Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat
11 september 2013
Het creëren van experimentele netvliesloslatingen met een reproduceerbare en aanhoudende hoogte van onthechting en zonder subretinale bloeding, is belangrijk voor het bestuderen van de pathofysiologie van fotoreceptorcel verlies in retinale aandoeningen en evalueren van potentiële therapeutische interventies. Hier melden wij een dergelijke methode in detail.
Het algemene doel van deze procedure is om experimentele netvliesloslatingen te creëren met een reproduceerbare en aanhoudende loslatingshoogte zonder subretinale bloedingen. Dit wordt bereikt door eerst de temporale conjunctiva bij de posterieure limbus in te snijden om de conjunctiva van de sclera te scheiden. In de tweede stap wordt de punt van een naald met gauge 30 gebruikt om een zelfsluitende scleral incisie en een cornea punctie te maken.
Vervolgens wordt natriumhyaluronate in de subretinale ruimte geïnjecteerd om het neurosensorische retina los te maken van het onderliggende retinaal pigmentepitheel. In de laatste stap wordt cyanoacrylaatlijm op de sclerascheur aangebracht en wordt het conjunctiva teruggeplaatst op de oorspronkelijke positie, waardoor het risico op lekkage van natriumhyaluronate wordt verminderd. Ten slotte wordt het fundus onderzocht met behulp van een dekglas om de creatie van een bolus retinale loslating zonder subretinale bloeding te bevestigen.
Bestaande methoden voor het opwekken van netvliesloslating bij knaagdieren kunnen leiden tot variabiliteit in de hoogte en persistentie van de loslating, wat resulteert in inconsistente gemeten celdoodpercentages. Met deze techniek kunnen reproduceerbare, bulleuze en persistente netvliesloslatingen worden gecreëerd met een verlaagd risico op subretinale bloedingen, wat een betrouwbaar model voor netvliesloslating bij knaagdieren mogelijk maakt. Experimentele netvliesloslating bij knaagdieren is relatief eenvoudig uit te voeren, heeft een redelijk tijdsverloop en vertoont grote gelijkenissen met de menselijke ziekte.
Het is daarom een uitstekend model voor het bestuderen van mechanismen van fotoreceptorceldood en therapieën ter voorkoming van visusverlies. Bij retina-degeneratieve aandoeningen waarbij de variabele fotoreceptorceldood in het losgelaten netvlies wordt onderzocht, is het voordelig om een reproduceerbare loslating te creëren zonder subretinale bloedingen. Dit komt omdat een verlengde duur van de netvliesscheuring of het optreden van subretinale bloedingen invloed kan hebben op de fotoreceptorceldood.
Trim na het anesthetiseren van een acht weken oude muis de snorharen van het dier en dilateer vervolgens de pupil onder een chirurgische microscoop met een oplossing die 5% phenyléfrine en 0,5% tropicine bevat. Knip de wimpers van het dier en breng een lokale anesthesie aan met een 0,5% propaïnehydrochloride oogoplossing. Plaats de muis in zijligging met de neus naar de chirurg gericht en maak vervolgens een incisie in de temporale conjunctiva bij de posterieure limbus, waarbij de conjunctiva met een pincet van de sclera wordt gescheiden.
Pak de conjunctiva vast bij de limbus om het oog te controleren. Houd vervolgens een naald van 30 gauge vast met de schuine zijde naar boven gericht. Gebruik de punt van de naald om een tunnel door de sclera te maken, waarbij de sclera wordt gepenetreerd tot in het choroidea zonder de retina te doorboren.
Houd vervolgens de naald van 30 gauge parallel aan de iris en ponteer het hoornvlies om de intraoculaire druk te verlagen. Richt nu de schuine zijde van de naald naar beneden. Voer een naald van 33 gauge, verbonden met een Hamilton spuit van 10 µL, in de subretinale ruimte in en injecteer 3,5 µL natriumurinate.
Hierdoor zal ongeveer 50% van de neurosensorische retina losraken van het onderliggende retinaal pigmentepitheel. Duw met een pincet op het hoornvlies rondom de corneaalpunctie om het kamervocht via de punctie naar buiten te laten stromen, en gebruik vervolgens een chirurgische cellulose-spear om te bevestigen dat er geen lekkage is vanuit de scleralewond, om het risico op lekkage van natriumurinaat te verminderen. Breng cyanoacrylaatlijm aan op de scleralewond en bevestig vervolgens het conjunctiva opnieuw op de oorspronkelijke positie.
Gebruik een dekglas om het fundus te controleren en om te bevestigen dat er een bolus-retinale loslating is gecreëerd zonder subretinale bloeding. Breng tot slot antibiotische zalf aan in het oog om het risico op infectie te verminderen. Houd de muis op een warmteplaat om onderkoeling te voorkomen.
Vervolgens treedt een lage bloeddruk op. Plaats het dier terug in de kooi nadat het is ontwaakt uit de anesthesie. Om de persistentie van de door dit protocol veroorzaakte netvliesloslating te beoordelen, werden op dag drie, zeven en 14 na inductie van de loslating cryosneden gemaakt.
Voor elk tijdstip werden zes ogen gebruikt; kleuring met hematoxiline en eosine werd toegepast om de coupes te visualiseren, welke elk een bolus van netvliesloslating in de richting van de lens vertoonden.
Geen van de ogen vertoonde tekenen van infectie of lensbeschadiging. Eenmaal onder de knie, kan deze operatie in ongeveer vijf minuten worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stap voorzichtig uit te voeren om lekkage van natrium, ernstige subretinale bloedingen of lensbeschadiging te voorkomen, aangezien dit alles de dood van receptorcellen in het losgelaten netvlies kan beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een experimentele netvliesloslating bij knaagdieren kunt creëren met een reproduceerbare en aanhoudende hoogte van de loslating zonder subretinale bloeding.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het creëren van experimentele netvliesloslatingen bij knaagdieren die een reproduceerbare en aanhoudende hoogte bereiken zonder subretinale bloedingen. Deze techniek is essentieel voor het bestuderen van het verlies van fotoreceptorcellen bij netvliesziekten en het evalueren van potentiële therapieën.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ophthalmologie
- Experimentele Biologie
Achtergrond
- Netvliesloslatingen zijn van groot belang voor het bestuderen van netvliessziekten.
- Bestaande methoden kunnen leiden tot variabiliteit in de hoogte en persistentie van de loslating.
- Subretinale bloedingen kunnen de beoordeling van de dood van fotoreceptorcellen bemoeilijken.
- Een betrouwbaar model is noodzakelijk voor consistente resultaten in onderzoek.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een reproduceerbare methode voor het veroorzaken van netvliesloslatingen.
- Het minimaliseren van het risico op subretinale bloedingen tijdens de procedure.
- Het bieden van een betrouwbaar model voor het bestuderen van fotoreceptorceldood en potentiële therapieën.
Gebruikte methoden
- Incisie van de temporale conjunctiva bij de posterieure limbus.
- Het maken van een zelfsluitende scleral incisie en corneaal punctie.
- Injectie van natriumurinaat in de subretinale ruimte.
- Aanbrengen van cyanoacrylaatlijm om de scleral wond te sluiten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van bullose netvliesloslatingen zonder bloedingen.
- De hoogte en persistentie van de loslating waren consistent over de verschillende proeven.
- Er werden na de procedure geen tekenen van infectie of lensbeschadiging waargenomen.
- De methode kan in ongeveer vijf minuten worden uitgevoerd.
Conclusies
- Deze techniek maakt een betrouwbare modellering van netvliesloslating bij knaagdieren mogelijk.
- Het faciliteert de studie naar mechanismen die ten grond liggen aan de dood van fotoreceptoren.
- De methode is eenvoudig en reproduceerbaar, waardoor deze geschikt is voor diverse onderzoekstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het creëren van reproduceerbare modellen voor netvliesloslating zonder storende bloedingen is essentieel voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets voor degeneratieve netvliesziekten. Deze methode ondersteunt mechanistische studies naar de dood van fotoreceptoren en maakt een consistente evaluatie van therapeutische interventies in preklinische trajecten mogelijk.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door een gecontroleerd model van netvliesloslating te bieden om de overleving van fotoreceptoren via specifieke signaalpaden te beoordelen.
- Operationele waarde: Vermindert biologische variabiliteit door bloedingen of inconsistente loslatingshoogte, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de prioritering van portfolio's door een betrouwbare vergelijking mogelijk te maken van kandidaatverbindingen die gericht zijn op degeneratie door loslating.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantificeerbare histologische eindpunten op (bijv. de dikte van de fotoreceptorlaag via cryosectie-kleuring) voor dosis-responsanalyse.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde chirurgische stappen (zelfsluitende incisie, aanbrengen van lijm) verbeteren de gereedheid van de assay en verminderen de foutmarges tijdens de procedure.
- Schaalbaarheid: De korte proceduretijd (~5 minuten) en minimale behoefte aan apparatuur ondersteunen screeningcampagnes met een hogere doorvoersnelheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert de pathofysiologie van rhegmatogene netvliesloslating, diabetische retinopathie en AMD, waarbij de ophoping van subretinaal vocht degeneratie veroorzaakt.
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale beoordeling van de persistentie van de loslating mogelijk (dag 3, 7, 14) om klinische progressievensters te weerspiegelen.
- Mechanistische risicoreductie: Isoleert fotoreceptorsterfte van hemorragische storende factoren, wat het vertrouwen in de read-outs van target engagement verhoogt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit model past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarbij het hypothese-testen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt en kwantitatieve histologische resultaten levert voor lead-optimalisatie en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door gecontroleerde inductie van netvliesloslating mogelijk te maken om stroomafwaartse degeneratieve cascades te bestuderen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve weefselresultaten (bijv. H&E-gekleurde coupes) voor het vergelijken van therapeutische effecten tussen verschillende condities.
- Analytiek: Genereert meetbare structurele eindpunten (hoogte van de loslating, persistentie) die statistische vergelijking van de effectiviteit van interventies faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie via tijdgebonden beoordeling van de progressie van de loslating en histologische resultaten die relevant zijn voor humane RD-pathologieën.
- Enterprise-hergebruik: Een gestandaardiseerd chirurgisch protocol maakt adoptie op verschillende locaties mogelijk als een herbruikbaar platform voor screening op netvliesdegeneratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door biologische ruis als gevolg van bloedingen en variabele detacheringsdynamiek te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde incisie- en afsluittechnieken, waardoor de variabiliteit tussen gebruikers wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door betrouwbare effectiviteitssignalen te leveren in degeneratiemodellen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutica mogelijk op basis van consistente gegevens over het overleven van fotoreceptoren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist microsurgische expertise in de oogheelkunde bij knaagdieren en weefselverwerking.
- Afhankelijk van microsurgische instrumenten (30G/33G naalden, pincetten, chirurgische speer) en adhesieven (cyanoacrylaatlijm).
- Vereist standaardisatie van het injectievolume (3.5 µL natriumhyaluronate) en postoperatieve monitoring tussen teams.
- Aanpassing aan grotere oogmodellen kan aanpassingen in naaldmaat en injectievolume vereisen, terwijl de zelfdichtende principes behouden blijven.
- Beperkt door de vaardigheid van de operator om choroïdale bloedingen tijdens de scleral penetratie te vermijden, hoewel constrictie met de speer het risico vermindert.
