Name: Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer hoe je een volledige muizenhersenen met micronresolutie reconstrueert en visualiseert met confocale light sheet microscopie. Deze methode maakt snelle, hoogwaardige beeldvorming van neurale anatomie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) ontvangen op grond van subsidieovereenkomsten n. 228.334 en 241.526. Dit onderzoek is ook ondersteund door Human Frontier Science Program onderzoeksbeurs (RGP0027/2009), en door het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek in het kader van de Flagship Project Nanomax en door Italiaanse ministerie van Volksgezondheid in het kader van de &quot;Stamcellen Call for proposals&quot;. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van de onderzoeksactiviteiten van ICON stichting ondersteund door &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot; uitgevoerd.

1. Tissue Voorbereiding en opslag <ol><li> Fix muizenhersenen via standaard transcardial 13 perfusie met 20 ml 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing, gevolgd door 100 ml 4% paraformaldehyde in 0,01 M PBS. Zorgvuldig de pH van beide oplossingen tot 7,6: iets lagere waarden van de pH kan de fluorescentie van EGFP lessen. </li><li> Post-fix de uitgesneden hersenen &#39;s nachts in paraformaldehyde 4% bij 4 ° C. </li><li> Spoel twee keer (30 minuten elk) in 0,01 M PBS en bewaar in 0,01 M PBS bij 4 ° C. </li></ol> 2. Uitdroging en Clearing Let op: het protocol voor uitdroging en het opruimen volgt de ene beschreven door Becker et al. 10. <ol><li> Peroxiden van uitdroging oplosmiddel (tetrahydrofuran, THF), die XFP fluorescentie, filter THF sterk blussen met basisch geactiveerd aluminiumoxide (Brockman activiteitsgraad I, ongeveer 250 g / L THF) met een chromafie kolom. Vermijd het kraken van de kolom, die peroxide verwijdering zou verminderen. </li><li> Stabilisator (gebutyleerd hydroxytolueen, 250 mg / L) Naar de eindoplossing, zelfs indien de THF reeds voor filtratie werd gestabiliseerd. Stabilizer is in feite door aluminiumoxide behouden: THF zonder stabilisator kunnen grote hoeveelheden peroxiden ontwikkelen en kan explosief en gevaarlijk zijn. </li><li> Dehydrateer de gehele hersenen van muizen in een gegradeerde reeks van THF in zuiver water: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 uur elk, vervolgens 100% overnacht. Plaats de flacon met het monster op een draaiend wiel. Blootstelling aan licht te voorkomen, wikkel de flacons met een aluminium folie. </li><li> Filter de clearing oplosmiddel (dibenzylether, DBE) met aluminiumoxide (geactiveerd basisch, activiteit rang Brockman I, ongeveer 250 g / l DBE) met een filter trechter. </li><li> Schakel het monster in 100% DBE. Wijzig de oplossing na 3 en 6 uur. </li></ol> 3. Specimen Montage <ol><li> Wanneer de hersenen lijkt transparant op het oog (typitisch 1 uur na de tweede DBE wissel), monteren op de getipte beeldplaat door een van de volgende methoden: </li><li><ol><li> Directe montage - dompelen voorzichtig het monster op een van de tips (Figuur 3a). </li><li> Agarose schijf - Duik een schijf gemaakt van 6% agarosegel op de tips. Zachtjes fix het monster op de agarose disc met acryl lijm (figuur 3b). Wacht ongeveer 1 min bij uitharden. </li><li> Agarose beker - Duik een beker gemaakt van 3% agarosegel op de tips. Plaats voorzichtig het monster op de bodem van de beker (figuur 3c). </li></ol></li></ol> Noot 1: Inbouw in agarose bekerglas de voorkeur als het belangrijk beeldvorming het monster in zijn geheel, maar de agarosegel rond het monster leidt tot extra lichtverstrooiing die nadelig beeldkwaliteit kunnen zijn. Indien een klein deel van het monster van beeldvorming kan worden uitgesloten, is het beter om de spec monterenimen op agarose schijf of direct op het puntje. De eerste methode is het meest geschikt om de hersenen horizontaal (met uitzondering van het afbeelden van een ventrale of dorsale gedeelte van de hersenen), de laatste te houden aan de hersenen verticaal te houden (met uitzondering van het afbeelden van een deel van reukbollen of van het ruggenmerg). Noot 2: de agarosegel moet worden opgesteld in water, vervolgens gedehydrateerd met THF (50% en 100% 4 uur elk) en ontruimd in DBE 100% gedurende 4 uur of totdat het lijkt duidelijk transparant. <ol start="3"><li> Na de montage van het model na een van de vorige methoden, de positie van de beeldvormende plaat in het monster kamer met een pincet. Vul de kamer met de clearing oplossing. </li></ol> 4. Tomografie Voorbereiding <ol><li> Verwijder de spleet om zoveel mogelijk fluorescentie te verzamelen. </li><li> Verlichten het monster met een lage laservermogen aan fotobleken voorkomen. </li><li> Verplaats het monster in de drie richtingen met behulp van de software-gedreven micropositionering system. Identificeer voor elke richting de minimum en maximum coördinaten waarbij het ​​monster wordt verlicht en binnen het gezichtsveld van de camera (figuur 4a). </li><li> Plaats de bovenstaande coördinaten als parameters voor de &#39;Pre-tomografie&#39; subroutine. Geef ook de afstand tussen aangrenzende stapels worden gebruikt in de tomografie, en de pre-tomografie bemonsteringsstap in z-richting. </li><li> Start de pre-tomografie, waarmee de beelden in elke stapel met de z bemonstering gespecificeerd in (4.4) verzameld. </li></ol> Opmerking: De verzamelde beelden worden gebruikt door een software om een ruwe kaart van specimen vorm en positie (4b figuur), die het mogelijk maakt te beperken tomografie overname alleen voor de werkelijk door het monster bezet volume, waardoor de beeldvorming tijd en dus fotobleking bereiden. 5. Tomografie Acquisitie <ol><li> Verplaats het monster buiten het licht blad met de micropositionering systeem. </li><li> Increase laservermogen en stopt de beweging van de scansystemen, zodat alleen een vaste lijn in het midden van het gezichtsveld te verlichten. </li><li> Monteer de spleet en lijn het gebruik van autofluorescentie signaal van de clearing oplossing. U moet duidelijk de spleet lijn in het midden van het gezichtsveld. </li><li> Re-activeren het scansysteem, verminderen laservermogen en verplaats het monster in het licht blad met de micropositionering systeem. Merk op dat het laservermogen gebruikt met de spleet groter dan degene zonder zal het, aangezien de ruimtelijke filter blokkeert een niet te verwaarlozen gedeelte van het licht. </li><li> Stel de amplitude en offset van de scanning en de-scanning systemen met de besturingssoftware, voordat de beelden kijken duidelijk en helder. </li><li> Voer de tomografie-acquisitie software, na het instellen van de juiste z stap voor het experiment. Het volume zal worden afgebeeld in vele parallelle, deels overlappende stapels (Figuur 5a), en de beelden wordt opgeslagen ineen hiërarchische mappenstructuur. </li></ol> 6. Stiksels en Visualisatie <ol><li> Vul het verkregen volume met synthetische zwarte beelden (dwz beelden van hetzelfde type en de afmetingen van de verzamelde enen, maar met nul intensiteit) met behulp van een geautomatiseerde software (Figuur 4c). Deze stap is verplicht zodat het stiksel software om te gaan met een volledige kubieke volume. </li><li> Launch Vaa3D software (gratis te downloaden van <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) met de plugins TeraStitcher en TeraManager geïnstalleerd. </li><li> Laad de TeraStitcher plugin. Selecteer de map met de afgebeelde volume, geven de relatieve oriëntaties van de assen (ten opzichte van een referentie-rechtshandig assenstelsel) en de voxel grootte. </li><li> Lanceren het eerste deel van het stiksel. De software zal de relatieve verplaatsing tussen koppels van stapels te berekenen, en een algehele optimale placem vindenent voor alle stapels samen (figuur 5b). </li><li> Selecteer om de gestikt volume opslaan in single-resolutie of in multi-resolutie-formaat. Dit laatste maakt het mogelijk voor multi-resolutie visualisatie met de TeraManager plugin. In beide gevallen, als het imago van de hogere resolutie is groter dan een paar gigabytes, de multi-stack save modaliteit te selecteren en geeft u de omvang van de individuele substacks ook. Dit efficiënte toegang tot de opgeslagen gegevens mogelijk. </li><li> Start het tweede deel van het stiksel. De software zal fuseren de uitgelijnde stacks, en sla ze als single-of multi-stack mode (Figuren 5c en 5d). Aan het eind sluit de TeraStitcher plugin. </li><li> Laad de TeraManager plugin. Selecteer de map met de multi-gestapelde volume multi-resolutie, en geef voxelgrootte en assen oriëntaties. Het volume wordt op de minimale resolutie worden geladen. </li><li> Zoom naar een hogere resolutie, selecteer een mijlpaal met de rechter muisknop modality van Vaa3D, daarna in te zoomen met de muis scroll. U kunt ook direct kiezen de ROI om in te zoomen met een klik met de rechtermuisknop, of geef de coördinaten van het volume van belang. </li><li> Om terug te zoomen naar een lagere resolutie, gewoon gebruik maken van de muis scroll. </li></ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+and+the+small%3A+challenges+of+imaging+the+brain%27s+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+light+sheet+microscopy%3A+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316(2012).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

CLSM in combinatie met chemische clearing vormen een krachtig hulpmiddel om de neuro-anatomie van de gehele hersenen van muizen gelabeld met fluorescerende probes, ofwel eiwitten of synthetische kleurstoffen bestuderen. Sinds het uitgestraalde licht buiten het brandvlak wordt geblokkeerd door een fysieke ruimtelijke filter, high-contrast beeldvorming is mogelijk ook in dikke exemplaren, met behoud van de hoge framerates typische licht vel architectuur. Het belangrijkste probleem om te gaan met het gebruik van de beschreven werkwijzen is het maximaliseren van het contrast. In feite is het beschikbare signaal zowel verminderd door chemische en optische elementen. Vanuit het chemisch oogpunt, kan de clearing procedures op basis van organische oplosmiddelen emissie blussen van fluorescerende eiwitten en andere fluorescerende kleurstoffen 7. Filtratie van het oplosmiddel om peroxiden te verwijderen, zoals beschreven door Becker et al.. 10, kan het handhaven van een goed niveau van fluorescentie ook oplosmiddelen gewist weefsels. Publicerened op waterbasis wismethodes 14 niet fluorescentie efficiëntie verminderen, maar resulteren in slechtere transparantie als het gaat om hele muizen hersenen, althans met lineaire optische technieken. Aan de andere kant, op het moment zijn er geen commerciële doelstellingen met lange werkafstand gecorrigeerd voor de hoge brekingsindex (n ≈ 1,56) clearing-oplossingen gebruikt. Zo is de brekingsindex mismatch tussen het medium waarin het monster wordt ondergedompeld en de inrichting een van de doelstelling leidt tot sterke sferische aberraties. Naast het reduceren van de resolutie van de microscoop, zoals afwijkingen hebben een druppel beeldintensiteit en contrast, aangezien het licht verspreid over een groter gebied. Mogelijke oplossingen voor dit probleem zijn het gebruik van adaptieve optiek 15 en / of statische asferische correctoren. Elke verbetering van het contrast en met de intensiteit gemakkelijk beïnvloedt ook belichtingssnelheid, omdat een kortere integration tijd per beeld kan worden gekozen. Momenteel CLSM kan veroorloven een beeldvormende snelheid van ongeveer 10 6 pm 3 / sec, met een blootstelling camera tijd van 100 msec 9. Bij deze snelheid duurt het 1-3 dagen op de foto om een ​​hele hersenen van muizen, afhankelijk van de steekproefomvang. Hoewel er geen significante verslechtering van de beeldkwaliteit wordt waargenomen gedurende zulke lange opnamesessie, vooral vanwege de intrinsieke lage photobleaching van licht plaat verlichting 6, de lange tijd die nodig is om een afbeelding met de hersenen van muizen kunnen in de praktijk beperken de toepasbaarheid van CLSM. Een 10-voudige toename in systeemrendement, in combinatie met het gebruik van een high-speed camera voor detectie, beeldvorming zou reduceren tot enkele uren, waarbij een routine van het beschreven protocol. Ondanks alle bovengenoemde beperkingen, CLSM beeldvorming gekoppeld aan chemische clearing van weefsels vergunningen om hele muis hersenen reconstrueren met micronschaal resolutie in minder dan eenweek. Andere optische methoden voor het hele brein beeldvorming veroorloven hogere resolutie dan CLSM, maar tegen de prijs van langere voorbereiding en / of beeldvorming 2-4, of van een schaars z sampling 5. De in dit artikel beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt in combinatie met verschillende strategieën voor fluorescentielabelling: transgene dieren tot expressie fluorescerende eiwitten in bepaalde neuronale subsets, virale transfectie intraparenchymateuze kleurstof injectie, etc. In de praktijk zijn alle vlekken strategieën voorgaande dieroffers verenigbaar met CLSM . In feite, is post-mortem fluorescentielabelling van gehele muis hersenen niet aangetoond tot nu toe, hoe dan ook, indien deze soort vlekken mogelijk zou zijn in de nabije toekomst, het aantal monsters dat kan worden gereconstrueerd met CLSM zal een stuk groter geworden, inclusief een mogelijk menselijk hersenweefsel. Concluderend confocale microscopie lichtwaaier in combinatie met tissue clearing en multi-resolutie data management kan kunnen onderzoekers te reconstrueren en te analyseren macroscopische exemplaren met een resolutie in de micron schaal, met de technologische inspanningen die goed zijn van de hand van de meeste laboratoria. Mogelijke toepassingen van CLSM zijn natuurlijk niet beperkt tot de neurowetenschap, maar omspant alle onderzoeksgebieden waarin licht vel microscopie is al gebruikt, zoals embryogenese 16,17 en anatomie van kleine dieren 18.

In vergelijking met ons begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen van de hersenfunctie, onze kennis van fijne neuroanatomie ziet er nog steeds in de kinderschoenen 1. In feite hebben we nog steeds geen uitgebreide kaarten van de positie van neuronale somata of van lange afstand projecties door de hersenen. Eigenlijk zijn veel technologische inspanningen met betrekking tot de hersenen van muizen te reconstrueren met microscopische resolutie. Optische methoden op basis van seriële opdeling van hars ingebedde monsters, zoals Knife-Edge scanning microscopie (KESM) 2, Micro-Optische-Sectie Tomografie (MOST) 3 en fluorescentie-MOST (fMOST) 4, kunnen sub-micron driedimensionale resolutie voor beeldvorming van hele hersenen van muizen. De totale tijd die de bereiding en beeldvorming van een monster in de orde van enkele weken, de praktische toepassing van dergelijke werkwijzen beperkt. Een andere techniek die gebaseerd is op de seriële snijden (maar zonder hars inbedding), Serial Two-Foton tomografie (STP) 5, maakt hoge driedimensionale resolutie beeldvorming. Echter, deze techniek is aangetoond in hele muis hersenen slechts met een zeer schaars bemonstering, het verzamelen van 1 punt per 50 pm 5, en onze kennis STP nog niet produceerde een full-bemonstering reconstructie van een muizen brein. Een geavanceerde optische methode om hele exemplaren reconstrueren in drie dimensies op hoge snelheid is licht vel microscopie 6. In dit optische stelsel voor monster wordt verlicht door een dunne plaat van licht en de fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het belichtingsvlak. Alleen op deze manier in-focus fluoroforen zijn enthousiast en het is mogelijk om optische sectie in brede veld configuratie bereiken, hoge framerates garanderen. Wanneer gekoppeld aan het opruimen protocollen gebaseerd op de vervanging van water met een brekingsindex bijpassende vloeistof 7, heeft licht vel microscopie toegepast opmacroscopische exemplaren in hele muis hersenen 8. Echter, specimen-geïnduceerde lichtverstrooiing, die zelfs gewist exemplaren beïnvloedt, degradeert het licht blad leidt tot de excitatie van out-of-focus fluoroforen die een totale vervaging van de verkregen beelden toevoegt. Als u alleen in-focus fotonen selectief verzamelen, hebben we onlangs gekoppeld licht plaat verlichting een confocale detectieschema 9. In confocale licht vel microscopie (CLSM), out-of-focus en verstrooide fotonen worden verworpen door een lineaire ruimtelijke filter (split) voorafgaand aan detectie (Figuur 1). Om confocale operatie lichtwaaier architectuur te bereiken, wordt de verlichtingssterkte door een aftastlijn en een statische afbeelding van de excitatie aftastlijn ter plaatse van de spleet een de-scansysteem in de detectie pad creëert. Een derde scansysteem reconstrueert een tweedimensionaal beeld op de camerasensor. CLSM biedt een 100% contrast verbetering in beschikbare muishersenen ten opzichte van conventionele lichtbronnen vel microscopie, met behoud van een 10 Hz beeldfrequentie. Met CLSM is het mogelijk om volledige muizenhersenen reconstrueren resolutie van 2 urn XY en 9 urn Z, en met voldoende contrast enkele fluorescent gelabelde neuronen onderscheiden. In dit artikel beschrijven we de experimentele pijpleiding naar een muis hersenen reconstrueren met CLSM. Aldehyde vaste muis hersenen zijn gedehydrateerd in een gegradeerde reeks peroxydevrij tetrahydrofuraan en vervolgens goedgekeurd in peroxydevrij dibenzylether (figuur 2), volgens het protocol ontwikkeld door Becker et al.. 10 De ontruimde monster wordt vervolgens zorgvuldig gemonteerd op een getipte bord en gepositioneerd in de beeldvorming kamer van een custom-made confocale licht vel microscoop. Het monster kan direct worden gemonteerd door storten het op een punt van de plaat (figuur 3a), als alternatief kan worden gelijmd op een schijf van ontruimde agarosegel (Figuur3b) worden geplaatst in de holte van een bekerglas van gewist agarosegel (Figuur 3c). Een optische tomografie van de gehele hersenen wordt vervolgens uitgevoerd, zoals vele parallelle aangrenzende stapels verworven alle hersenvolume (figuur 4) omvatten. Een pre-tomografie van steekproeven, die een ruwe kaart van het monster positie en de vorm produceert, garandeert dat de beeldvorming wordt alleen uitgevoerd in het volume ingenomen door het monster. De tomografie stapels worden vervolgens aan elkaar geplakt met op maat gemaakte software en opgeslagen in een multi-resolutie hiërarchische regeling 11. Muis hersenen kan uiteindelijk worden verkend met prototypische multi-resolutie Google Maps-achtige visualisatie software. Beide software-instrumenten zijn als plugins in de open-source platform Vaa3D 12. We zien eindelijk representatieve afbeeldingen van de muis hersenen om de mogelijkheden van de beschreven experimentele pijpleiding in het bestuderen van fijne muizen neuroanatom toneny.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417_100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W218405</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type III-A, High EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic glue</td><td>Bostik</td><td>D2498</td><td></td></tr><tr><td>Vaa3D software</td><td>open source</td><td></td><td>gratis te downloaden van <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td></tr></tbody></table>

micronschaal resolutie optische tomografie van gehele mouse brains met confocale light sheet microscopie

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Inzicht in de architectuur van de hersenen van zoogdieren bij eencellige resolutie is een van de kernpunten van de neurowetenschappen. Echter, in kaart brengen van neuronale soma en projecties in het hele brein is nog steeds een uitdaging voor de beeldvorming en data management-technologieën. Inderdaad, moeten macroscopisch volumes worden gereconstrueerd met een hoge resolutie en contrast in een redelijke tijd, het produceren van datasets in het TeraByte bereik. We hebben onlangs aangetoond dat een optische methode (confocale microscopie licht blad, CLSM) in staat was geweest micronschaal reconstructie van hele hersenen van muizen gelabeld met versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP). De combinatie van licht plaat verlichting en confocale detectie, CLSM maakt een diepe beeldvorming in macroscopische ontruimd exemplaren met een hoog contrast en snelheid. Hier de volledige experimentele pijplijn beschrijven we uitgebreide en leesbare beelden van de hele hersenen van muizen gelabeld met fluorescerende eiwitten te verkrijgen. De verrekening en de montage-pROCEDURES worden beschreven met de stappen om een ​​optische tomografie voeren op het gehele volume verwerven vele parallelle aangrenzende stapels. We toonden het gebruik van open-source-software op maat hulpmiddelen waarmee stiksels van de meerdere stacks en multi-resolutie data navigatie. Tenslotte hebben we geïllustreerd enkele voorbeelden van hersenenkaarten: het cerebellum van een L7-GFP transgene muizen, waarbij alle Purkinje cellen selectief worden gemerkt en de hele hersenen van een thy1-GFP-M muis, gekenmerkt door een willekeurige dun neuronale labeling.

De beschreven protocol kan worden gereconstrueerd met micron-schaal resolutie hetzij volledige muizenhersenen of uitgesneden delen, zonder de noodzaak van fysieke snijden. Als representatief resultaat, in figuur 6 de gehele cerebellum een L7-GFP muis (postnatale dag 10) wordt getoond. In dit dier al Purkinjeneuronen zijn gelabeld met EGFP. Als we inzoomen, kan de typische lamellaire structuur van de cerebellaire schors worden gezien (figuur 7). Verder inzoomen maakt duidelijk onderscheid elke Purkinje cel soma (figuur 8). De beschreven protocol kan derhalve worden gebruikt om neuronale ruimtelijke organisatie screenen verschillende neurologische studies. Als tweede representatief resultaat, presenteren we beelden van de unsectioned hersenen van een volwassen thy1-GFP-M muis. In deze transgene dieren EGFP wordt uitgedrukt in een willekeurige dun neuronale deelverzameling. De rechterhelft van de hersenen getoond in figuur 9. Zoals weinzoomen steeds verder (Figuren 10 en 11), neuronale processen worden onderscheiden. Dit resultaat toont aan dat de beschreven protocol maakt micronschaal resolutie beeldvorming in hele volwassen muis hersenen, het openen van de mogelijkheid van het bestuderen van de hersenen als geheel anatomie op cellulair resolutie in muismodellen van neurodegeneratieve ziekte. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figuur 1. Optische schema van confocale licht vel microscopie (CLSM). (A) Bovenaanzicht van het apparaat, met de excitatie pad. Laser emissie van een 488 nm diode-gepompte solid state (DPSS) laser, na uitbreiding en collimatie door een eerste telescoop, gaat een akoestisch-optische afstembare filter (AOTF) die lichtintensiteit regelt. Dan, een tweede telescoop breidt verder de balk. Een galvo spiegel verticaal (langs de y) scant het zijn<html> uur, die wordt gefocusseerd door een lens in het monster kamer. (b) Zijaanzicht van de inrichting, die de detectie route. Licht van de doelstelling detectie verzameld wordt verticaal descanned door een galvo spiegel en gefocusseerd door een lens, een vast beeld van het bewegende excitatie lijn produceren. Ter plaatse van het vaste beeld lineair ruimtelijk filter (spleet) is geplaatst. Na de spleet, een galvo spiegel geplaatst in een 4f lenzenstelsel reconstrueert een 2-dimensionale afbeelding op de chip van een elektron vermenigvuldiging ladingsgekoppelde inrichting (CCD-EM). Een fluorescentie bandpassfilter verwijder alle excitatie strooilicht voor detectie. Vertegenwoordiger stralen van excitatie, detectie en-bandpass gefilterd detectie licht worden weergegeven door de blauwe, lichtblauwe en groene stralen, respectievelijk. De brandpuntsafstanden van alle objectieven daadwerkelijk bij de microscoop worden aangegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figuur 2. Model clearing. Formaldehyde vaste muizenhersenen, die zijn opgeslagen in PBS 0,1 M bij 4 ° C (a), gedehydrateerd in een gegradeerde reeks van tetrahydrofuran (THF, b) en vervolgens 100% dibenzylether gewist (DBE , c). De dehydratatiestap veroorzaakt ook wat weefsel krimp. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figuur 3. Model bevestiging voor CLSM beeldvorming. Het heldere hersenen kunnen direct worden gestort op de getipt montageplaat (a), gelijmd op een open agarose disc (b), of opgenomen in een open agarose bekerglas (c). Figuur 4. Tomografie acquisitie. Het pre-tomografie routine monsters een parallellepipedum met de hersenen (a) het aantal en de lengte van parallelle aangrenzende stapels nodig beeld alle specimen define (b). Na tomografie worden zwarte afbeeldingen gegenereerd om de virtuele verkregen volume voltooien een parallellepipedum (c). <img alt="Figuur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figuur 5. Volume stiksels. De verzamelde image stacks gedeeltelijk overlappen tussen elkaar (a), waardoor de precieze afstemming op de TeraStitcher plugin (b). De plugin voegt vervolgens de uitgelijnde stapels in een enkele gestapelde (c) of multi-stacked (d) multi-resolutie weergave. <img alt="Figuur 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figuur 6. Hele cerebellum van P10 L7-GFP muis, waarbij alle Purkinje neuronen gelabeld met EGFP. Schalingsbalk 1 mm. <img alt="Figuur 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figuur 7. Inzoomen van een gedeelte van het cerebellum is getoond in figuur 6, met de kenmerkende lamellaire structuur van de cerebellaire cortex. Schalingsbalk 500 urn. <img alt="Figuur 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figuur 8. Verder inzoomen van een gedeelte van de in figuur 6 cerebellum. Purkinje cellen soma duidelijk worden onderscheidened.. Schaal bar, 200 micrometer. <img alt="Figuur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figuur 9. Rechterhelft van de hersenen van een volwassen thy1-GFP-M muis, gekenmerkt door een dun niet-specifieke neuronale EGFP etikettering. Schalingsbalk 1 mm. <img alt="Figuur 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figuur 10. Inzoomen van een gedeelte van de halve hersenen figuur 9, die een deel van de hippocampus en cortex. Schalingsbalk 200 urn. <img alt="Figuur 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figuur 11. Verder inzoomen van een gedeelte van de halve hersenen figuur 9. Aantal neurieten in de cortex duidelijk onderscheiden kunnen worden. Schaalbalk, 50 urn.

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Het algemene doel van deze procedure is het reconstrueren en visualiseren van een volledige muizenhersenen met een resolutie op micronschaal. Dit wordt bereikt door eerst een gefixeerde serie tetrahedraal geïntegreerde muizenhersenen te dehydrateren. De tweede stap is het klaren van het monster in benzylether.Vervolgens wordt het brein afgebeeld met een confocale light-sheet microscoop. De laatste stap is het gebruik van software om de verkregen beeldstacks uit te lijnen en aan elkaar te hechten. Uiteindelijk kan een visualisatietool met meerdere resoluties worden gebruikt om door het gereconstrueerde beeldvolume te navigeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals confocale of fotomicroscopie, is dat het volledige volume van een muizenbrein in slechts enkele dagen in beeld kan worden gebracht. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de distributie van verschillende neurontypes in het gehele brein. Biedt deze methode inzicht in de fijne anatomie van het brein?Het kan ook worden toegepast op muizenembryo's of fruitvliegen, wat aantoont dat de procedure kan worden herhaald. Een promovendus uit mijn laboratorium. Om dit protocol te starten, voert u een standaard fixatie van muizenhersenen uit via transcardiale perfusie en postfix u deze een nacht voordat u overgaat tot dehydratatie en clearing.Aangezien het dehydratie-oplosmiddel, THF, XFP-fluorescentie sterk dooft, dient er filtratie te worden uitgevoerd om peroxiden te verwijderen met basisch geactiveerd aluminiumoxide met behulp van een chromatografiekolom; vermijd barsten in de kolom, aangezien dit de verwijdering van peroxiden zou verminderen bij een stabilisator in de uiteindelijke oplossing. Zelfs als de THF vóór filtratie al gestabiliseerd was, zal de stabilisator door het aluminiumoxide worden vastgehouden. Let op dat THF zonder stabilisator grote hoeveelheden peroxiden kan ontwikkelen en explosief en gevaarlijk kan zijn.Dehydrateer vervolgens de volledige geïntegreerde reeks van de muizenhersenen in THF in puur water. Plaats daarna het vial met de sample op een draaiwiel om blootstelling aan licht te voorkomen. Wikkel het vial in aluminiumfolie.Filter ten slotte het heldermaakmiddel met aluminiumoxide met behulp van een filtertrechter. Maak de monster vervolgens helder in 100%DBE, waarbij de oplossing na drie en zes uur wordt ververst wanneer het brein transparant begint te worden. Monteer het monster gewoonlijk één uur na de tweede DBE-verversing op een gekantelde beeldplaat volgens een van de hier beschreven methoden.Directe montage via een agros-schijf of montage via een agros-speaker voor directe montage; dompel het monster voorzichtig op een van de tips om de agros-schijf-methode te gebruiken. Een schijf gemaakt van 6% agros-gel op de tips. Fixeer vervolgens het monster voorzichtig op de agros-schijf met acryllijm en wacht ongeveer één minuut tot de uitharding voor montage is voltooid.Gebruik de agros-bekerplunjer om een beker gemaakt van 3% agros-gel op de tips aan te brengen. Plaats vervolgens voorzichtig de monster op de bodem van de beker. Nadat het specimen met een van deze methoden is gemonteerd, wordt de beeldbuis met een pincet in de specimenkamer geplaatst.Vul vervolgens de kamer met de heldermakingsoplossing. Bereid daarna de tomografie voor. Verwijder eerst de spleet om zoveel mogelijk fluorescentie op te vangen en belicht vervolgens het monster met een laag laservermogen.Om fotobleken te voorkomen, verplaatst u het monster in de drie x-, y- en Z-richtingen met behulp van het door software aangestuurde micro-positioneringssysteem. Bepaal voor elke richting de minimale en maximale coördinaten waarbij het monster wordt belicht terwijl het zich binnen het gezichtsveld van de camera bevindt. Voer vervolgens de bepaalde coördinaten in als parameters voor de subroutines voor de pre-tomografie.Geef daarnaast de afstand tussen opeenvolgende stacks die voor de tomografie worden gebruikt en de voorafgaande tomografie-bemonsteringsstap in de Z-richting op. Start tot slot de pre-tomografie, waarbij de beelden in elke stack worden verzameld met de Z-bemonsteringsparameters zoals gespecificeerd in de vorige stap. Verplaats bij het starten van de acquisitie eerst het monster buiten het lichtveldpaneel met behulp van het micropositioneringssysteem.Verhoog vervolgens het laservermogen en stop de beweging van alle scanningsystemen om alleen een vaste lijn in het centrum van het gezichtsveld te verlichten. Monteer daarna de spleet en richt deze uit met behulp van het autofluorescentiesignaal van de clearing-oplossing. De spleetlijn moet nu duidelijk zichtbaar zijn in het centrum van het gezichtsveld.Activeer nu het scansysteem opnieuw. Verlaag het laservermogen en verplaats het monster in het lichtveld met behulp van het micro-positioneringssysteem. Houd er rekening mee dat het laservermogen dat bij gebruik van de spleet wordt toegepast, hoger zal zijn dan het vermogen zonder de spleet.Aangezien het ruimtelijke filter een niet verwaarloosbaar deel van het licht blokkeert, moeten de amplitude en offset van de scan- en d-scansystemen met de besturingssoftware worden aangepast totdat de beelden helder en lichtsterk zijn. Stel vervolgens de geschikte Z-stap voor het experiment in en start de software voor de tomografie-acquisitie. Het volume wordt in veel parallelle, gedeeltelijk overlappende stacks afgebeeld, en de beelden worden opgeslagen in een hiërarchische mappenstructuur.Om de stitching-software met een volledig kubisch volume te laten werken, moet het verkregen volume worden aangevuld met synthetische zwarte beelden; dit zijn beelden van hetzelfde type en met dezelfde afmetingen als de verzamelde beelden, maar met een intensiteit van nul, gegenereerd met geautomatiseerde software. Start vervolgens de VA A 3D-software met de geïnstalleerde plug-ins Terra, Stitcher en tarly, en laad de Terra Stitcher-plug-in. Selecteer de directory met het gefotografeerde volume en geef de relatieve oriëntaties van de assen aan ten opzichte van een referentieronddraaiend rechtsdraaiend coördinatensysteem en de voxelgrootte.Start nu het eerste deel van het samenvoegen (stitching). De software berekent de relatieve verschuiving tussen paren stacks en bepaalt een algehele optimale plaatsing voor alle stacks samen; selecteer vervolgens om het samengevoegde volume op te slaan in een enkel-resolutie- of multi-resolutieformaat. De laatste optie maakt multi-resolutie-visualisatie mogelijk met de tarly-plugin.In beide gevallen, indien de afbeelding met hogere resolutie groter is dan enkele gigabytes, selecteert u daarnaast de opslagmodaliteit 'multi-stack' en specificeert u de grootte van de individuele sub-stacks. Dit maakt een efficiënte toegang tot de opgeslagen gegevens mogelijk. Start nu het tweede deel van het stitching-proces.De software voegt de uitgelijnde stacks samen en slaat deze op in een enkelvoudige of meervoudige stack-modus. Sluit de Terra Stitcher-plugin zodra dit is voltooid. Laad vervolgens de terra fly-plugin.Selecteer de map met het multi-stack volume met meerdere resoluties en geef de grootte van het foxhole en de asoriëntaties aan. Het volume wordt geladen op de laagste resolutie. Gebruik simpelweg het muiswiel om in te zoomen naar een hogere resolutie.Als alternatief kan men dubbelklikken op een specifiek punt van de afbeelding, kiezen om in te zoomen rond een bestaand kenmerk, of direct de coördinaten van het volume van belang specificeren. Om terug te keren naar een lagere resolutie, kan men simpelweg het muiswieltje gebruiken. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om volledige muizenhersenen of uitgesneden delen te reconstrueren met een resolutie op micron-schaal, zonder dat fysieke sectionering noodzakelijk is.Als representatief resultaat wordt hier het gehele cerebellum van een L7 GFP-muis op postnatale dag 10 getoond. Alle Purkinje-cellen zijn gelabeld met EGFP. Na het inzoomen is de typische lamellaire structuur van de cerebellaire cortex zichtbaar; verder inzoomen maakt het mogelijk om elk soma van de Purkinje-cellen duidelijk te onderscheiden.Het beschreven protocol kan dus worden gebruikt om de ruimtelijke organisatie van neuronen te screenen in diverse neurodevelopmentale studies. Als tweede representatief resultaat zien we hier beelden van de doorsneden hersenen van een volwassen GFPM-muis. Bij dit transgene dier wordt EGFP tot expressie gebracht in een willekeurige, schaarse subset van neuronen.De rechterhelft van de hersenen wordt hier getoond. Naarmate we verder inzoomen, worden neuronale uitlopers onderscheidbaar. Dit resultaat demonstreert dat het beschreven protocol beeldvorming met resolutie op micron-schaal in volledige volwassen muizenhersenen mogelijk maakt, wat de mogelijkheid opent om de anatomie van de gehele hersenen op cellulair niveau te bestuderen.In muismodellen van neurodegeneratieve ziekten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier dagen worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dehydratie- en reinigingsoplossing zorgvuldig te filteren om de GFP-fluorescentie te behouden. De hier gepresenteerde visualisatietool met meerdere resoluties kan ook worden gebruikt om zeer grote datasets te verkennen die met andere technieken zijn verkregen, zoals micro-optische sectietomografie.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u gefixeerd muizenbrein kunt dateren, kleuren en klaren. U leert deze te beelden met confocale sheet-microscopie en het gereconstrueerde volume te visualiseren met VR 3D met behulp van de Tely-plugin.

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Multifoton microscopie van hele muis organen is mogelijk door de clearing optisch orgaan voor beeldvorming, maar niet alle protocollen behouden het fluorescerende signaal van fluorescerende eiwitten. Met behulp van een optische clearing methode met ethanol op basis van uitdroging en benzylalcohol: benzylbenzoaat clearing, tonen we een hoge resolutie multifoton beelden van de hele hersenen van muizen uiten YFP.

Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP

Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward an injected compound in brain slices. It provides an overview of preparing mouse brain slices, injecting a chemoattractant test compound, and imaging fluorescently labeled microglia to visualize their responses.

Two-Photon Microscopy for Studying Microglial Process Attraction Toward a Compound in a Mouse Brain Slice

Source: Pekarek, B. T., et. al., Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021)In this video, we demonstrate the preparation, imaging, and analysis of a cleared mouse brain to examine dendritic arbors, spine morphology, and neuronal distribution using confocal microscopy and 3D reconstruction techniques.

Confocal Microscopy Imaging of Intact Dendritic Arbors and Spine Morphology in a Cleared Mouse Brain

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.

Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer hoe je een volledige muizenhersenen met micronresolutie reconstrueert en visualiseert met confocale light sheet microscopie. Deze methode maakt snelle, hoogwaardige beeldvorming van neurale anatomie mogelijk.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Meer video's verkennen