Name: Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor netvliesloslating bij knaagdieren door subretinale injectie van natriumhyaluronaat. Deze techniek minimaliseert bloedingen en biedt een betrouwbaar model voor onderzoek naar fotoreceptors.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Wendy Chao voor haar steun in kritisch. Dit werk werd ondersteund door Bausch &amp; Lomb Vitreoretinal Fellowship (HM), National Eye Institute subsidie ​​EY014104 (JWM), Onderzoek ter voorkoming van Blindheid Foundation (DGV), Lions Fonds Eye Research (DGV), en een gulle donatie van de Yeatts familie (JWM en DGV).

Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research, en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Massachusetts Eye en Ear Infirmary Animal Care Comite. 1. Voorbehandeling <ol><li> Verdoven een 8 weken oude muis met een intraperitoneale injectie van een mengsel van 60 mg / kg ketamine en 6 mg / kg xylazine. </li><li> Snij de snorharen. Dit wordt gedaan omdat ze interfereren met visualisatie en instrumenten positie. </li><li> Verwijden de pupil met 5% fenylefrine en 0,5% tropicamide. </li><li> Snijd de trilharen. Dit wordt ook gedaan omdat ze interfereren met visualisatie en instrument plaatsing. </li><li> Solliciteer topische anesthesie (0,5% proparacaïne hydrochloride oogdruppels). </li></ol> 2. Chirurgie onder de microscoop <ol><li> Zet de muis in een laterale posnu bovendien met de neus in de richting van de chirurg. Een teen knijpen wordt uitgevoerd om chirurgische anesthesie te bevestigen, en steriele handschoenen zijn voor het begin van de operatie aangetrokken. </li><li> Incise de temporele bindvlies bij het achterste limbus en scheiden het bindvlies van de sclera. Vermijd het penetreren van de sclera. Na deze stap, pak het bindvlies van de limbus met een tang voor het oog controleren. </li><li> Maak een zelfdichtende sclerale incisie met behulp van de punt van een 30 G naald met de schuine kant naar boven wijzen. Wordt sclerale tunnel door de sclera en dringen de sclera in het vaatvlies (figuur 1). Vermijd penetreren van de retina. Als choroidale bloeden optreedt en komt uit via de sclerale wond, het uitvoeren van een astriction met een chirurgische speer totdat het bloeden stopt. Dit scleral wond zelf gesloten met intra-oculaire druk. </li><li> Prik het hoornvlies met een 30 G naald om de intra-oculaire druk te verminderen. Gebruik de naald evenwijdig aan de iris om niet te verwonden de iris en de lens tijdens einreis in de voorste kamer. De intraoculaire druk zal de wond zelfklevende veroorzaken. </li><li> Plaats een 33 G naald aangesloten op een Hamilton 10 ul spuit in de subretinale ruimte met de schuine kant naar beneden gericht (naar de innerlijke oog), en injecteer 3,5 ul natriumhyaluronaat voorzichtig naar neurosensorische netvlies los te maken van de onderliggende RPE. Vermijd het penetreren van de retina met de 33 G naald omdat natriumhyaluronaat in het glasvocht ruimte, maar niet de subretinale ruimte zal gaan als het netvlies is doorgedrongen. Vermijd ook snelle injectie omdat het een mondelinge scheur zal creëren, en natriumhyaluronaat zal lekken in de voorste kamer. </li><li> Laat de waterige humor vloeien uit het hoornvlies punctie door op het hoornvlies rond de cornea punctie met een tang om de intra-oculaire druk aan te passen. </li><li> Bevestigen de afwezigheid van lekkage uit de sclerale wond met behulp van een chirurgische speer. </li><li> Om het risico van natriumhyaluronaat lekkage te verminderen, plaatst cyanoacrylaat chirurgische lijm opde sclerale wond. </li><li> Bevestig het bindvlies in de oorspronkelijke stand met behulp van cyanoacrylaat chirurgische lijm. Dit vermindert het risico van natriumhyaluronaat lekkage verder te verminderen. </li><li> Controleer de fundus met behulp van een dekglas en bevestig de oprichting van een bulleuze RD zonder subretinal bloeding. </li></ol> 3. Na behandeling <ol><li> Breng bacitracine antibiotische zalf voor het oog om het risico van infectie. </li><li> Houd de muizen op een verwarmingselement te voorkomen dat de anesthesie (mengsel van ketamine en xylazine) van het veroorzaken van een lage lichaamstemperatuur na een lage bloeddruk. </li><li> Zet de muizen terug naar het dier kooi nadat ze ontwaken uit narcose. Monitor de muizen dagelijks op complicaties. Wanneer complicaties optreden, euthanaseren de muizen zoals hieronder beschreven. </li></ol> 4. Offer <ol><li> Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie na intraperitoneale injectie van 100 mg / kg natriumpentobarbital en enucleate De ogen op geschikte tijdstippen voor elk experiment (niet getoond). Oefen geen druk uit op het oog tijdens enucleatie omdat natriumhyaluronaat kan lekken. Bulleuze RDs moet persistent zijn voor ten minste 14 dagen. </li></ol>

<ol><li>Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+recovery+in+the+reattached+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological recovery in the reattached retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).</li>
<li>Cook, B., Lewis, G. P., Fisher, S. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+photoreceptor+degeneration+in+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic photoreceptor degeneration in experimental retinal detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 990-996 (1995).</li>
<li>Zacks, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+an+Experimental+Model+of+Retinal+Detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in an Experimental Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1262-1267 (2003).</li>
<li>Zacks, D. N., Han, Y., Zeng, Y., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Signaling+Pathways+and+Stress-Response+Genes+in+an+Experimental+Model+of+Retinal+Detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of Signaling Pathways and Stress-Response Genes in an Experimental Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 1691-1695 (2006).</li>
<li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytokine+responses+to+retinal+detachment+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats.</a> Mol. Vis. 12, 867-878 (2006).</li>
<li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Necrosis+Factor-Mediates+Photoreceptor+Death+in+a+Rodent+Model+of+Retinal+Detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor Necrosis Factor-Mediates Photoreceptor Death in a Rodent Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1384-1391 (2011).</li>
<li>Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relocalization+of+apoptosis-inducing+factor+in+photoreceptor+apoptosis+induced+by+retinal+detachment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Relocalization of apoptosis-inducing factor in photoreceptor apoptosis induced by retinal detachment in vivo.</a> Am. J. Pathol. 158, 1271-1278 (2001).</li>
<li>Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+photoreceptor+apoptosis+in+functional+damage+after+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Critical role of photoreceptor apoptosis in functional damage after retinal detachment.</a> Curr. Eye Res. 24, 161-172 (2002).</li>
<li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2425-2430 (2007).</li>
<li>Trichonas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinases+mediate+retinal+detachment-induced+photoreceptor+necrosis+and+compensate+for+inhibition+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinases mediate retinal detachment-induced photoreceptor necrosis and compensate for inhibition of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 21695-21700 (2010).</li>
<li>Roh, M. I., Murakami, Y., Thanos, A., Vavvas, D. G., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edaravone%2C+an+ROS+Scavenger%2C+Ameliorates+Photoreceptor+Cell+Death+after+Experimental+Retinal+Detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Edaravone, an ROS Scavenger, Ameliorates Photoreceptor Cell Death after Experimental Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3825-3831 (2011).</li>
<li>Mantopoulos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauroursodeoxycholic+acid+%28TUDCA%29+protects+photoreceptors+from+cell+death+after+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) protects photoreceptors from cell death after experimental retinal detachment.</a> PLoS One. 6, e24245(2011).</li>
<li>Yang, L., Bula, D., Arroyo, J. G., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+retinal+detachment-associated+photoreceptor+cell+loss+in+Bax-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Preventing retinal detachment-associated photoreceptor cell loss in Bax-deficient mice.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 648-654 (2004).</li>
<li>Cebulla, C. M., Ruggeri, M., Murray, T. G., Feuer, W. J., Hernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+murine+retinal+detachment+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography in a murine retinal detachment model.</a> Exp. Eye Res. 90, 521-527 (2010).</li>
<li>Secondi, R., Kong, J., Blonska, A. M., Staurenghi, G., Sparrow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundus+Autofluorescence+Findings+in+a+Mouse+Model+of+Retinal+Detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fundus Autofluorescence Findings in a Mouse Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 5190-5197 (2012).</li>
<li>Machemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+retinal+detachment+in+the+owl+monkey.+IV.+The+reattached+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Experimental retinal detachment in the owl monkey. IV. The reattached retina.</a> Am. J. Ophthalmol. 66, 1075-1091 (1968).</li>
<li>Ross, W., Lavina, A., Russell, M., Maberley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+between+height+of+macular+detachment+and+visual+outcome+in+macula-off+retinal+detachments+of+%3C+or+%3D+7+days%27+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The correlation between height of macular detachment and visual outcome in macula-off retinal detachments of < or = 7 days' duration.</a> Ophthalmology. 112, 1213-1217 (2005).</li>
<li>Glatt, H., Machemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+subretinal+hemorrhage+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Experimental subretinal hemorrhage in rabbits.</a> Am. J. Ophthalmol. 94, 762-773 (1982).</li>
<li>Toth, C. A., Morse, L. S., Hjelmeland, L. M., Landers, M. B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+directs+early+retinal+damage+after+experimental+subretinal+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fibrin directs early retinal damage after experimental subretinal hemorrhage.</a> Arch. Ophthalmol. 109, 723-729 (1991).</li>
<li>Benner, J. D., Hay, A., Landers, M. B. 3rd, Hjelmeland, L. M., Morse, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolytic-assisted+removal+of+experimental+subretinal+hemorrhage+within+7+days+reduces+outer+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibrinolytic-assisted removal of experimental subretinal hemorrhage within 7 days reduces outer retinal degeneration.</a> Ophthalmology. , 101-672 (1994).</li>
<li>Bhisitkul, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+intravitreal+triamcinolone+acetonide+against+photoreceptor+apoptosis+in+a+rabbit+model+of+subretinal+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of intravitreal triamcinolone acetonide against photoreceptor apoptosis in a rabbit model of subretinal hemorrhage.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4071-4077 (2008).</li>
<li>Zeng, R., Zhang, Y., Shi, F., Kong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Experimental+Mouse+Model+of+Retinal+Detachment%3A+Complete+Functional+and+Histologic+Recovery+of+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A Novel Experimental Mouse Model of Retinal Detachment: Complete Functional and Histologic Recovery of the Retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 1685-1695 (2012).</li>
<li>Leon, S., Yin, Y., Nguyen, J., Irwin, N., Benowitz, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+injury+stimulates+axon+regeneration+in+the+mature+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve.</a> J. Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).</li>
<li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+choroidal+neovascularization+via+brief+subretinal+exposure+to+a+newly+developed+lentiviral+vector+pseudotyped+with+Sendai+viral+envelope+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inhibition of choroidal neovascularization via brief subretinal exposure to a newly developed lentiviral vector pseudotyped with Sendai viral envelope proteins.</a> Hum. Gene Ther. 21, 199-209 (2010).</li>
<li>Kong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV5+vector+facilitates+quicker+transgene+expression+in+photoreceptor+and+retinal+pigment+epithelial+cells+of+normal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV5 vector facilitates quicker transgene expression in photoreceptor and retinal pigment epithelial cells of normal mouse.</a> Exp. Eye Res. 90, 546-554 (2010).</li>
</ol>

Het Massachusetts Eye en Ear Infirmary heeft een eigendomsbelang in drie Amerikaanse patenten gericht op het gebruik van verteporfin. Bovendien, het Massachusetts Eye en Ear Infirmary heeft belang in bepaalde octrooiaanvragen gericht op de selectieve vernietiging van subretinale choroidea voor de behandeling van macula degeneratie en andere ziekten. Het Massachusetts Eye en Ear Infirmary royalty&#39;s ontvangt als gevolg van deze octrooien en octrooiaanvragen en Dr Miller krijgt een aandeel van hetzelfde in overeenstemming met het Massachusetts Eye en institutionele Patent Beleid en Procedures Ear Infirmary, die bepalingen royalty-delen omvat. De auteur, dr. Joan W. Miller, is een verleden bestuurslid en voormalig aandeelhouder van Alcon, Inc, en is momenteel als consultant voor Alcon, Imagen Biotech, Inc, ISIS Pharmaceuticals, KalVista Pharmaceuticals, Regeneron Pharmaceuticals, Inc en ONL Therapeutics, LLC. Dr Demetrios G. Vavvas serveertals consultant voor Roche, Genentech, Kala Pharmaceuticals.

Verschillende methoden voor het vaststellen van een RD-model in knaagdier ogen zijn gemeld 3-15, 22. De meeste maken gebruik subretinale injectie van natriumhyaluronaat omdat het een viskeus materiaal gewoonlijk gebruikt tijdens intraoculaire chirurgie in mensen, en het is niet geassocieerd met enige bekende oculaire toxiciteit 1-15. Natriumhyaluronaat dan normale zoutoplossing of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), verhoogt de duur van de RD. De methoden voor het subretinal injectie van natriumhyaluronaat een van twee benaderingen: een transvitreal aanpak 3-6 of een transscleral aanpak 7-15. Beide methoden worden uitgevoerd met observatie van de fundus. In de transvitreal benadering wordt een subretinale injectie ingebracht in het glasvocht holte, een retinotomy gemaakt in de perifere retina, en natriumhyaluronaat wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte. In deze werkwijze worden twee netvliesscheuren gemaakt, waardoor de kans toeneemt netvliesl bloedingen die kunnen gaan in de subretinale ruimte. Daarnaast bestaat het risico van de lens veroorzaakt, wanneer het retinotomy wordt gecreëerd. Er zijn verschillende methoden voor de gemodificeerde transscleral aanpak. In de meeste van deze werkwijzen 7-12, na het verminderen van de intraoculaire druk met een voorste kamer punctie, een 30 G naald verbonden met een injectiespuit gevuld met natriumhyaluronaat wordt rechtstreeks via de conjunctiva, sclera, choroidea en RPE in de subretinale ruimte ingevoegd. De natriumhyaluronaat wordt vervolgens geïnjecteerd in de subretinale ruimte. Het risico van retinale scheur en schade lens met deze transscleral methode is minder dan met de transvitreal benadering. De opening in de sclera door een 30 G naald groot, vooral voor muizen ogen en de natriumhyaluronaat geïnjecteerd in de subretinale ruimte gemakkelijk lekt uit het oog door de sclerale wond. Dit leidt tot een lagere, minder persistent RD en variabele fotoreceptorcellen celdood. Bovendien, als choroïdale bloeden optreedt inde sclerale perforatie stap zal de bloeding verspreiden in de subretinale ruimte omdat de intraoculaire druk is verlaagd vóór de subretinale hyaluronaat injectie. Verschillende factoren kunnen het effect van RD invloed op de vrijstaande netvlies, met inbegrip van zowel subretinal bloeding en de hoogte en de persistentie van RD 16-21. Fotoreceptorcellen celdood toeneemt met toenemende hoogte van RD 16, 17 en lichtgevoelige celschade kan uitgebreider vanwege verminderde diffusie van zuurstof en essentiële voedingsstoffen uit de choriocapillaris met hogere RD vergelijking met ondiepe RD. Subretinale bloeding is ook giftig voor fotoreceptorcellen 18-21; mogelijke mechanismen van deze toxiciteit in de vrijstaande netvlies onder hypoxie en metabole verstoring door subretinal bloeding als een diffusie barrière, en directe neurotoxiciteit veroorzaakt door bloed (zoals ijzer). Lens schade, die is vermeld dat een beschermend effect op reti hebbennal ganglioncellen 23, kunnen ook van invloed fotoreceptorcel dood na inductie van RD. Bovendien, als de inzending wond niet wordt afgesloten, natriumhyaluronaat buiten kan komen met oog manipulatie tijdens enucleatie. Dit kan leiden tot onjuiste kwalificatie van een RD zo triviaal, die op hun beurt invloed op de interpretatie van de resultaten. We pasten de transscleral werkwijze voor subretinale injectie van natriumhyaluronaat om de reproduceerbaarheid van RDs verhogen en de snelheid van subretinale bloeding. De kritische stap van dit protocol is het creëren van een zelfdichtende sclerale incisie met behulp van een 30 G naald, die lekkage van natriumhyaluronaat voorkomt na injectie. In tegenstelling tot eerdere methoden, wordt dit protocol uitgevoerd zonder waarneming van de fundus, zodat er meer aandacht wordt besteed aan de sclerale wond. Toepassing lijm voorkomt ook het natriumhyaluronaat lekken uit het oog. In onze ervaring, de snelheid van subretinale bloeding met dit protocol wals aanzienlijk lager dan die bij andere protocollen. Indien tijdens de sclerale incisie stap choroïdale bloeden optreedt, zal het oog verlaten door de sclera wond omdat deze stap wordt uitgevoerd voor het verminderen van de intraoculaire druk. Als choroidale bloeden optreedt na verlaging van de intra-oculaire druk en loslating van het netvlies neurosensorische, zal bloed ontleden in de subretinale ruimte. We vonden dat dit gebeurt in ongeveer 5% van de gevallen in tegenstelling tot ongeveer 10-20% met de andere technieken. Deze dieren moeten van de analyse worden uitgesloten. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor subretinale injectie van vector gemedieerde genoverdracht fotoreceptorcellen en RPE doelcellen 24, 25. Omdat de typische voertuig (PBS zoutoplossing) voor deze injecties aanzienlijk dunner dan natriumhyaluronaat worden standaardtechnieken geplaagd door meer lekken. De hierin beschreven techniek, door deze risico&#39;s te beperken, maakt vector overdracht experimenten beter reproduceerbaar enbetrouwbaar.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50660/">Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate</a>. The footnotes were removed from the abstract due to redundancy in the introduction.

Erratum: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Fotoreceptorcel en daaropvolgende visuele achteruitgang optreedt wanneer de fotoreceptoren worden gescheiden van de onderliggende retinale pigmentepitheel. Fysieke scheiding van fotoreceptoren wordt gezien in verschillende retinale aandoeningen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), centrale sereuze chorioretinopathie, diabetische retinopathie en retinopathie van prematuriteit, alsmede regmatogene (bijvoorbeeld door een breuk in de retina) netvliesloslating ( RD). Subretinal injectie van natriumhyaluronaat is een algemeen geaccepteerd model met een RD die leidt tot fotoreceptorcel dood, het verstrekken van inzicht in de pathofysiologie van fotoreceptor degeneratie 1-15 creëren. Fotoreceptor degeneratie geïnduceerd door subretinal natriumhyaluronaat injectie, voor het eerst geïntroduceerd in 2001 7, heeft het voordeel van een redelijk tijdsverloop (dagen tot weken). Het kan echter aanzienlijke variabiliteit van fotoreceptorcel verlies van dier tot anima hebbenl te wijten aan twee belangrijke factoren die fotoreceptorcel dood invloed na RD: 1) de hoogte en duur van de RD, en 2) het optreden van subretinale bloeding. Er is een steile technische leercurve de methode die bijdraagt ​​aan beide factoren. Fotoreceptorcel degeneratie toeneemt met de hoogte van de RD, als de afstand tussen de retinale pigment epitheel (RPE) laag en fotoreceptoren verhoogt 16-17. Consistent met deze rapporten, onze eerdere experimenten toonden meer photoreceptor dood in bulleuze RDs dan ondiepe RDS. Ook is gemeld dat subretinale bloeding is toxisch voor fotoreceptorcellen en beïnvloedt lichtgevoelige celdood 18-21. Ook hebben we meer photoreceptor dood in RDS met subretinale bloeding dan RDs zonder subretinal bloeding waargenomen. Vandaar, technieken om de variabiliteit te minimaliseren moeten richten op het bereiken van consistente hoogten van RD terwijl het vermijden subretinal bloeding. De gemodificeerde werkwijze inducing RD kan reproduceerbaar bulleuze en aanhoudende RD maken op dezelfde positie van het oog met zeldzaam voorkomen van subretinale bloeding. We geopereerd met een temporele aanpak omdat het gemakkelijker is om een ​​breder operatiegebied bereiken vergeleken met andere sites. Na de conjunctivale incisie wordt een zelfdichtende sclerale incisie gemaakt met behulp van een 30 G naald. Een scleral tunnel wordt gemaakt, gevolgd door scleraal penetratie in het vaatvlies. Als choroïdale bloeden optreedt in deze stap wordt de bloeding het oog verlaten door de sclera wond en het bloeden kan worden gestopt door astriction met een chirurgisch speer. Een voorste kamer punctie wordt vervolgens uitgevoerd van de cornea intraoculaire druk te verminderen. Dit is een belangrijke stap omdat subretinale injectie alleen leidt tot verhoogde intraoculaire druk met als gevolg retinale arterie occlusie en ischemie van het binnenste retina. Een 33 G naald verbonden met een 10 pl Hamilton spuit wordt vervolgens ingebracht in de subretinale ruimte en 3,5 μ; L natriumhyaluronaat wordt zachtjes geïnjecteerd om de neurosensorische netvlies van de onderliggende RPE los. In tegenstelling tot andere werkwijzen voor het induceren RD die worden uitgevoerd onder fundus observatie, wordt deze techniek uitgevoerd onder directe observatie. Sinds de sclerale wond is self-sealing, zal natriumhyaluronaat niet lekken na injectie. Tenslotte wordt lijm die op de sclerale wond en de conjunctiva wordt opnieuw aan de oorspronkelijke positie. Deze laatste stappen ook het risico van natriumhyaluronaat lekkage reduceren. De injectie van 3,5 pi natriumhyaluronaat maakt reproduceerbare RD (50% van de retina) in de ogen van 8 weken oude muizen. Het creëren van de zelfdichtende wond is de belangrijkste stap in onze aangepaste procedure omdat het voorkomt dat de geïnjecteerde natriumhyaluronaat lekken uit het oog, waardoor reproduceerbare bulleuze en aanhoudende RD.

<table><tbody><tr><td>Ketaject</td><td>Phoenix</td><td>2010025</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>LLOYD</td><td>4004821</td><td></td></tr><tr><td>5% Fenylefedrin / 0,5% Tropicamide</td><td>Massachusetts Eye and Ear Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% Proparacaine Hydrochloride Oogoplossing</td><td>AKORN</td><td>17478-263-12</td><td></td></tr><tr><td>Provics</td><td>Alcon</td><td>8065183085</td><td></td></tr><tr><td>Webglue</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-8566128</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>MG90</td><td></td></tr><tr><td>30G1/2 PrecisionGlide Naald</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Weck-Cel Oogspeers</td><td>Beaver-Visitec</td><td>0008685</td><td></td></tr><tr><td>10 Microliter Spuit</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>33 gauge, 0,5 inch naald</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>18x18mm Dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-548A</td><td></td></tr></tbody></table>

netvliesloslating model in knaagdieren door subretinal injectie van natriumhyaluronaat

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injectie van natriumhyaluronaat is een algemeen aanvaarde werkwijze voor het induceren netvliesloslating (RD). Echter, de hoogte en de duur van RD of het optreden van subretinale bloeding fotoreceptorcellen celdood beïnvloeden de vrijstaande netvlies. Daarom is het voordelig om reproduceerbaar RD maken zonder subretinale bloeding te gaan fotogeleider celdood. We pasten een eerder gemelde methode om bulleuze en aanhoudende RD&#39;s maken in een reproduceerbare locatie met zeldzaam voorkomen van subretinale bloeding. De kritische stap van deze gemodificeerde werkwijze is het creëren van een zelfdichtende sclerale incisie, die lekkage van natriumhyaluronaat kan voorkomen na injectie in de subretinale ruimte. De zelfdichtende sclerale incisie, een sclerale tunnel ontstaat, gevolgd door sclerale penetratie in het vaatvlies met een 30 G naald maken. Hoewel choroidale bloeding kan optreden tijdens deze stap, astriction met een chirurgische speer vermindert de snelheid van choroidal zoomorrhage. Deze methode maakt een meer reproduceerbaar en betrouwbaar model van photoreceptor dood in ziekten die RD zoals regmatogene RD, retinopathie van prematuriteit, diabetische retinopathie, centrale sereuze chorioretinopathie en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) te betrekken.

Om het voortbestaan ​​van de RD door dit protocol te beoordelen, werden cryosecties gemaakt op dagen 3, 7, en 14 na inductie van RD. Zes ogen werden voor elk tijdstip. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring werd gebruikt om de secties te visualiseren. Alle secties toonde een bulleuze RD naderen van de lens (zie figuur 2). Een oog toonde subretinale bloeding op dag 7. Geen ogen vertoonde geen tekenen van infectie of lens letsel. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Een zelfdichtende sclerale incisie. Dit schema toont een dwarsdoorsnede afbeelding van een normale muis oog. Rode lijn geeft de zelfdichtende sclerale incisie. Een sclerale tunnel gevolgd door scleraal penetratie in het vaatvlies met een 30 G naald creëert een zelfdichtende sclerale incisie. Dit scleral wondzal zelf gesloten met intra-oculaire druk, die lekkage van natriumhyaluronaat kan voorkomen na injectie in de subretinale ruimte en het bereiken van aanhoudende bulleuze netvliesloslatingen zijn. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Tijdsverloop van netvliesloslating. Deze fundus foto toont een bulleuze netvliesloslating zonder subretinal bloeding onmiddellijk na de operatie. Cryosecties met hematoxyline en eosine (HE) kleuring tonen aanhoudende bulleuze netvliesloslating zonder subretinal bloeding door ten minste dag 14.

Het creëren van experimentele netvliesloslatingen met een reproduceerbare en aanhoudende hoogte van onthechting en zonder subretinale bloeding, is belangrijk voor het bestuderen van de pathofysiologie van fotoreceptorcel verlies in retinale aandoeningen en evalueren van potentiële therapeutische interventies. Hier melden wij een dergelijke methode in detail.

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Het algemene doel van deze procedure is om experimentele netvliesloslatingen te creëren met een reproduceerbare en aanhoudende loslatingshoogte zonder subretinale bloedingen. Dit wordt bereikt door eerst de temporale conjunctiva bij de posterieure limbus in te snijden om de conjunctiva van de sclera te scheiden. In de tweede stap wordt de punt van een naald met gauge 30 gebruikt om een zelfsluitende scleral incisie en een cornea punctie te maken.Vervolgens wordt natriumhyaluronate in de subretinale ruimte geïnjecteerd om het neurosensorische retina los te maken van het onderliggende retinaal pigmentepitheel. In de laatste stap wordt cyanoacrylaatlijm op de sclerascheur aangebracht en wordt het conjunctiva teruggeplaatst op de oorspronkelijke positie, waardoor het risico op lekkage van natriumhyaluronate wordt verminderd. Ten slotte wordt het fundus onderzocht met behulp van een dekglas om de creatie van een bolus retinale loslating zonder subretinale bloeding te bevestigen.Bestaande methoden voor het opwekken van netvliesloslating bij knaagdieren kunnen leiden tot variabiliteit in de hoogte en persistentie van de loslating, wat resulteert in inconsistente gemeten celdoodpercentages. Met deze techniek kunnen reproduceerbare, bulleuze en persistente netvliesloslatingen worden gecreëerd met een verlaagd risico op subretinale bloedingen, wat een betrouwbaar model voor netvliesloslating bij knaagdieren mogelijk maakt. Experimentele netvliesloslating bij knaagdieren is relatief eenvoudig uit te voeren, heeft een redelijk tijdsverloop en vertoont grote gelijkenissen met de menselijke ziekte.Het is daarom een uitstekend model voor het bestuderen van mechanismen van fotoreceptorceldood en therapieën ter voorkoming van visusverlies. Bij retina-degeneratieve aandoeningen waarbij de variabele fotoreceptorceldood in het losgelaten netvlies wordt onderzocht, is het voordelig om een reproduceerbare loslating te creëren zonder subretinale bloedingen. Dit komt omdat een verlengde duur van de netvliesscheuring of het optreden van subretinale bloedingen invloed kan hebben op de fotoreceptorceldood.Trim na het anesthetiseren van een acht weken oude muis de snorharen van het dier en dilateer vervolgens de pupil onder een chirurgische microscoop met een oplossing die 5% phenyléfrine en 0,5% tropicine bevat. Knip de wimpers van het dier en breng een lokale anesthesie aan met een 0,5% propaïnehydrochloride oogoplossing. Plaats de muis in zijligging met de neus naar de chirurg gericht en maak vervolgens een incisie in de temporale conjunctiva bij de posterieure limbus, waarbij de conjunctiva met een pincet van de sclera wordt gescheiden.Pak de conjunctiva vast bij de limbus om het oog te controleren. Houd vervolgens een naald van 30 gauge vast met de schuine zijde naar boven gericht. Gebruik de punt van de naald om een tunnel door de sclera te maken, waarbij de sclera wordt gepenetreerd tot in het choroidea zonder de retina te doorboren.Houd vervolgens de naald van 30 gauge parallel aan de iris en ponteer het hoornvlies om de intraoculaire druk te verlagen. Richt nu de schuine zijde van de naald naar beneden. Voer een naald van 33 gauge, verbonden met een Hamilton spuit van 10 µL, in de subretinale ruimte in en injecteer 3,5 µL natriumurinate.Hierdoor zal ongeveer 50% van de neurosensorische retina losraken van het onderliggende retinaal pigmentepitheel. Duw met een pincet op het hoornvlies rondom de corneaalpunctie om het kamervocht via de punctie naar buiten te laten stromen, en gebruik vervolgens een chirurgische cellulose-spear om te bevestigen dat er geen lekkage is vanuit de scleralewond, om het risico op lekkage van natriumurinaat te verminderen. Breng cyanoacrylaatlijm aan op de scleralewond en bevestig vervolgens het conjunctiva opnieuw op de oorspronkelijke positie.Gebruik een dekglas om het fundus te controleren en om te bevestigen dat er een bolus-retinale loslating is gecreëerd zonder subretinale bloeding. Breng tot slot antibiotische zalf aan in het oog om het risico op infectie te verminderen. Houd de muis op een warmteplaat om onderkoeling te voorkomen.Vervolgens treedt een lage bloeddruk op. Plaats het dier terug in de kooi nadat het is ontwaakt uit de anesthesie. Om de persistentie van de door dit protocol veroorzaakte netvliesloslating te beoordelen, werden op dag drie, zeven en 14 na inductie van de loslating cryosneden gemaakt.Voor elk tijdstip werden zes ogen gebruikt; kleuring met hematoxiline en eosine werd toegepast om de coupes te visualiseren, welke elk een bolus van netvliesloslating in de richting van de lens vertoonden.Geen van de ogen vertoonde tekenen van infectie of lensbeschadiging. Eenmaal onder de knie, kan deze operatie in ongeveer vijf minuten worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stap voorzichtig uit te voeren om lekkage van natrium, ernstige subretinale bloedingen of lensbeschadiging te voorkomen, aangezien dit alles de dood van receptorcellen in het losgelaten netvlies kan beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een experimentele netvliesloslating bij knaagdieren kunt creëren met een reproduceerbare en aanhoudende hoogte van de loslating zonder subretinale bloeding.

retinal-detachment-model-rodents-subretinal-injection-sodium

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Park, S. W., et al. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)The video describes the method for subretinal injection of viral vectors into the retinal pigment epithelium (RPE) in a mouse model. It details the procedure from anesthesia and eye preparation to precise lentiviral vector delivery, ensuring gene integration and expression in the RPE.

Subretinal Injection of Viral Vectors into the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse Model

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.

Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space<i&gt; via</i&gt; Een Transcleral Posterior Approach

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Hier tonen we een nieuwe benadering voor het gebruik van hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (HR-SD-OCT) helpen levering van gen-therapie-agenten in de subretinal ruimte, beoordelen van haar areal dekking en karakteriseren fotoreceptor vitaliteit.

Met resolutie muis optische coherentie tomografie steun intraoculaire injectie in het netvlies gentherapie onderzoek

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Dit artikel beschrijft methoden voor subretinale injectie bij ratten, waarbij gebruik wordt gemaakt van intraoperatieve visualisatie om zowel de injectieplaats als het gebied van netvliesloslating te controleren.

Intraoperatieve visualisatie van subretinale injectie en netvliesloslating bij ratten

Leer een reproduceerbare methode voor netvliesloslating bij knaagdieren door subretinale injectie van natriumhyaluronaat. Deze techniek minimaliseert bloedingen en biedt een betrouwbaar model voor onderzoek naar fotoreceptors.

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Meer video's verkennen