Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het reconstrueren en visualiseren van een volledige muizenhersenen met een resolutie op micronschaal. Dit wordt bereikt door eerst een gefixeerde serie tetrahedraal geïntegreerde muizenhersenen te dehydrateren. De tweede stap is het klaren van het monster in benzylether.

Vervolgens wordt het brein afgebeeld met een confocale light-sheet microscoop. De laatste stap is het gebruik van software om de verkregen beeldstacks uit te lijnen en aan elkaar te hechten. Uiteindelijk kan een visualisatietool met meerdere resoluties worden gebruikt om door het gereconstrueerde beeldvolume te navigeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals confocale of fotomicroscopie, is dat het volledige volume van een muizenbrein in slechts enkele dagen in beeld kan worden gebracht. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de distributie van verschillende neurontypes in het gehele brein. Biedt deze methode inzicht in de fijne anatomie van het brein?

Het kan ook worden toegepast op muizenembryo's of fruitvliegen, wat aantoont dat de procedure kan worden herhaald. Een promovendus uit mijn laboratorium. Om dit protocol te starten, voert u een standaard fixatie van muizenhersenen uit via transcardiale perfusie en postfix u deze een nacht voordat u overgaat tot dehydratatie en clearing.

Aangezien het dehydratie-oplosmiddel, THF, XFP-fluorescentie sterk dooft, dient er filtratie te worden uitgevoerd om peroxiden te verwijderen met basisch geactiveerd aluminiumoxide met behulp van een chromatografiekolom; vermijd barsten in de kolom, aangezien dit de verwijdering van peroxiden zou verminderen bij een stabilisator in de uiteindelijke oplossing. Zelfs als de THF vóór filtratie al gestabiliseerd was, zal de stabilisator door het aluminiumoxide worden vastgehouden. Let op dat THF zonder stabilisator grote hoeveelheden peroxiden kan ontwikkelen en explosief en gevaarlijk kan zijn.

Dehydrateer vervolgens de volledige geïntegreerde reeks van de muizenhersenen in THF in puur water. Plaats daarna het vial met de sample op een draaiwiel om blootstelling aan licht te voorkomen. Wikkel het vial in aluminiumfolie.

Filter ten slotte het heldermaakmiddel met aluminiumoxide met behulp van een filtertrechter. Maak de monster vervolgens helder in 100%DBE, waarbij de oplossing na drie en zes uur wordt ververst wanneer het brein transparant begint te worden. Monteer het monster gewoonlijk één uur na de tweede DBE-verversing op een gekantelde beeldplaat volgens een van de hier beschreven methoden.

Directe montage via een agros-schijf of montage via een agros-speaker voor directe montage; dompel het monster voorzichtig op een van de tips om de agros-schijf-methode te gebruiken. Een schijf gemaakt van 6% agros-gel op de tips. Fixeer vervolgens het monster voorzichtig op de agros-schijf met acryllijm en wacht ongeveer één minuut tot de uitharding voor montage is voltooid.

Gebruik de agros-bekerplunjer om een beker gemaakt van 3% agros-gel op de tips aan te brengen. Plaats vervolgens voorzichtig de monster op de bodem van de beker. Nadat het specimen met een van deze methoden is gemonteerd, wordt de beeldbuis met een pincet in de specimenkamer geplaatst.

Vul vervolgens de kamer met de heldermakingsoplossing. Bereid daarna de tomografie voor. Verwijder eerst de spleet om zoveel mogelijk fluorescentie op te vangen en belicht vervolgens het monster met een laag laservermogen.

Om fotobleken te voorkomen, verplaatst u het monster in de drie x-, y- en Z-richtingen met behulp van het door software aangestuurde micro-positioneringssysteem. Bepaal voor elke richting de minimale en maximale coördinaten waarbij het monster wordt belicht terwijl het zich binnen het gezichtsveld van de camera bevindt. Voer vervolgens de bepaalde coördinaten in als parameters voor de subroutines voor de pre-tomografie.

Geef daarnaast de afstand tussen opeenvolgende stacks die voor de tomografie worden gebruikt en de voorafgaande tomografie-bemonsteringsstap in de Z-richting op. Start tot slot de pre-tomografie, waarbij de beelden in elke stack worden verzameld met de Z-bemonsteringsparameters zoals gespecificeerd in de vorige stap. Verplaats bij het starten van de acquisitie eerst het monster buiten het lichtveldpaneel met behulp van het micropositioneringssysteem.

Verhoog vervolgens het laservermogen en stop de beweging van alle scanningsystemen om alleen een vaste lijn in het centrum van het gezichtsveld te verlichten. Monteer daarna de spleet en richt deze uit met behulp van het autofluorescentiesignaal van de clearing-oplossing. De spleetlijn moet nu duidelijk zichtbaar zijn in het centrum van het gezichtsveld.

Activeer nu het scansysteem opnieuw. Verlaag het laservermogen en verplaats het monster in het lichtveld met behulp van het micro-positioneringssysteem. Houd er rekening mee dat het laservermogen dat bij gebruik van de spleet wordt toegepast, hoger zal zijn dan het vermogen zonder de spleet.

Aangezien het ruimtelijke filter een niet verwaarloosbaar deel van het licht blokkeert, moeten de amplitude en offset van de scan- en d-scansystemen met de besturingssoftware worden aangepast totdat de beelden helder en lichtsterk zijn. Stel vervolgens de geschikte Z-stap voor het experiment in en start de software voor de tomografie-acquisitie. Het volume wordt in veel parallelle, gedeeltelijk overlappende stacks afgebeeld, en de beelden worden opgeslagen in een hiërarchische mappenstructuur.

Om de stitching-software met een volledig kubisch volume te laten werken, moet het verkregen volume worden aangevuld met synthetische zwarte beelden; dit zijn beelden van hetzelfde type en met dezelfde afmetingen als de verzamelde beelden, maar met een intensiteit van nul, gegenereerd met geautomatiseerde software. Start vervolgens de VA A 3D-software met de geïnstalleerde plug-ins Terra, Stitcher en tarly, en laad de Terra Stitcher-plug-in. Selecteer de directory met het gefotografeerde volume en geef de relatieve oriëntaties van de assen aan ten opzichte van een referentieronddraaiend rechtsdraaiend coördinatensysteem en de voxelgrootte.

Start nu het eerste deel van het samenvoegen (stitching). De software berekent de relatieve verschuiving tussen paren stacks en bepaalt een algehele optimale plaatsing voor alle stacks samen; selecteer vervolgens om het samengevoegde volume op te slaan in een enkel-resolutie- of multi-resolutieformaat. De laatste optie maakt multi-resolutie-visualisatie mogelijk met de tarly-plugin.

In beide gevallen, indien de afbeelding met hogere resolutie groter is dan enkele gigabytes, selecteert u daarnaast de opslagmodaliteit 'multi-stack' en specificeert u de grootte van de individuele sub-stacks. Dit maakt een efficiënte toegang tot de opgeslagen gegevens mogelijk. Start nu het tweede deel van het stitching-proces.

De software voegt de uitgelijnde stacks samen en slaat deze op in een enkelvoudige of meervoudige stack-modus. Sluit de Terra Stitcher-plugin zodra dit is voltooid. Laad vervolgens de terra fly-plugin.

Selecteer de map met het multi-stack volume met meerdere resoluties en geef de grootte van het foxhole en de asoriëntaties aan. Het volume wordt geladen op de laagste resolutie. Gebruik simpelweg het muiswiel om in te zoomen naar een hogere resolutie.

Als alternatief kan men dubbelklikken op een specifiek punt van de afbeelding, kiezen om in te zoomen rond een bestaand kenmerk, of direct de coördinaten van het volume van belang specificeren. Om terug te keren naar een lagere resolutie, kan men simpelweg het muiswieltje gebruiken. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om volledige muizenhersenen of uitgesneden delen te reconstrueren met een resolutie op micron-schaal, zonder dat fysieke sectionering noodzakelijk is.

Als representatief resultaat wordt hier het gehele cerebellum van een L7 GFP-muis op postnatale dag 10 getoond. Alle Purkinje-cellen zijn gelabeld met EGFP. Na het inzoomen is de typische lamellaire structuur van de cerebellaire cortex zichtbaar; verder inzoomen maakt het mogelijk om elk soma van de Purkinje-cellen duidelijk te onderscheiden.

Het beschreven protocol kan dus worden gebruikt om de ruimtelijke organisatie van neuronen te screenen in diverse neurodevelopmentale studies. Als tweede representatief resultaat zien we hier beelden van de doorsneden hersenen van een volwassen GFPM-muis. Bij dit transgene dier wordt EGFP tot expressie gebracht in een willekeurige, schaarse subset van neuronen.

De rechterhelft van de hersenen wordt hier getoond. Naarmate we verder inzoomen, worden neuronale uitlopers onderscheidbaar. Dit resultaat demonstreert dat het beschreven protocol beeldvorming met resolutie op micron-schaal in volledige volwassen muizenhersenen mogelijk maakt, wat de mogelijkheid opent om de anatomie van de gehele hersenen op cellulair niveau te bestuderen.

In muismodellen van neurodegeneratieve ziekten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier dagen worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dehydratie- en reinigingsoplossing zorgvuldig te filteren om de GFP-fluorescentie te behouden. De hier gepresenteerde visualisatietool met meerdere resoluties kan ook worden gebruikt om zeer grote datasets te verkennen die met andere technieken zijn verkregen, zoals micro-optische sectietomografie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u gefixeerd muizenbrein kunt dateren, kleuren en klaren. U leert deze te beelden met confocale sheet-microscopie en het gereconstrueerde volume te visualiseren met VR 3D met behulp van de Tely-plugin.