Een introductie tot transfectie
Transfectie is het proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in zoogdiercellen wordt ingebracht. Het inbrengen van DNA in ee…
Transfectie is het proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in zoogdiercellen wordt ingebracht. De insertie van DNA maakt de expressie, of productie, van eiwitten mogelijk met behulp van de eigen machinerie van de cellen. De insertie van dubbelstrengs RNA wordt daarentegen gebruikt om de productie van een specifiek eiwit stop te zetten door de translatie te blokkeren. Dit krachtige instrument stelt onderzoekers in staat om genfunctie en -expressie, eiwitfunctie en genetische mutaties beter te bestuderen.
Er is geen enkel transfectiereagens of methode die voor alle celtypen werkt. Gelukkig zijn er in de afgelopen decennia veel methoden en reagentia ontwikkeld om de transfectie van een grote verscheidenheid aan cellen te vergemakkelijken. Deze methoden kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen: chemische en fysieke transfecties.
In deze video richten we ons op de verschillende chemische afgiftesystemen, aangezien deze de laatste jaren steeds gebruikelijker zijn geworden. Deze methoden omvatten onder meer lipide-gebaseerde benaderingen, calciumfosfaat-gemedieerde transfectie en het gebruik van kationische polymeren.
Het onderliggende principe van alle chemische transfectiemethoden is vergelijkbaar. Ze maken allemaal gebruik van positief geladen dragermoleculen die complexen vormen met nucleïnezuren om deze te verpakken voor cellulaire aflevering. Deze dragermoleculen overwinnen de negatieve lading van de celmembraanbarrière, waardoor ze door het membraan kunnen passeren om hun inhoud af te leveren.
Bij lipidtransfectie vormen kationische lipiden een liposoom, dat vervolgens combineert met nucleïnezuren om een "transfectiecomplex" te vormen. Calciumfosfaat daarentegen condenseert simpelweg het DNA en geeft het een netto positieve lading. Daarnaast condenseren kationische polymeren, zoals polyethylenimine, het DNA tot positief geladen deeltjes.
De volgende stap in chemisch gemedieerde transfectie is de hechting van de positief geladen complexen aan het negatief geladen celmembraan via eenvoudige elektrostatische aantrekking.
Vervolgens komt het complex de cel binnen via endocytose - een proces waarbij moleculen de cel binnendringen via membraangebonden blaasjes, genaamd endosomen.
Eenmaal in de cel moeten de nucleïnezuren uit het endosoom ontsnappen via een proces dat nog onbekend is. Buiten het endosoom komen de nucleïnezuren terecht in het cytoplasma van de cel en uiteindelijk in de kern, waar de machinerie van de cel in staat is om mRNA en vervolgens eiwit ervan te maken. Het cytoplasma is de actieplaats voor klein interfererend RNA, of siRNA, waarbij de eiwitproductie wordt verminderd door een deel van de eiwitproducerende machinerie van de cel te verstoren.
Getransfecteerd DNA kan zowel stabiel als transient voorkomen. Stabiele transfecties treden op wanneer getransfecteerd DNA in het genoom wordt geïntegreerd en daardoor behouden blijft naarmate de cel zich delt. Transiënte transfecties treden op wanneer het DNA niet in het genoom wordt opgenomen en de expressie van het gecodeerde eiwit verloren gaat gedurende een periode van ongeveer 24-96 uur.
De efficiëntie van DNA-transfectie wordt doorgaans gemeten via reportersystemen die gekoppeld zijn aan het ingevoegde gen. Dit zijn systemen die eenvoudig kunnen worden gedetecteerd, ofwel door direct het reportereiwit zelf te observeren, zoals in het geval van groen fluorescerend eiwit, of door de enzymatische activiteit ervan te meten met behulp van een colorimetrische assay, zoals in het geval van een luciferase-enzymreporter. Stabiele DNA-transfectie wordt bij voorkeur gemeten via genomische analyse, zoals RT-PCR.
Om het succes van siRNA-silencing te meten, kunnen de targeted eiwitniveaus in elk monster worden bepaald via Immunoblot. Succesvolle siRNA-transfectie zou de expressie van het doeleiwit in de cellen moeten verlagen, terwijl de niveaus van het housekeeping-gen, GAPDH, stabiel blijven.
Om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren, moeten de cellen zich in de log-fase van groei bevinden en op het moment van transfectie een confluentie tussen 40 en 80% hebben. Om dit te bereiken, moeten de cellen in kweek de dag ervoor worden geoogst... geteld... en in een multi-wellplaat worden gezaaid in een concentratie die op het moment van transfectie het juiste confluentieniveau oplevert.
Vervolgens worden de chemische reagentia en de nucleïnezuren gemengd en krijgt men de tijd om de nucleïnezuur-reagentia-complexen te vormen. Voor elk chemisch afleveringssysteem moeten de specifieke concentraties van elke component worden geoptimaliseerd.
De nucleïnezuur-reagentia-complexen worden vervolgens toegevoegd aan de geplaatste cellen en vaak overnight geïncubeerd om voldoende tijd te geven aan de complexen om zich aan de cellen te hechten en de transfectie te mediëren. Na 24 uur moet het medium worden verwijderd en vervangen door vers kweekmedium.
Er bestaan veel variaties en toepassingen van transfectie. Co-transfectie kan een onderzoeker in staat stellen om het effect van missense-mutaties op de functie van cellulaire eiwitten te bestuderen. Hier werd RNAi getransfecteerd in HeLa-cellen om het endogene BRCA1-eiwit te downreguleren, wat leidt tot een vermindering van het aantal GFP-positieve cellen. Tegelijkertijd werd er ook een mutant BRCA1-eiwit getransfecteerd en geproduceerd door de cel. Als het gemuteerde eiwit volledig functioneel was, zorgde dit voor een herstel van het aantal GFP-positieve cellen, maar als de mutatie de functie negatief beïnvloedde, bleef het aantal GFP-positieve cellen laag.
Als alternatief voor chemische transfectiemethoden gebruikt een onderzoeker, hier getoond, een gene gun om gouddeeltjes bedekt met DNA op cellen in kweek te schieten. Cellen die deze kleine, met DNA bedekte kogeltjes in hun cytoplasma krijgen, hebben een goede kans om getransfecteerd te worden.
Een andere alternatieve methode voor transfectie is elektroporatie. Elektroporatie is het gebruik van elektrische stroom om het celmembraan te beschadigen, waardoor DNA of RNA voor korte tijd de cel kan binnendringen voordat de cellen tijd hebben om te herstellen. Hier worden pincetelektroden rond een muizenbrein geplaatst en worden korte elektrische pulsen door het brein gestuurd om ex-vivo transfectie te initiëren van de geïnjecteerde RNAi-moleculen in de blauwe oplossing. De effecten van gene silencing op de structuur van de ontwikkelende cortex worden vervolgens geobserveerd.
U heeft zojuist de video van JoVE over transfectie bekeken. Bedankt voor het kijken!
Transfectie is het proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in zoogdiercellen wordt ingebracht. De insertie van DNA maakt de expressie, of productie, van eiwitten mogelijk met behulp van de eigen machinerie van de cellen. De insertie van dubbelstrengs RNA wordt daarentegen gebruikt om de productie van een specifiek eiwit stop te zetten door de translatie te blokkeren. Dit krachtige instrument stelt onderzoekers in staat om genfunctie en -expressie, eiwitfunctie en genetische mutaties beter te bestuderen.
Er is geen enkel transfectiereagens of methode die voor alle celtypen werkt. Gelukkig zijn er in de afgelopen decennia veel methoden en reagentia ontwikkeld om de transfectie van een grote verscheidenheid aan cellen te vergemakkelijken. Deze methoden kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen: chemische en fysieke transfecties.
In deze video richten we ons op de verschillende chemische afgiftesystemen, aangezien deze de laatste jaren steeds gebruikelijker zijn geworden. Deze methoden omvatten onder meer lipide-gebaseerde benaderingen, calciumfosfaat-gemedieerde transfectie en het gebruik van kationische polymeren.
Het onderliggende principe van alle chemische transfectiemethoden is vergelijkbaar. Ze maken allemaal gebruik van positief geladen dragermoleculen die complexen vormen met nucleïnezuren om deze te verpakken voor cellulaire aflevering. Deze dragermoleculen overwinnen de negatieve lading van de celmembraanbarrière, waardoor ze door het membraan kunnen passeren om hun inhoud af te leveren.
Bij lipidtransfectie vormen kationische lipiden een liposoom, dat vervolgens combineert met nucleïnezuren om een "transfectiecomplex" te vormen. Calciumfosfaat daarentegen condenseert simpelweg het DNA en geeft het een netto positieve lading. Daarnaast condenseren kationische polymeren, zoals polyethylenimine, het DNA tot positief geladen deeltjes.
De volgende stap in chemisch gemedieerde transfectie is de hechting van de positief geladen complexen aan het negatief geladen celmembraan via eenvoudige elektrostatische aantrekking.
Vervolgens komt het complex de cel binnen via endocytose - een proces waarbij moleculen de cel binnendringen via membraangebonden blaasjes, genaamd endosomen.
Eenmaal in de cel moeten de nucleïnezuren uit het endosoom ontsnappen via een proces dat nog onbekend is. Buiten het endosoom komen de nucleïnezuren terecht in het cytoplasma van de cel en uiteindelijk in de kern, waar de machinerie van de cel in staat is om mRNA en vervolgens eiwit ervan te maken. Het cytoplasma is de actieplaats voor klein interfererend RNA, of siRNA, waarbij de eiwitproductie wordt verminderd door een deel van de eiwitproducerende machinerie van de cel te verstoren.
Getransfecteerd DNA kan zowel stabiel als transient voorkomen. Stabiele transfecties treden op wanneer getransfecteerd DNA in het genoom wordt geïntegreerd en daardoor behouden blijft naarmate de cel zich delt. Transiënte transfecties treden op wanneer het DNA niet in het genoom wordt opgenomen en de expressie van het gecodeerde eiwit verloren gaat gedurende een periode van ongeveer 24-96 uur.
De efficiëntie van DNA-transfectie wordt doorgaans gemeten via reportersystemen die gekoppeld zijn aan het ingevoegde gen. Dit zijn systemen die eenvoudig kunnen worden gedetecteerd, ofwel door direct het reportereiwit zelf te observeren, zoals in het geval van groen fluorescerend eiwit, of door de enzymatische activiteit ervan te meten met behulp van een colorimetrische assay, zoals in het geval van een luciferase-enzymreporter. Stabiele DNA-transfectie wordt bij voorkeur gemeten via genomische analyse, zoals RT-PCR.
Om het succes van siRNA-silencing te meten, kunnen de targeted eiwitniveaus in elk monster worden bepaald via Immunoblot. Succesvolle siRNA-transfectie zou de expressie van het doeleiwit in de cellen moeten verlagen, terwijl de niveaus van het housekeeping-gen, GAPDH, stabiel blijven.
Om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren, moeten de cellen zich in de log-fase van groei bevinden en op het moment van transfectie een confluentie tussen 40 en 80% hebben. Om dit te bereiken, moeten de cellen in kweek de dag ervoor worden geoogst... geteld... en in een multi-wellplaat worden gezaaid in een concentratie die op het moment van transfectie het juiste confluentieniveau oplevert.
Vervolgens worden de chemische reagentia en de nucleïnezuren gemengd en krijgt men de tijd om de nucleïnezuur-reagentia-complexen te vormen. Voor elk chemisch afleveringssysteem moeten de specifieke concentraties van elke component worden geoptimaliseerd.
De nucleïnezuur-reagentia-complexen worden vervolgens toegevoegd aan de geplaatste cellen en vaak overnight geïncubeerd om voldoende tijd te geven aan de complexen om zich aan de cellen te hechten en de transfectie te mediëren. Na 24 uur moet het medium worden verwijderd en vervangen door vers kweekmedium.
Er bestaan veel variaties en toepassingen van transfectie. Co-transfectie kan een onderzoeker in staat stellen om het effect van missense-mutaties op de functie van cellulaire eiwitten te bestuderen. Hier werd RNAi getransfecteerd in HeLa-cellen om het endogene BRCA1-eiwit te downreguleren, wat leidt tot een vermindering van het aantal GFP-positieve cellen. Tegelijkertijd werd er ook een mutant BRCA1-eiwit getransfecteerd en geproduceerd door de cel. Als het gemuteerde eiwit volledig functioneel was, zorgde dit voor een herstel van het aantal GFP-positieve cellen, maar als de mutatie de functie negatief beïnvloedde, bleef het aantal GFP-positieve cellen laag.
Als alternatief voor chemische transfectiemethoden gebruikt een onderzoeker, hier getoond, een gene gun om gouddeeltjes bedekt met DNA op cellen in kweek te schieten. Cellen die deze kleine, met DNA bedekte kogeltjes in hun cytoplasma krijgen, hebben een goede kans om getransfecteerd te worden.
Een andere alternatieve methode voor transfectie is elektroporatie. Elektroporatie is het gebruik van elektrische stroom om het celmembraan te beschadigen, waardoor DNA of RNA voor korte tijd de cel kan binnendringen voordat de cellen tijd hebben om te herstellen. Hier worden pincetelektroden rond een muizenbrein geplaatst en worden korte elektrische pulsen door het brein gestuurd om ex-vivo transfectie te initiëren van de geïnjecteerde RNAi-moleculen in de blauwe oplossing. De effecten van gene silencing op de structuur van de ontwikkelende cortex worden vervolgens geobserveerd.
U heeft zojuist de video van JoVE over transfectie bekeken. Bedankt voor het kijken!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.