DNA-ligatiereacties

Ligatie kan worden gedefinieerd als het proces van verbinden, en in de biologie verwijst de term naar een enzymatische reactie die twee biomoleculen verbindt met een covalente binding. Deze video beschrijft de toepassing van DNA-ligatie in moleculair-biologisch onderzoek.

In de cel zijn DNA-ligasen enzymen die breuken in het DNA identificeren en dichten door de vorming van fosfodiësterbindingen tussen de 3’-hydroxyl- en 5’-fosfaatgroepen van de DNA-backbone te katalyseren. Ligatie vindt plaats als onderdeel van normale cellulaire processen, zoals DNA-replicatie, om enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-breuken te herstellen.

In het laboratorium worden DNA-ligasen routinematig gebruikt bij moleculaire klonering — een proces waarbij endonuclease-verteerde DNA-fragmenten, of inserts, worden verbonden met een endonuclease-verteerde vector, zoals een plasmide, zodat het fragment in gastcellen kan worden geïntroduceerd en vervolgens kan worden gerepliceerd.

Endonuclease-verteringen maken gebruik van restrictie-endonucleasen, of restrictie-enzymen, die inkepingen maken op specifieke stukken DNA.

Deze inkepingen kunnen lijken op enkelstrengs breuken die 3’- en 5’-overhangs produceren, genaamd sticky ends, of op dubbelstrengs breuken zonder overhangs, genaamd blunt ends. Het ligeren van sticky ends is voordelig, omdat de complementaire overhangende baseparen de reactie stabiliseren. Omdat blunt end-ligaties geen complementaire baseparing hebben, is de ligatie minder efficiënt en is het voor het enzym moeilijker om de uiteinden te verbinden. Sticky ends en blunt ends kunnen onder normale omstandigheden niet aan elkaar worden geligeerd.

Het Klenow-fragment, het product van DNA-polymerase 1, verteerd met subtilisine, kan sticky ends echter omzetten in blunt ends. Klenow bezit 3’- naar 5’-exonuclease-activiteit die 3’-overhangs afbreekt en polymerase-activiteit die 5’-overhangs blunt maakt door het 3’-uiteinde van de complementaire streng te verlengen.

Wanneer het doel is om een gen in een plasmide in te voegen, is het opnieuw dichten van vector-DNA, genaamd zelf-ligatie, een veelvoorkomende ongewenste uitkomst van een ligatiereactie. Behandeling van vector-DNA met alkalische fosfatase na vertering verwijdert 5’-fosfaten aan beide uiteinden en voorkomt deze ongewenste uitkomst.

Zoals eerder vermeld, worden vector- en insert-DNA's voor aanvang van een ligatie verteerd met endonucleasen. Na gelzuivering van de verteerde vector en het insert worden de DNA-concentraties met een spectrofotometer gemeten om de concentratie van de gezuiverde vector en het insert te bepalen.

Op basis van deze concentratie kan het aantal moleculen insert of vector in 1 µl worden bepaald, uitgaande van het gemiddelde molecuulgewicht voor een DNA-basepaar en het aantal baseparen in elk fragment. Op basis van de berekende moleculaire concentratie van vector en insert wordt een ratio van 3:1 insert ten opzichte van vector berekend, om het volume vector en insert te bepalen dat in de reactie wordt gebruikt. Deze ratio van 3:1 DNA-insert tot vector is wenselijk, omdat dit de waarschijnlijkheid verhoogt dat het insert in de vector wordt geligeerd in plaats van dat de vector zichzelf ligeert.

Nu we de hoeveelheid vector- en insert-DNA hebben bepaald die in de reactie moet worden gebruikt, gaan we over tot het opzetten van de ligatiereactie op ijs. De volgorde waarin de reactiecomponenten aan de microcentrifugeebuis moeten worden toegevoegd is als volgt: voldoende steriel water om een eindvolume van 10 µl te verkrijgen (in ons geval gebruiken we 4 µl), 1 µl 10X ligatiebuffer, 1 µl 10mM ATP, 1 µl vector en 3 µl insert-DNA, zoals berekend, en tot slot 1 µl DNA-ligase. De reactie wordt grondig gemengd, gecentrifugeerd en geïncubeerd bij de juiste temperatuur.

Of u nu een sticky-end- of een blunt-end-ligatie uitvoert, heeft invloed op de temperatuur en duur van de ligatiereactie. Zo kan een sticky-end-ligatie met een overhang van zes baseparen bij ongeveer kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur worden uitgevoerd, omdat de complementaire uiteinden de koppeling van fragmenten stabiliseren. Ligaties met korte overhangs of blunt-ends moeten tussen 14-20˚C gedurende de nacht worden uitgevoerd.

Nu we hebben geleerd hoe we een ligatiereactie opzetten, kijken we naar enkele toepassingen van deze procedure.

Ligaties kunnen worden gebruikt om PCR-geamplificeerde fragmenten direct in gelineariseerde plasmiden in te voegen. Hier ziet u een onderzoeker die een monster van een bevroren muizenbrein neemt, daaruit genomisch DNA isoleert en dit vervolgens onderwerpt aan bisulfiet-PCR, een PCR-gebaseerde methode om gemethyleerd DNA te detecteren. De PCR-producten worden vervolgens direct in het plasmide geligeerd om een bibliotheek te maken van genen die gemethyleerd zijn in dat specifieke hersengebied.

Ligaties kunnen worden gebruikt om oligonucleotide linkers, die bindingsplaatsen voor PCR-primers bevatten, te koppelen om DNA-fragmenten te zuiveren. Bij het werken met tumorstalen kunnen wetenschappers deze aanpak gebruiken om genomisch tumor-DNA te sequensen, in de hoop tumorveroorzakende mutaties te identificeren.

In deze video wordt ligatie uitgevoerd op DNA dat is geïsoleerd uit met formaldehyde gefixeerde cellen en vervolgens is behandeld met een restrictie-enzym en klenow in aanwezigheid van biotine, wat vervolgens wordt gebruikt om geligeerd DNA neer te slaan. Dit DNA wordt vervolgens geamplificeerd met behulp van PCR en de producten worden gesequenst om chromatininteracties op verschillende schalen te identificeren, zoals hier getoond.

U heeft nu meer geleerd over DNA-ligase, diverse principes voor het opzetten van ligatie in het laboratorium, potentiële problemen en oplossingen, en verschillende toepassingen van ligatie in het moleculair-biologisch onderzoek. Bedankt voor het kijken.