Name: Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer een fluorescerende exonuclease-assay om enzymactiviteit te meten met fluorescerende DNA-substraten en gel-elektroforese. Deze methode biedt reproduceerbare resultaten voor het bestuderen van genoomstabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het inter-raadsprogramma New Dynamics of Ageing voor het financieren van dit werk [ES/G037086/1] en Prof Dave Sherratt (Afdeling Biochemie, Universiteit van Oxford) voor toegang tot de Fuji FLA-3000.

1. Preparatie van substraat-oligonucleotiden
<ol>
	<li>Synthesizeer aangepaste oligonucleotiden.
	<ol>
		<li>Ontwerp een enkelstrengs oligonucleotide met een 5'-geconjugeerd fluoresceïnemolecuul; dit zal de ruggengraat zijn voor elk substraat. (Opmerking: dit is voor een 3'-5' exonuclease; voor een 5'-3' polariteit exonuclease gebruik een 3'-geconjugeerd ruggengraatstreng). Als de polariteit niet bekend is, moeten zowel 3' als 5' worden getest.</li>
		<li>Ontwerp complementaire strengen zodat wanneer ze worden geannealed met het fluorescerend gelabelde oligonucleotide, de gewenste duplex substraat(en) worden gevormd. Merk op dat de complementaire streng niet geconjugeerd is aan een fluorfoor. Bij het bestellen, specificeer PAGE-zuivering (ontzilting is niet voldoende).</li>
		<li>Bewaar oligonucleotide stocks gebufferd in 10 mM bij 1 nmol/μl bij −20 °C en in het donker.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Meng het ruggengraat gelabelde oligonucleotide met elke complementaire ongelabelde oligonucleotide in een 1:1.2 molaire verhouding van gelabeld:ongelabeld in buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl). (Opmerking: een 1:1 verhouding is het meest wenselijk, maar het is belangrijker dat ALLES van de gelabelde streng gebonden is. Ratio's van 1:1 - 1:1.5 kunnen werken.)</li>
	<li>Verwarm een waterbad of heatblock tot 95 °C en plaats het annealing mengsel hierin gedurende 3 min. Zet vervolgens uit en laat het geheel langzaam afkoelen (1 °C/min) tot onder de 30 °C.</li>
	<li>Controleer volledige annealing van het gelabelde oligonucleotide door het resulterende duplex substraat op een native 10% polyacrylamide gel te draaien (10% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide in 1x Tris-Borate-EDTA (TBE, 89 mM Tris base, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA) gepolymeriseerd met 0.05% w/v ammoniumpersulfaat (APS) en 0.005% v/v TEMED). Visualiseer via PhosphorImager (zie sectie 5 hieronder).</li>
</ol>
2. Preparatie van Acrylamide Gels
<ol>
	<li>Stel het gel-gietsysteem in bijv. Hoefer SE400 gel rig met 16 cm x 18 cm platen en 1.5 mm ruimtes.
	<ol>
		<li>Reinig glasplaten en ruimtes grondig met detergent en water. Draag schone handschoenen om te voorkomen dat de platen opnieuw vervuild worden met olie van de vingers, wat een consistente gelvorming zou belemmeren.</li>
		<li>Spoel de platen met veel gedestilleerd (gedeioniseerd) water om resten van detergent te verwijderen, en droog vervolgens af met pluisvrij papier (bijv. Kimwipes).</li>
		<li>Spuiten tenslotte met 70% ethanol en veeg - glasplaten moeten piepen als ze schoon zijn. Zet ze rechtop opzij om het laatste ethanol te laten verdampen.</li>
		<li>Reinig de rest van de gelvormende apparatuur met gedestilleerd water (gebruik eerst detergent indien nodig) en droog af.</li>
		<li>Monteer de glasplaten en ruimtes in de gelvormende rig, zorg ervoor dat het systeem lekvrij is.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid de geloplossing voor tot het gewenste polyacrylamide percentage
	<ol>
		<li>Voor nuclease assay, gebruik denaturerende 14% polyacrylamide gels met 8 M ureum in 1x TBE.</li>
		<li>Om 100 ml te maken (genoeg voor 2 gels met veel overtollig voor lekkage) neem 48.05 g ureum in een brede beker en voeg 35 ml 40% 19:1 acrylamideoplossing en 10 ml 10x TBE (890 mM Tris, 890 mM boorzuur, 20 mM EDTA, pH 8.3 met NaOH) toe. LET OP: Draag handschoenen - acrylamide is een krachtig neurotoxine. Los het ureum op met een roerstaaf en magnetisch roerplateau (dit zal enige tijd duren).</li>
		<li>Wanneer opgelost, voeg milliQ-gedeioniseerd water toe tot 100 ml. Filter-steriliseer met een 0.22 μm membraan. Indien niet onmiddellijk te gebruiken, degas kort met zuigapparatuur en bewaar in het donker (blijft enkele dagen goed). Niet koelen omdat het ureum zal precipiteren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polymeriseren en gieten van de gel.
	<ol>
		<li>Neem de ureum-acrylamide en voeg 0.5 ml 10% (w/v) ammoniumpersulfaat (APS, opgelost in gedestilleerd water) en 50 μl TEMED toe. Draai de container langzaam om te mengen zonder lucht in te brengen (wat polymerisatie zal remmen) en giet het in de gelvormer. Doe snel, anders kan de gel gaan stollen voordat het gieten is voltooid.</li>
		<li>Voeg de juiste kam toe om putjes te vormen voor het laden van monsters (gekozen volgens het gel-rig en het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd bijv. 15- of 29-tandige kammen zijn geschikt voor gebruik met de Hoefer gel-rig). Controleer dat er geen luchtbellen onder de kamtandjes zijn.</li>
		<li>Laat stollen. Controleer op lekkage. Volledige polymerisatie wordt vertraagd bij de kammen vanwege contact met de atmosfeer. Wanneer de putjes stevig zijn, zal de rest van de gel zijn gestold.</li>
		<li>Verwijder de kammen en spoel het ongepolymeriseerde acrylamide weg met water en een pipette.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stel de gel in voor het draaien.
	<ol>
		<li>Plaats de gegoten gel in het gel-loopsysteem en voeg de juiste hoeveelheid 1x TBE-loopbuffer toe aan de onderste kamer en in de gelputjes. De gel is nu klaar om te worden geladen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Preparatie van His-gelabeld Recombinant DmWRNexo Proteïne
<ol>
	<li>Bacteriële expressie van DmWRNexo proteïne
	<ol>
		<li>Gebruik een inoculatieloep om bacteriën te verzamelen door over het oppervlak te schrapen van glycerolvoorraden

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bepaling van de exonuklease-activiteit van gezuiverde eiwitten vereist de analyse van DNA-splitsingsproducten. Sequentiële splitsing van DNA door exonukleasen kan worden gevisualiseerd door scheiding van gelabelde splitsingsproducten op acrylamidegels. Historisch gezien hield dit het end-labeling van het DNA-substraat met een radiolabel in (bijv. 32P of 35S), maar met de nadelen die inherent zijn aan het gebruik van radiolabel (kosten, veiligheidsproblemen en instabiliteit in de loop van...

Nucleases spelen een essentiële rol in cellen bij het verwijderen van beschadigd DNA, het oplossen van niet-duplexstructuren zoals Holliday-juncties en het bieden van een correctiecapaciteit tijdens DNA-replicatie, zowel intrinsiek binnen DNA-polymerasen als extrinsiek ten opzichte van hen1. Nucleasen kunnen werken door DNA sequentieel af te breken vanaf vrije uiteinden (exonucleasen) of door interne fosfodiësterbindingen binnen een langere DNA-molecuul te klieven (endonucleasen). Verlies van nuclease-activiteit kan resulteren in zeer specifieke fenotypes van genomische instabiliteit. Terwijl mutatie van het RecQ-helicasefamilielid BLM resulteert in extreem hoge percentages van zusterchromatidenuitwisseling en globaal verhoogde kankerpercentages (beoordeeld door Payne en Hickson2), leidt mutatie van het nauw verwante WRN-eiwit tot vroegtijdige veroudering3; het belangrijkste significante verschil tussen deze twee familieleden is de aanwezigheid van een 3'-5'-exonucleasedomein in WRN4. Bewijs van een cruciale rol van de WRN-exonuclease bij het handhaven van genomische stabiliteit is verzameld uit analyse van genotypen bij WS-patiënten5, samen met puntmutatie- en deletiestudies in menselijke cellen, ondersteund door kristallografische studies van het geïsoleerde exonucleasedomein6. Echter, samenwerking en interactie tussen de exonuclease-activiteit van WRN en zijn centrale helicase-activiteit7 maakt het moeilijk om de functionaliteit van elk afzonderlijk te onderscheiden en hun relatieve bijdragen aan genomische stabiliteit. In planten en lagere metazoaanse dieren is de WRN-exonuclease-activiteit aanwezig op een enkele polypeptide zonder helicase-activiteit8-10 (beoordeeld in Cox en Boubriak11); het is biochemisch aangetoond in Arabidopsis dat deze exonuclease coördineert met de cognate WRN-helicase, effectief de gecombineerde enzymactiviteiten reconstrueert die worden waargenomen in vertebrate WRN9. We hebben WRN-exonuclease bestudeerd in Drosophila omdat de uitstekende genetische tools analyse mogelijk maken van de impact van exonuclease-mutatie (zonder invloed op de veronderstelde cognate helicase) op het hele organismeniveau en tijdens de ontwikkeling10,12. Bovendien hebben we recombinante Drosophila WRN-exonuclease (DmWRNexo) gekloond, geëxpresseerd en gezuiverd, wat volledige biochemische analyse van zijn enzymeigenschappen mogelijk maakt13,14.
Nuclease-analyse in vitro is traditioneel uitgevoerd met behulp van radioactief gelabelde oligonucleotiden, waarbij de afbraak wordt beoordeeld door laddering van producten op acrylamide-gels te zoeken4,8,15. Hoewel gevoelig, zijn dergelijke tests niet kwantitatief reproduceerbaar van dag tot dag vanwege radioactief verval van de gelabelde substraten. Bovendien stellen de behandeling en verwijdering van radioactieve reagentia significante milieu- en gezondheidskwesties; het verkrijgen van radiolabels wordt ook steeds problematischer. Een recente alternatieve methode beoordeelt de hoeveelheid van het uiteindelijke afbraakproduct door massaspectrometrie16. Echter, het is tijdrovend (enkele dagen), vereist gespecialiseerde apparatuur, en de uitlezing is de hoeveelheid eindproduct (enkel nucleotide) zodat het niet geschikt is voor gevoelige metingen van aspecten zoals enzymprocessiviteit of voor het bepalen of sommige nucleotiden, sequenties of modificaties leiden tot nucleasepauze of halt. Om deze problemen te overwinnen, hebben we de traditionele gel-gebaseerde tests aangepast voor gebruik met fluorescerende oligonucleotide-substraten, waardoor stabiel gelabelde substraten worden gegenereerd die reproducibel kunnen worden gebruikt over lange tijdsperioden en dus directe vergelijking van nuclease-activiteiten onder verschillende omstandigheden mogelijk maken.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>Aangepaste oligonucleotiden</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Het is noodzakelijk om deze met hoge zuiverheid te verkrijgen bijv. met PAGE-zuivering.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresceïne-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'</td></tr><tr><td></td><td></td><td>bubbel</td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'</td></tr><tr><td>40% 19:1 Acrylamide-oplossing</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>VOORSICHT: krachtige neurotoxine, dus handschoenen moeten altijd worden gedragen</td></tr><tr><td>His-Trap kolommen (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Alle andere reagentia</td><td>elke gerenommeerde leverancier</td><td></td><td>Molecuulbiologie kwaliteit is noodzakelijk (DNase-vrij); microfugebuisjes moeten eveneens DNase- en RNase-vrij zijn</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Hoefer SE400 gel apparaat</td><td>Hoefer</td><td>SE400-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>FLA-3000 (fosfor en fluorescentie imager)</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Reader V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een fluorescentie-gebaseerde exonuclease assay te karakteriseren dmwrnexo, ortholoog van human progeroid wrn exonuclease, en de toepassing ervan op andere nucleasen

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN-exonuclease is betrokken bij het oplossen van DNA-schade die optreedt tijdens de DNA-replicatie of na blootstelling aan endogene of exogene genotoxinen. Het speelt waarschijnlijk een rol bij het voorkomen van de accumulatie van recombinogene tussenproducten die anders zouden accumuleren bij tijdelijk stilstaande replicatievorken, in overeenstemming met een hyper-recombinant fenotype van cellen die WRN missen. Bij mensen bestaat het exonuclease domein uit een N-terminaal deel van een veel groter eiwit dat ook helicase-activiteit bezit, samen met extra plaatsen die belangrijk zijn voor DNA- en eiwitinteractie. In tegenstelling tot Drosophila, wordt de exonuclease-activiteit van WRN (DmWRNexo) gecodeerd door een afzonderlijke genetische locus van de veronderstelde helicase, waardoor biochemische (en genetische) dissectie van de rol van de exonuclease-activiteit in mechanismen van genoomstabiliteit mogelijk is. Hier demonstreren we een fluorescente methode om WRN-exonuclease-activiteit te bepalen met behulp van gezuiverde recombinante DmWRNexo en end-gelabelde fluorescente oligonucleotiden. Dit systeem biedt meer reproduceerbaarheid dan radioactieve analyses omdat de substraat-oligonucleotiden maandenlang stabiel blijven, en biedt een veiligere en relatief snelle methode voor gedetailleerde analyse van nuclease-activiteit, waardoor bepaling van nuclease-polariteit, processiviteit en substraatvoorkeuren mogelijk is.

Het uitvoeren van een in vitro analyse van de exonuclease-activiteit vereist een aantal voorbereidende stappen naast de feitelijke analyse. Een overzicht van de procedures wordt getoond in Figuur 1. 
Vóór het uitvoeren van fluorescentie-gebaseerde exonuclease-assays is het essentieel om de detectie van het fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-substraat na scheiding op urea-acrylamidegels te optimaliseren met behulp van een geschikt fluorescentie-beeldvormingssystee...

Exonucleasen spelen een cruciale rol bij het waarborgen van de stabiliteit van het genoom. Verlies van de WRN-exonucleasefunctie resulteert in voortijdige veroudering. Het bestuderen van substraten en andere vereisten van de nuclease in vitro kan helpen bij het verduidelijken van zijn rol in vivo. Hier demonstreren we een snelle en reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde assay om zijn nuclease-activiteit te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Dit experiment maakt gebruik van een robuuste, reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde assay om exonuclease-activiteit te bepalen. Incubeer het gezuiverde enzym met het fluorescerende DNA-substraat om het enzym het DNA sequentieel te laten degraderen. Scheid vervolgens het DNA op een acrylamide-ureagele om de degradatieproducten op basis van grootte te scheiden.Gebruik vervolgens fluorescentie-imaging om de mate van exonuclease-activiteit te identificeren en te kwantificeren. Geanalyseerde resultaten kunnen de voorkeurcondities voor substraatreacties, alsook de processieve en totale activiteit van het enzym bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken op basis van radioactiviteit is dat de DNA-substraten langdurig stabiel blijven, wat zorgt voor een uitstekende reproduceerbaarheid, lagere kosten en een verhoogde veiligheid.Pas eerst het bacteriële lysaat aan naar 20 millimolar ole, met gebruik van een passend volume van een twee molar emit ole-stockoplossing. Pas vervolgens het volume aan naar ten minste één milliliter met behulp van 20 millimolar ole-was, A een milliliter hist trap-kolom met 10 milliliters milli Q-water. Equilibreer de kolom vervolgens met 10 milliliters 20 millimolar ole.Laad vervolgens het lysaat op de kolom; terwijl het lysaat op de kolom wordt geladen, kan er aanzienlijke tegendruk ontstaan. Dit is volkomen normaal. Pas niet te veel kracht toe op de spuit en handhaaf een constante, gelijkmatige druk.Het is gebruikelijk dat er een lichte kleurverandering optreedt wanneer het lysaat de kolom binnengaat. Verzamel de flow-through in een steriele biju-fles met een capaciteit van 7 mL en bewaar deze op ijs. Was de kolom vervolgens met 10 mL 20 mM imidazole.Breng nu vijf milliliter 40 millimolaire iole door de kolom. Houd de zuiger van de spuit nauwgezet in de gaten om de fracties van één milliliter te meten die in elk van de microcentrifugebuisjes worden opgevangen. Doe vervolgens op dezelfde opeenvolgende wijze vijf milliliter van elke iole-concentratie door de kolom en vang elke keer vijf fracties van één milliliter op.Analyseer de fracties via dot blotting en probing met een HRP-geconjugeerd anti-hiss antilichaam om de piekfracties te identificeren. Bewaar alle reagentia bij vier graden Celsius; verdeel de mastermix in steriele, DNA-vrije Microfuge-buisjes van 0,5 milliliter. Voeg ook een controle zonder enzym toe om het initiële substraat te visualiseren.Stel nu een warmteblok in op de juiste temperatuur voor de enzymactiviteit. Bereid een IDE voor met stopoplossing en bewaar deze bij kamertemperatuur. Richt de werkruimte rond het warmteblok in, inclusief de laatste reagentia die aan de reactie moeten worden toegevoegd.Zorg voor een pipet van 1 tot 10 µL met bijbehorende tips, een timer, een cryo-rek of een ijsbak en stopoplossing. Start de timer bij het toevoegen van het enzym aan de eerste buis en plaats de buis in het warmteblok. Voeg het enzym aan de overige buizen toe met intervallen van 15 seconden en plaats de buizen in het warmteblok zodra de timer de juiste tijd aangeeft.Voeg 10 µL stopoplossing toe aan het eerste monster en meng door te pipetteren. Plaats onmiddellijk op ijs. Stop de reacties voortdurend op de juiste tijdsintervallen en in dezelfde volgorde als waarin ze zijn klaargezet, zodat elke reactie exact dezelfde incubatietijd heeft gehad. Laad de helft of het geheel van elk monster op een acrylamidegel. Laad in één of meer banen een 1x stopoplossing die kleurstof bevat om vast te stellen hoe de gel loopt.Verwijder na de elektroforese de spacers en één gelplaat. Spoel de gelplaat voorzichtig af en veeg deze grondig schoon om sporen van neergeslagen ureum te verwijderen. Plaats de plaat met de gel naar beneden op het glazen gedeelte van de gelhouder en plaats deze indien nodig in de imager.Noteer de coördinaten van de gel op het glas. Open de betreffende software en scan het genoteerde gebied van het scanveld volgens de in het tekstprotocol beschreven condities. Snijd de afbeelding bij en comprimeer de gegevens.Sla de gegevens indien nodig op en exporteer deze vervolgens als bestand voor analyse. Voor het uitvoeren van in vitro analyse van de exonucleasedeactiviteit zijn verschillende voorbereidende stappen vereist. Naast de feitelijke analyse voor deze op fluorescentie gebaseerde exonuclease-assays is het essentieel om de detectie van het fluorescentie-beeldvormingssysteem te optimaliseren.Een oligonucleotidesubstraat dat is gelabeld met fluoresceïne vereist bijvoorbeeld een filter dat excitatie bij 470 nanometer en emissie bij 520 nanometer toelaat. Door dit filter te gebruiken is het mogelijk om de detectie van lage concentraties substraat of product te verbeteren door zowel de gevoeligheid als de resolutie van de imager aan te passen. Let op, er is enige tolerantie wat betreft de bandbreedte van het filter.Aangezien een suboptimale filterkeuze nog steeds gedeeltelijke detectie van het substraat mogelijk maakt, zij het met een veel lagere gevoeligheid, kan een passende combinatie van gelabelde oligonucleotideconcentratie en imager-instellingen leiden tot een robuuste detectie van het substraat. Dit is belangrijk omdat de degradatieproducten na incubatie met een actieve exonuclease in lagere hoeveelheden in elke band aanwezig zullen zijn, aangezien het substraat sequentieel is gefragmenteerd.Een succesvolle exonuclease-assay zal leiden tot sequentiële degradatie van het substraat richting het uiteinde. Dit resulteert in een kenmerkend ladderachtig patroon van DNA op de gel dat representatief is voor exonuclease-degradatie. Zodra de assay is geoptimaliseerd voor detectie, kan deze worden gebruikt om differentiële activiteiten zowel kwalitatief als kwantitatief aan te tonen.Bijvoorbeeld kan de aanwezigheid of afwezigheid van activiteit worden bepaald voor nuclease-mutanten in vergelijking met het wildtype-eiwit. Ook kunnen verschillende substraten worden getest op hun vermogen om door het nuclease te worden afgebroken. Onderzoek loopt.Deze in vitro-assay kan worden gebruikt om de substraatspecificiteit en het proces van een nuclease van belang te testen.

a-fluorescence-based-exonuclease-assay-to-characterize-dmwrnexo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische studies in gist kan worden gebruikt om de moleculaire en cellulaire functies van de menselijke genen te onderzoeken in de cellulaire DNA metabolisme. Methoden beschreven voor de genetische karakterisering van het...

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Fluorescentie resonantie energie overdracht gebaseerde real-time opvolgen systemen van DNA strand uitwisseling reactie gemedieerd door Rad51 werden ontwikkeld. Met behulp van de protocollen die hier gepresenteerd, zijn wij kundig voor speurder van de vorming van reactie tussenproducten en hun omzetting in producten, terwijl ook het analyseren van de enzymatische kinetiek van de reactie.

Real-time opvolgen van de DNA Strand Exchange reactie gemedieerd door Rad51

Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Deze studie presenteert een eenvoudige, gebruiksvriendelijke ratiometrische FRET-test voor de detectie en kwantitatieve beoordeling van DNase-activiteit, en demonstreert de toepassing ervan bij de analyse van een zwakke nuclease.

Beoordeling van DNase-activiteit door ratiometrische fluorescentieresonantie energieoverdracht

Dit protocol beschrijft een biochemische test met gelverschuiving voor het meten van de activiteit van FEN1 (Flap Endonuclease 1) en de ontwikkeling van remmers.

Op fluorescentie gebaseerde detectie van FEN1-nuclease-activiteit en screening van kleinmoleculaire remmers

Leer een fluorescerende exonuclease-assay om enzymactiviteit te meten met fluorescerende DNA-substraten en gel-elektroforese. Deze methode biedt reproduceerbare resultaten voor het bestuderen van genoomstabiliteit.

Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen (Video) | JoVE Journal

Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen

Meer video's verkennen