Name: Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Leer transsynaptische tracering met pseudorabiësvirus om centrale premotorische netwerken te identificeren die perifere doelen innerven. Deze methode combineert virale tracering met klassieke technieken voor complete neurale circuitmapping.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Toshio Terashima van Kobe University, Japan, voor het onderwijzen van de larynx operatietechniek, en Dr. Lynn Enquist van Princeton University voor het leveren van PRV-Bartha. Onderzoek werd gesteund door NIH pionier award DP1 OD000448 aan Erich D. Jarvis en een NSF Graduate Research Fellowship award naar Gustavo Arriaga. Uit cijfers van de juiste gecrediteerd eerdere werk worden gebruikt onder de PLoS ONE open toegang Creative Commons licentie (CC-BY) in overeenstemming met de redactionele beleid van het tijdschrift.

OPMERKING: Alle dierlijke procedures zijn beoordeeld en door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. opslaan pseudorabiësvirus <ol><li> We krijgen levend virus (PRV152) uit het laboratorium van Dr. Lynn Enquist aan Princeton University met een titer van 1 x 10 9 pfu / m. Het protocol om het virus te genereren is gepubliceerd 2. </li><li> Aliquot het virus bij 20 pi per buis in een BSL-2 bioveiligheid kast en bewaar bij -80 ° C onder de juiste omstandigheden bioveiligheid. </li><li> Dooi een hoeveelheid van PRV onmiddellijk alvorens te injecteren. </li></ol> 2. Chirurgische Voorbereiding voor injecties in de spier <ol><li> Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane. </li><li> Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf. </li><li> Bereid thij chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de chirurgische site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli). Zorg ervoor dat steriele doeken gebruiken om chirurgische gebieden te dekken. Zorg ervoor om zich te houden aan steriele technieken gedurende de procedures. </li><li> Maak een huidincisie en onthullen de spieren van belang. Bijvoorbeeld, om de cricothyroideus larynx spier moet eerst het bovenliggende gedeelte van de sternohyoid spier te verwijderen. </li><li> Verzegelen elke doorsneden spieren Vetbond weefsel lijm. </li></ol> 3. Injectie van PRV in Spier <ol><li> Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met vers ontdooide PRV oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat. </li><li> Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing verlaat het micro-tip. Gooi vloeistof als bioharzard afval. </li><li> Met een stereotaxische microfositioning apparaat zorgvuldig plaats de micro-tip in de spier van de rente en langzaam vult de spier tot lichte zwelling zichtbaar is. De injectiesnelheid zal variëren afhankelijk van de grootte van de spier en volume te injecteren. Zo moet vijf injecties met 200 nl (1 pl totaal) met een snelheid van 4 nl / sec 1 min uit elkaar worden gemaakt op dezelfde plaats op de cricothyroideus spier vullen. Verplaats de spuit naar de volgende spieren plaats (de laterale cricoarytenoid in dit geval) en herhaal de injectieprocedure. Slechts doorboren eenmaal elke spier. </li><li> Trek de micro na vijf minuten. </li><li> Verzegeling van de breuk in de fascia met Vetbond weefsel lijm. </li><li> Nadat alle injecties zijn voltooid, sluit de wond met behulp Vetbond weefsel lijm. Afhankelijk van uw lokale instellingsgeneeskunde richtlijnen het gebruik van dieren, hechtingen of wond clips kunnen worden gebruikt. </li><li> Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door yonze institutionele richtlijnen het gebruik van dieren. </li><li> Na de experimenteel bepaalde overlevingstijd (in dit geval 90 hr labelen 2e orde corticale neuronen), offer het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardially met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS. </li><li> Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur. </li><li> Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur. </li></ol> 4. Immunochemische Detectie van eGFP <ol><li> Snijd secties 40 urn op een glijdende microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS. Dunnere, bijvoorbeeld 30 urn, kan worden gebruikt bij het kleuren gemonteerde profielen. </li><li> Quench secties 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS beschermd tegen licht. </li><li> Blokkeer niet-specifieke antigenen in de secties 30 min in PBS met 0,3% Tween 20 bij normale geit serum van de Vectastain Elite kit (VE kit). </li><li&gt; Incubate geblokkeerd secties voor 3,5 uur bij konijnen anti-eGFP (1: 1000) bij kamertemperatuur. </li><li> Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij geiten anti-konijn secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing uit de kit VE bij KT. </li><li> Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) en 0,015% H 2 O 2. </li><li> Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk). </li><li> Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia&#39;s met Permount montage medium. </li><li> Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop. De DAB reactieproduct inside de cellen moeten bruine verschijnen. Gedigitaliseerde beelden kunnen kleuren omgekeerd om fijne processen markeren. </li></ol> 5. Chirurgische Voorbereiding voor Injectie van Tracers in hersengebieden Ontdekt door PRV Tracing <ol><li> Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane. </li><li> Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf. </li><li> Zet de kop in een passende stereotaxisch frame. </li><li> Bereid de chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli). </li><li> Maak een hoofdhuid incisie en trekken de huid over de hersenen regio van belang. </li><li> Voer een kleine craniotomie op het juiste stereotaxische coördinaten. Bijvoorbeeld, de coördinaten laryngeally verbonden motorische cortex die door PRV traceren in eenn volwassen muis zijn 1,2 mm lateraal en 0,2 mm rostraal Bregma. </li></ol> 6. Injectie van Gebiotinyleerde Dextraan Amines in Brain <ol><li> Bereid 7,5% gebiotinyleerd dextran amines (BDA) door het oplossen van 25 mg BDA (MW 10.000) in 333 pl steriele zoutoplossing. </li><li> Laad de Nanoject II micropipet met voldoende BDA oplossing voor de geplande injecties. </li><li> Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing is het verlaten van de micropipet tip. </li><li> Met behulp van een stereotaxische micropositionering apparaat zorgvuldig verlagen van de micropipet tip in de hersenen regio van belang en langzaam te injecteren BDA. Pas de injectiesnelheid afhankelijk van de grootte van het gebied te worden aangebracht. Zo dient 12 injecties van 4,6 nl made zijn op vier verschillende plaatsen 0,2 mm van elkaar (rostro-caudaal) aan de laryngeally verbonden motorische cortex bij volwassen muizen dekken. Het uiteindelijke injectievolume worden aangepast aan de grootte van het hersengebied plaats, Rekening houdend met dat label uit de injectie kern door diffusie door hersenweefsel en langs de processen van gelabelde neuronen kunnen verspreiden. </li><li> Dicht de craniotomie met tandheelkundige cement, en sluit de hoofdhuid wond met behulp Vetbond weefsel lijm. </li><li> Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren. </li></ol> 7. Injectie van Cholera toxinesubeenheid b in Spier <ol><li> Bereid 1% choleratoxine subunit B (CTB) door het oplossen van 1 mg van CTB in 100 ul steriele zoutoplossing. </li><li> Zes dagen na BDA injectie in de hersenen, voeren de chirurgische preparaat zoals hierboven beschreven voor PRV injectie in een spier. </li><li> Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met CTB-oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat. </li><li> Voer de micro-injecties in de spier (s) van belang, zoals eerder debeschreven voor PRV. </li><li> Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren. </li><li> Drie dagen na de injectie CTB, offeren het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardiaal met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS. </li><li> Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur. </li><li> Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur. </li></ol> 8. Detectie van BDA en CTB in dezelfde secties <ol><li> Snijd secties 40 urn op een microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS. </li><li> Quench secties 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS beschermd tegen licht. </li><li> Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing bij kamertemperatuur. </li&gt; <li> Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0,015% H 2 O 2 en 0,05% nikkelchloride. De DAB reactie product in de cellen moeten zwart verschijnen. </li><li> Blokdelen gedurende 30 minuten in PBS met 0,3% Tween 20 met normaal konijnenserum van de Vectastain Elite Kit. </li><li> Incubate geblokkeerd secties voor 2 uur bij geiten anti-CTB (1: 10.000) bij kamertemperatuur. </li><li> Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij konijnen anti-geit secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze gedurende 30 min in ABC oplossing bij kamertemperatuur. </li><li> Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen tot 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) en 0,015% H 2 O 2. De DAB reactie product in de cellen moeten bruine verschijnen. </li><li> Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk). </li><li> Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia&#39;s met Permount montage medium. </li><li> Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop. </li></ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
<li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein%3A+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li>
<li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li>
<li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit%3A+comparison+of+three+different+visualization+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li>
<li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li>
<li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Magy+Allatorv+Lapja%22%5BJournal%5D)">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li>
<li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+as+transneuronal+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li>
<li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li>
<li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li>
<li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+modification+of+diaminobenzidine+%28DAB%29+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li>
<li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+%28ABC%29+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+%28PAP%29+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).</li>
<li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li>
<li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li>
<li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li>
<li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten gedeclareerd.

Er zijn een aantal zaken die in overweging moeten worden genomen bij de planning van een experiment met PRV152 4,21. Belangrijker, pseudorabiësvirus is dodelijk. Zoals eerder vermeld, mensapen, waaronder mensen zijn niet gevoelig voor infectie, maar juiste zorg moet worden uitgeoefend om andere dieren te beschermen. Volwassen muizen overleven doorgaans 5-7 dagen na inoculatie met de verzwakte stam PRV152. Daarom PRV152 niet geschikt voor experimenten die overleving langer dan één week nodig. Bovendien besmett...

Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de knaagdierhersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV), vooral de verzwakte stam PRV-Bartha eerst beschreven in 1961 12. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van de motor corticale representatie van bepaalde spieren of spiergroepen met een recombinant pseudorabies virusstam (PRV152) die het versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) reportergen 2. De beschreven methode maakt gebruik van het gedrag van neurotrope virussen, die infectieus nageslacht dat kruis synapsen met andere neuronen besmetten binnen een functioneel circuit 3,4,13 produceren. PRV152, die isogeen met PRV-Bartha, maar kruist synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 3,5 &lt;/ sup&gt;. Door juist de perifere plaats van infectie beheersen is het mogelijk om de binnenkomst van het virus in de hersenen door middel van een specifieke subgroep van motorneuronen beperken. Omdat het virus infecteert achtereenvolgens ketens verbonden neuronen, zal het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen dan het oplossen van de netwerk van neuronen die zijn aangesloten op de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen. Een bijkomend voordeel van het gebruik virus neurale tracing is de amplificatie van het reporter proteïne (eGFP in dit geval) in geïnfecteerde cellen. Deze signaalversterking biedt een niveau van gevoeligheid die de detectie van zelfs schaars projecties maakt. Bijvoorbeeld, een dun uitsteeksel van vibrissa motorische cortex het gezicht motorneuronen regelen van de whiskers werd gevonden in ratten middels viraal tot expressie green fluorescent protein 14; eerdere studies niet aan deze projectie te vinden met behulp van klassieke tracers zonder reporter genamplificatie 11,15. HelaasVeel tracing virale vectoren, zoals die gebruikt in de aangehaalde onderzoek niet synapsen kruisen, waardoor het gebruik ervan voor het opsporen multi-synaptische circuits beperken. Terwijl de presentatie duidelijke voordelen voor het identificeren van het netwerk van cellen die deelnemen in een motorcircuit, de gedistribueerde aard van transsynaptische tracing met PRV-152 maakt het interpreteren van specifieke verbindingen binnen het circuit moeilijk. Daarom presenteren we een eenvoudige methode voor het valideren van specifieke verbindingen binnen circuits geïdentificeerd met PRV-152 door double-labeling gebruikt gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB). Het gecombineerde gebruik van BDA en CTB is een gevestigde aanpak voor het opsporen van verbanden tussen specifieke sets van neuronen 6-8,11. Wanneer samen gebruikt worden, kunnen deze twee tracers worden gevisualiseerd in dezelfde sectie in twee kleuren DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) 16 procedure. Hoog molecuulgewicht BDA (BDA10kDa) werd gekozen voor dit protocol omdat yields gedetailleerde etikettering van neuronale processen 6,7,9. Bijkomende voordelen van BDA10kDa zijn de volgende: het is bij voorkeur in de richting anterograde 6-8 vervoerd; Het kan worden geleverd door iontoforetische of druk injectie 6-8; kan worden gevisualiseerd door een eenvoudige avidine-gebiotinyleerde HRP (ABC) procedure 17; en kan worden afgebeeld door licht- of elektronenmicroscopie 6,7,18. Immunochemische detectie van CTB met peroxidase en DAB werd gekozen retrograde labeling van motoneuronen omdat het effectief is bij het ​​openbaren cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 10,19. We hebben onlangs gebruikt deze benadering van de vocale motor route bij muizen te identificeren en een dunne aansluiting van de primaire motorische cortex aan de larynx motorische neuronen, die eerder werd aangenomen afwezig 20 te onthullen.

<table><tbody><tr><td>Naam van reagens/materiaal</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>NanoFil Micro-injectiesysteem</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G optie</td></tr><tr><td>Stereotaxische frame</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Schuifmicrotoom</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Forane)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 tellen</td></tr><tr><td>Permount Montage Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerdextran aminen</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Pseudorabies virus</td><td>Laboratorium van Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td><td>PRV152</td><td>Titel >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Geit)</td><td>List Biological Laboratories</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin B Subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg tabletten</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 bewijs</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Verdun tot 4%</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>Ketamine HCl &amp; Xylazine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml &amp; 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Nikkelchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M; pH 7,4</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Natrium Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml dosis</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histologisch graad</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (konijn); PK-6105 (geit)</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare oogzalf</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptische tracing van perifere targets met pseudorabiësvirus gevolgd door cholera toxine en gebiotinyleerde dextran amines double labeling

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de hersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV) 1. PRV niet infecteert mensapen, waaronder de mens, dus wordt het meest gebruikt in studies op kleine zoogdieren, vooral knaagdieren. De pseudorabiës stam PRV152 drukt de verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP) reportergen en slechts kruist functionele synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 2,3. Andere PRV stammen hebben verschillende microbiologische eigenschappen en kan in beide richtingen (PRV-Becker en PRV-Kaplan) 4,5 vervoerd worden. Dit protocol zal uitsluitend met PRV152. Door het leveren van het virus in een perifere locatie, zoals spieren, het mogelijk om de binnenkomst van het virus in t beperkenHij hersenen door middel van een specifieke set van neuronen. Het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen oplost dan de neuronen die zijn verbonden met de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen. Aangezien het gedistribueerde karakter van transsynaptische tracing met pseudorabiësvirus maakt interpreteren specifieke verbindingen binnen een geïdentificeerde netwerk moeilijk presenteren we een gevoelige en betrouwbare werkwijze gebruik gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB) voor het bevestigen van de verbindingen tussen cellen geïdentificeerd met behulp PRV152. Immunochemische detectie van BDA en CTB met peroxidase en DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) werd gekozen omdat ze effectief blootleggen cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 6-11.

Kleuring voor eGFP moet beginnen tonen zwak signaal in primaire motorische neuronen ongeveer 72 uur na het injecteren PRV152 in de spier. De replicatie en transsynaptische transport van het virus zijn titer- en tijdsafhankelijke 4. Ongeveer 90 uur na de injectie zal eGFP vlekken sterk signaal in 2 e orde geïnfecteerde cellen te onthullen. Langere overleving tijden zullen 3 e en hogere orde cellen onthullen maar overleving tijden worden beperkt door de dodelijkheid van PRV op ongeveer 5 d...

Transsynaptisch traceren is een krachtig hulpmiddel geworden voor het analyseren van centrale efferente regulatie van perifere doelwitten via multi-synaptische circuits. Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van het transsynaptische pseudorabiësvirus om een functionele hersencircuit te identificeren en lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken om specifieke verbindingen in het circuit tussen geïdentificeerde groepen neuronen te valideren.

Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van het centrale premotorische netwerk van gedistribueerde cellen die inwerken op een specifiek perifeer doelwit en vervolgens het bevestigen van de specifieke verbindingen tussen deze cellen in de hersenen. Dit wordt bereikt door eerst de premotorische circuits retrograad te infecteren met een transsynaptische virale vector die perifeer via de spier wordt toegediend. De tweede stap van de procedure is het visualiseren van de geïnfecteerde cellen met fluorescentielichtmicroscopie.De derde stap is het bevestigen van specifieke verbindingen in de hersenen door monosynaptische tracers te injecteren die gericht zijn op eerder geïdentificeerde knooppunten in een premotorisch circuit. Uiteindelijk kunnen de resultaten aantonen hoe cellen in een gedistribueerd premotorisch netwerk met elkaar verbonden zijn via een combinatie van transsynaptische virale tracing en traditionele monosynaptische neuroanatomische technieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele monosynaptische neurotracing, is dat de knooppunten van een gedistribueerd neuraal netwerk kunnen worden geïdentificee

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.

Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties

Hier presenteren we een verfijnde protocol om effectief biotinyleerd dextran amine (BDA) labelen met een fluorescerende vlekken methode via een wederzijdse neurale traject weer te geven. Het is geschikt voor het analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen onder een confocale laser scanning microscoop.

Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Seriële tweefotontomografie (STPT) beeldvorming is een techniek om een weefselmassa in zijn driedimensionale vorm in beeld te brengen door tweefotonbeeldvorming te combineren met automatische faseregeling en microtoom slicing. Hier beschrijven we een protocol voor de implementatie ervan voor zijdeaapjes om hun structurele kenmerken beter te begrijpen.

Seriële twee-fotontomografie van het hele zijdeaapje brein voor neuroanatomische analyses

Leer transsynaptische tracering met pseudorabiësvirus om centrale premotorische netwerken te identificeren die perifere doelen innerven. Deze methode combineert virale tracering met klassieke technieken voor complete neurale circuitmapping.

Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling (Video) | JoVE Journal

Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling

Meer video's verkennen