Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling
14 september 2015
Transsynaptisch traceren is een krachtig hulpmiddel geworden voor het analyseren van centrale efferente regulatie van perifere doelwitten via multi-synaptische circuits. Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van het transsynaptische pseudorabiësvirus om een functionele hersencircuit te identificeren en lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken om specifieke verbindingen in het circuit tussen geïdentificeerde groepen neuronen te valideren.
Het algemene doel van deze procedure is om het centrale premotorische netwerk van gedistribueerde cellen te ontdekken dat invloed heeft op een specifiek perifeer doelwit en vervolgens de specifieke verbindingen tussen die cellen in de hersenen te bevestigen. Dit wordt bereikt door eerst de premotorische circuits retrograad te infecteren met een trans-synaptisch viraal vector dat perifeer via de spier wordt afgegeven. De tweede stap van de procedure is om de geïnfecteerde cellen te visualiseren met behulp van lichte fluorescentiemicroscopie.
De derde stap is om specifieke verbindingen in de hersenen te bevestigen door monosynaptische tracers te injecteren die gericht zijn op eerder geïdentificeerde knooppunten in een pre-motorische circuit. Uiteindelijk kunnen de resultaten laten zien hoe cellen in een gedistribueerde pre-motorische netwerk met elkaar verbonden zijn door een combinatie van trans-synaptische virale tracering en traditionele monosynaptische neuro-anatomische technieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals traditionele monosynaptische neurotracering, is dat de knooppunten van een gedistribueerde neuronetwerk kunnen worden geïdentificeerd en de specifieke verbindingen tussen cellen in dat netwerk kunnen worden opgelost op een anesthetiseerd muis.
Bereid de chirurgische plaats voor door het haar te trimmen en de huid te desinfecteren met ten minste drie afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol. Maak nu een huidsnede in het keelgebied en onthul de spier van belang. Om bijvoorbeeld de cricothyroid laryngeale spier te bereiken, is het noodzakelijk om eerst het overlappende deel van de Sterno hyoid spier te verwijderen en alle doorsneden spieren te verzegelen met vet bond weefselkleefstof.
Laad vervolgens het 10 microliter nano-fill microspuitsysteem met vers ontdooid PR RV-oplossing. Maak langzaam de dode ruimte schoon en controleer of de oplossing uit de microspuittip stroomt. Gooi de vloeistof weg als biogevaarlijk afval en plaats het voorzichtig op het stereotactische apparaat.
Gebruik het micro-positioneringsapparaat om de naaldtip voorzichtig in de spier van belang te plaatsen. Vul vervolgens langzaam de spier tot een lichte zwelling zichtbaar is. Verplaats nu de spuit naar de volgende spier van belang, in dit geval de laterale cricoarytenoid, en herhaal het proces.
De injectieprocedure doorboort elke spier slechts één keer. Zodra de injectiesnelheid varieert afhankelijk van de grootte van de spier en het volume dat moet worden geïnjecteerd. Bijvoorbeeld, vijf injecties van 200 nanoliters met een snelheid van vier nanoliters per seconde moeten met een interval van een minuut op dezelfde plaats worden gemaakt om de cricothyroid spier te vullen.
Na het terugtrekken van de microspuit, verzegel de breuk in de fascia met vet bond weefselkleefstof. Zodra alle injecties zijn voltooid, sluit de wond met vet bond weefselkleefstof. Houd het dier in de gaten totdat het sternal ligt.
Geef vervolgens analgesie, voedsel, water en zorg zoals vereist door uw institutionele dieren. Gebruik richtlijnen. De procedure voor het analyseren van EGFP-expressie en PRV-geïnfecteerde neuronen wordt in detail beschreven in het protocol in de tekst.
De weefselverwerking is zeer vergelijkbaar met die later in deze video wordt behandeld. Begin met het anesthetiseren van een volwassen muis, bescherm zijn ogen en fixeer de positie van zijn hoofd. Bereid vervolgens de chirurgische plaats voor zoals eerder beschreven met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol.
Maak nu een incisie in de hoofdhuid en trek de hoofdhuid terug over de hersenen. Regio van belang. Voer een kleine craniotomie uit met de boor op de geschikte stereotactische coördinaten.
De coördinaten voor de laryngeale verbonden motorische cortex geïdentificeerd door PRV-tracering in een volwassen muis zijn bijvoorbeeld 1,2 millimeter lateraal en 0,2 millimeter rostrale tot de bgma. Bereid vervolgens een 7,5% oplossing van biotinylerde dextran amine in steriel water. Laad vervolgens het nano jet twee micropipetsysteem met voldoende BDA-oplossing voor de geplande injecties.
Maak langzaam de dode ruimte schoon en controleer of de oplossing uit de micropipettip stroomt. Gebruik het micro-positioneringsapparaat om de micropipettip voorzichtig in de hersengebied van belang te laten zakken en injecteer langzaam de BDA-oplossing. Pas de snelheid aan afhankelijk van de grootte van het te labelen gebied.
Voorbeeld: 12 injecties van 4,6 nanoliters moeten op vier verschillende locaties worden gemaakt. 0,2 millimeter uit elkaar. Stro coddle om de laryngeale verbonden motorische cortex in een volwassen muis te bedekken.
Het uiteindelijke injectievolume moet worden aangepast aan de grootte van het gebied van belang. Houd er rekening mee dat het label vanuit het injectiekern door hersenweefsel en langs de processen van gelabelde neuronen kan diffunderen. Reinig en bevochtig de craniotomie met steriel zoutje en sluit de hoofdhuidwond met vet bond weefselkleefstof.
Houd het dier in de gaten totdat het sternal ligt. Geef vervolgens analgesie, voedsel, water en zorg zoals vereist door uw institutionele dieren. Gebruik richtlijnen.
Zes dagen later kan cholera toxine-subeenheid B worden geïnjecteerd in de spier van het dier. Vervolgens moet het dier na drie dagen worden geofferd voor analyse. Snijd secties van 40 micron op een cryostat en bewaar drijvende secties in 0,1 molaar PBS. Quench de secties met 0,3% waterstofperoxide in PBS gedurende 30 minuten met schudden en beschermd tegen licht.
Was de secties drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt in PBS. Reageer ze vervolgens een uur in vers bereide A b, C-oplossing bij kamertemperatuur. Was vervolgens de secties drie keer in fosfaatbuffer gedurende 10 minuten per wasbeurt.
Ontwikkel vervolgens de secties gedurende acht minuten met roeren in fosfaatbuffer. pH 7,4 met DAB-waterstofperoxide en nikkelchloride. Het DAB-reactieproduct in de cellen moet zwart verschijnen.
Blokkeer vervolgens de secties tijdens het schudden ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van centrale efferenten die perifere doelen reguleren via multisynaptische circuits met behulp van transsynaptische tracing. De methode maakt gebruik van een transsynaptisch pseudorabiesvirus om hersencircuits te identificeren en te lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken voor validatie.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neuroanatomie
- Virale traceringstechnieken
Achtergrond
- Transsynaptische tracing is een krachtig instrument voor het in kaart brengen van neurale circuits.
- Het gebruik van virale vectoren maakt de identificatie van gedistribueerde neurale netwerken mogelijk.
- Klassieke tract-tracingtechnieken bieden validatie van verbindingen.
- Deze methode vergroot het begrip van premotorische netwerken en hun perifere doelen.
Doel van de studie
- Om het centrale premotorische netwerk van cellen te ontdekken die zich richten op specifieke perifere gebieden.
- Om specifieke verbindingen tussen geïdentificeerde neuronen in de hersenen te bevestigen.
- Om een combinatie van virale tracing en traditionele technieken te gebruiken voor een volledige mapping.
Gebruikte methoden
- Retrograde infectie van premotorische circuits met behulp van een transsynaptische virale vector.
- Visualisatie van geïnfecteerde cellen via licht-fluorescentiemicroscopie.
- Injectie van monosynaptische tracers om verbindingen in de hersenen te bevestigen.
- Analyse van de connectiviteit binnen een gedistribueerd premotorisch netwerk.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van knooppunten in het premotorisch netwerk.
- Visualisatie van specifieke verbindingen tussen neuronen.
- Demonstratie van de voordelen van transsynaptische tracing ten opzichte van traditionele methoden.
- Inzichten in de organisatie van premotorische circuits die perifere doelwitten beïnvloeden.
Conclusies
- Het protocol brengt complexe neurale circuits effectief in kaart.
- Transsynaptische tracing zorgt voor een helderder begrip van de neuronale connectiviteit.
- Deze aanpak kan worden toegepast op diverse studies naar neurale netwerken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om verspreide premotorische netwerken in kaart te brengen die perifere doelen reguleren, wat targetvalidatie bij de ontdekking van neurotherapeutica ondersteunt. Door transsynaptische virale tracing te combineren met klassieke neuroanatomische labeling, wordt de mechanistische risicoreductie van hypothesen over centrale circuits die de perifere fysiologie beïnvloeden, verbeterd. De aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door synaptische connectiviteit binnen functioneel gedefinieerde netwerken te ontrafelen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door centrale premotore neuronen te identificeren die synaptisch verbonden zijn met perifere effectorplaatsen.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk via retrograde transsynaptische tracing vanuit perifere spierinjectieplaatsen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de hiërarchische organisatie van gedistribueerde neurale netwerken die de perifere fysiologie moduleren te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde neuronale populaties voor voor downstream screening van verbindingen die de modulatie van centraal-perifere circuits beïnvloeden.
- Operationele waarde: Standaardiseert connectie-specifieke labeling via BDA- en CTb-dubbele labeling, wat de reproduceerbaarheid tussen experimenten verbetert.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor het in kaart brengen van meerdere perifere targets met behulp van identieke tracing-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt circuitmapping in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door monosynaptische verbindingen te bevestigen tussen geïdentificeerde premotorische knooppunten en perifere doelwitten.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in centrale circuitmodellen door vast te stellen of gelabelde neuronen directe of indirecte verbindingen vormen met perifere effectoren.
- Ziekterelevantie: Ondersteunt studies naar neuromusculaire aandoeningen, autonome dysregulatie en pathologieën van de motorische controle waarbij de integriteit van het centraal-perifere circuit kritiek is.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking via lead-identificatie tot preklinische validatie, waardoor iteratieve verfijning van centrale circuit-doelen die de perifere fysiologie moduleren mogelijk wordt gemaakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door gedistribueerde premotorische netwerken te identificeren via retrograde transsynaptische virale tracing vanuit perifere locaties.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde, kwantitatieve labelling van synaptische verbindingen met BDA en CTb met DAB-detectie.
- Analytics: Genereert gemultiplexte readouts (eGFP, BDA, CTb) die vergelijkende analyse van verbindingssterkte en specificiteit over experimentele condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt virale tracing-outputs met preklinische continuïteit door monosynaptische links tussen centrale neuronen en perifere doelwitten te valideren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het in kaart brengen van centraal-perifere circuits over meerdere ziektemodellen en target-validatiecampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in doelvalidatie door mechanische ambiguïteit in relaties tussen centrale circuits en perifere effectoren te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van dual-label validatie van transsynaptisch getraceerde verbindingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door resolutie op circuitniveau te bieden die strategieën voor centrale target-engagement minder risicovol maakt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van bevestigde sterkte en specificiteit van de centrale-perifere connectiviteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in virale neurowetenschappen, stereotaxische chirurgie en neuroanatomische tracingtechnieken.
- Afhankelijk van biosafety-infrastructuur voor het hanteren van PRV152 en gevaarlijke DAB-gebaseerde detectiechemie.
- Vereist gestandaardiseerde perfusie-, sectie- en immunohistochemische protocollen in verschillende laboratoria voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar niet-knaagdiermodellen vanwege beperkingen in het gastbereik van PRV.
- Praktische beperkingen omvatten beperkingen in de overlevingstijd met PRV en potentiële aspecifieke labeling door BDA-diffusie langs neuronale processen.
