillende populaties van spermatogene cellen op basis van grootte en dichtheid. Deze techniek is essentieel voor het isoleren van specifieke celtypen uit de teelballen voor verdere analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Reproductieve biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van spermatogenese is cruciaal voor de reproductieve gezondheid.
- Verschillende celtypen in de teelballen hebben verschillende rollen en kenmerken.
- Scheidingstechnieken verbeteren de studie van deze celtypen.
- De STA-PUT-methode maakt gebruik van grootte- en dichtheidsverschillen voor celscheiding.
Doel van het onderzoek
- Om verschillende populaties van spermatogene cellen te isoleren.
- Om het begrip van de celsamenstelling in de teelballen te verbeteren.
- Om verder onderzoek naar spermatogene celfuncties te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Oogsten van gemengde populaties van cellen uit muis-teelballen.
- Cellen en BSA-gradiënt in de STA-PUT-apparatuur laden.
- Cellen laten sedimenteren door de BSA-gradiënt.
- Fracties verzamelen en combineren op basis van celsamenstelling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle scheiding van verschillende soorten spermatogene cellen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de STA-PUT-methode.
- Identificatie van celpopulaties op basis van grootte en dichtheid.
- Mogelijke toepassingen voor verdere studies over spermatogenese.
Conclusies
- De STA-PUT-methode is een betrouwbare techniek voor celscheiding.
- Deze methode verbetert het begrip van de diversiteit van spermatogene cellen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op de bevindingen van deze studie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient separation of spermatogenic cell types is critical for dissecting the molecular mechanisms underlying mammalian spermatogenesis, a process not yet recapitulated in vitro. The STA-PUT velocity sedimentation method enables high-yield, scalable enrichment of distinct testicular cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in reproductive biology pipelines. This capability is particularly valuable for R&D teams lacking access to advanced cell sorting infrastructure, facilitating robust target validation and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific pathways in spermatogenesis using enriched populations.
- Supports biological de-risking by isolating functionally distinct germ cell stages for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation by providing sufficient cell numbers for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched cell fractions for quantitative and reproducible assay development.
- Supports assay standardization by enabling consistent isolation of defined cell types across experiments.
- Delivers high-yield outputs suitable for scalable compound screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cell populations for translational biomarker discovery in reproductive biology.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation by supplying primary cells for functional studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by allowing precise cell-type attribution of observed effects.
Pipeline & Workflow Integration
The STA-PUT method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially where in vitro differentiation systems are lacking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific spermatogenic stages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell fractions for downstream functional assays.
- Analytics: Enables measurement of cell-type specific markers and outputs via microscopy and immunoblotting.
- Translational Research: Supplies primary cell populations for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, equipment-light solution adaptable across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive target validation.
- Operational Value: Delivers high-yield, reproducible cell fractions using accessible instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in testis dissection, cell handling, and gradient sedimentation.
- Needs specialized but widely available glassware and cold-room or large refrigerator access.
- Demands cross-team standardization for fraction collection and purity assessment.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species.
- Fraction purity is moderate; downstream validation (e.g., microscopy, immunoblotting) is essential.
