De Western blot

Western blotting is een krachtige techniek die door veel onderzoekers wordt gebruikt om de aanwezigheid van specifieke eiwitten in een elektroforetisch gescheiden monster aan te tonen met behulp van antilichamen.

Er zijn 3 hoofdfases van deze techniek die essentieel zijn voor een kwaliteitsresultaat: electroblotting, immunoblotting en detectie. Voordat deze fasen worden uitgevoerd, moet SDS-PAGE worden verricht, waarbij gedenatureerde eiwitten op grootte worden gescheiden in een polyacrylamidegel.

Electroblotting, ook wel de Western-“transfer” genoemd, vereist een transfercassette om de “sandwich” bij elkaar te houden, evenals een apparaat om eiwitten van een acrylamidegel over te brengen naar een dun membraan. De electroblotting-sandwich bestaat uit de gel en een gespecialiseerd membraan, ingeklemd tussen twee stukken filterpapier. Tijdens de transfer wordt een elektrisch veld gebruikt om de eiwitten door de gel te bewegen, waarna ze door geladen en hydrofobe interacties in het membraan worden vastgehouden.

Immunoblotting maakt gebruik van antilichamen om het membraan te “sonderen” op specifieke eiwitten. Antilichamen zijn grote Y-vormige eiwitten die twee fragmenten bevatten, ook bekend als Fab-regio's, die binden aan andere eiwitten. De Fab-regio bepaalt het specifieke epitoop, of het specifieke deel van een eiwit, waaraan een antilichaam zal binden.

Monoklonale antilichamen zijn antilichamen die één enkel epitoop herkennen en zijn vanwege hun specificiteit het geprefereerde type antilichaam voor immunoblotting. In contrast hiermee zijn polyklonale antilichamen een reeks verschillende antilichamen die veel epitopen op hetzelfde antigeen targeten – of het eiwit waarvoor een antilichaam specificiteit heeft. Monoklonale antilichamen die een lineair epitoop herkennen hebben de voorkeur, omdat dit garandeert dat het epitoop gevonden kan worden op een gedenatureerd, of gelineariseerd, eiwit. Dit is belangrijk omdat veel antilichamen alleen conformationele epitopen herkennen, wat betekent dat ze eiwitten uitsluitend in hun natuurlijke 3D-toestand herkennen.

Naast Fab-fragmenten bevatten antilichamen een Fc-regio, die specifiek is voor het dier dat het antilichaam heeft geproduceerd. Bij immunoblotting wordt deze regio hoofdzakelijk gebruikt als epitoop voor een secundair antilichaam – een antilichaam dat het eerste antilichaam herkent dat gebonden is aan het eiwit dat men probeert te detecteren.

Om een waarneembaar signaal te genereren, zijn antilichamen vaak via hun Fc-regio gekoppeld aan een reporterenzym, zoals alkalische fosfatase of mierikswortelperoxidase. Deze reporterenzymen produceren signalen door te reageren met substraten, wat leidt tot kleurveranderingen of lichtveranderingen.

Deze veranderingen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd met densitometrie. Densitometrie is de techniek die wordt gebruikt om de dichtheid van een eiwitband te meten met behulp van beeldanalyse-software om de densiteit van elke band te berekenen. De banden kunnen vervolgens direct worden gekwantificeerd met behulp van referentiestandaarden of intern worden gecontroleerd met een controlemonster.

Voor een succesvolle Western transfer wordt de gel eerst 15 minuten geëquilibreerd in transferbuffer. De membraan dient eveneens te worden geëquilibreerd volgens de instructies van de fabrikant.

Vervolgens wordt de transfer-sandwich zorgvuldig klaargemaakt in transferbuffer om te voorkomen dat er luchtbellen in het systeem bekneld raken. Luchtbellen in de sandwich kunnen worden verwijderd door er met een kleine pipet overheen te rollen. Zelfs kleine luchtbellen kunnen de overdracht van eiwitten onderbreken, wat leidt tot een onvolledige transfer, zoals te zien is op de onderste delen van dit membraan.

Zodra de sandwich is samengesteld, wordt er extra transferbuffer in de transferkamer gegoten en wordt de transfer uitgevoerd bij 20-30 mA gedurende 2-3 uur. Transferbuffer bevat methanol, wat de binding van de eiwitten aan het membraan verbetert.

Wanneer de transfer voltooid is, wordt de cassette gedemonteerd en kan de kwaliteit van de transfer worden gecontroleerd met een aspecifieke eiwitkleuring zoals Ponceau S. Dit maakt een snelle en reversibele detectie van eiwitbanden mogelijk.

De eerste stap van immunoblotting is het bedekken van de overgebleven gebieden van het membraan met een verdunde eiwitoplossing. Deze stap wordt blokkeren genoemd en wordt uitgevoerd om het membraan te blokkeren en aspecifieke binding van het antilichaam aan het membraan te verminderen. Meestal bestaat de blokkeringsoplossing uit bovine serum albumine of magere melkpoeder opgelost in een gebufferde zoutoplossing. Deze stap wordt gewoonlijk 1 uur tot een nacht uitgevoerd op een schudapparaat.

De volgende stap is het incuberen van het membraan met het primaire antilichaam, verdund in de blokkeringsoplossing. Deze stap kan 30 minuten tot een nacht duren en moet worden uitgevoerd met zachte agitatie.

Vervolgens wordt het membraan grondig gespoeld om aspecifieke achtergrondkleuring te verminderen, waarna het secundaire antilichaam in blokkeringsbuffer aan het membraan wordt toegevoegd. Na een korte incubatie wordt het membraan opnieuw grondig gespoeld.

Secundaire antilichamen zijn detecteerbaar dankzij de reporterenzymen waaraan ze gekoppeld zijn. Na toevoeging van het juiste substraat kunnen colorimetrische of chemiluminescente veranderingen worden vastgelegd en vervolgens worden gemeten met densitometrie-technieken. Daarnaast biedt de eiwitladder een waardig referentiepunt voor de grootte, zodat de lineaire grootte van elk eiwit kan worden geschat op basis van de afstand die het in de gel heeft afgelegd ten opzichte van de groottemarkers in de ladder. Het observeren van de grootte van eiwitten die via immunoblotting zijn gedetecteerd, is een goede manier om te verifiëren of het antilichaam het juiste eiwit herkent en of er sprake is van een monomeer of van meerdere kopieën van het eiwit.

Er zijn duizenden commercieel beschikbare primaire antilichamen, waardoor de detectie en kwantificering van specifieke eiwitten binnen een monster mogelijk is. Hier gebruikt een onderzoeker een antilichaam voor HIF-1α om de hoeveelheid van deze zuurstofgevoelige transcriptiefactor in celculturen te meten om te screenen op hypoxie. Er werd ook een antilichaam voor beta-actine gebruikt als loading control. Zoals te zien is, produceerden de cellen die onder normale zuurstofomstandigheden werden gekweekt veel minder HIF-1 dan de cellen die onder zuurstofarme omstandigheden werden gekwekt.

De combinatie van 2D-gelelektroforese en immunoblotting kan waardevolle informatie verschaffen over de aanwezigheid van eiwitcomplexen. Hier werden monsters eerst gescheiden op basis van de grootte van het eiwitcomplex en vervolgens gedenatureerd, zodat elk individueel eiwit in het complex op basis van zijn eigen grootte kon worden gescheiden. Antilichamen voor drie verschillende eiwitten tonen drie unieke complexen die verschillende aantallen van deze eiwitten bevatten, waarbij elk complex in een verticale lijn is gerangschikt. De meest linkse kolom bevat beta-2 en MCP-21, evenals een ander eiwit dat niet door deze markers wordt aangetoond. De middelste kolom toont een complex dat alle 3 eiwitten bevatte, en de rechterkolom bevatte alleen beta-2 en MCP-21.

Immunoblotting kan ook worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren. Dit wordt gedaan door eerst eiwitten van een gel over te brengen op een nitrocellulosemembraan en dat membraan vervolgens te sonderen met aanvullende eiwitten. Immunoblotting wordt vervolgens gebruikt om te detecteren of de toegevoegde eiwitten complexen hebben gevormd met een van de eiwitten die op het membraan waren geïmmobiliseerd.

U heeft zojuist de JoVE-video over immunoblotting bekeken. U zou nu moeten begrijpen hoe u eiwitten overbrengt naar een membraan, het membraan probeert met antilichamen en het signaal detecteert. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!