Name: Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer multiplex fluorescentie-microarray-analyse van speekseleiwitten met behulp van polymermicrosferen en glasvezelbundels. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (subsidie ​​08UDE017788-05). EBP erkent ook steun van de Spaanse Stichting voor Wetenschap en Technologie (FECYT). De auteurs danken Shonda T. Gaylord en Pratyusha Mogalisetti voor kritische lezing van het manuscript.

<img alt="Figuur 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figuur 1. . Workflow voor toepassing vezeloptische microsfeer antilichaam array speeksel profilering (1) Microsferen worden intern gecodeerd met twee fluorescerende kleurstoffen, (2) de gecodeerde microbolletjes uitwendig gemodificeerd met eiwit-specifieke monoklonale antilichamen, (3) de gemultiplexte microsferen worden gemengd, en (4) willekeurig gestort in microputjes geëtst op het proximale uiteinde van een vezel-optische bundel, (5) speekseleiwitten weergegeven door microbolletjes door sandwich immunoassay en (6) gekwantificeerd middels fluorescentiemicroscopie. 1. Microsferen Encoding <ol><li> Weeg natrium europium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydraat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) in een amberkleurig glazen flesje en stelt een 200 mM voorraadoplossing in tetrahydrofuran (THF). Meng voorzichtig door pipetteren; visueel controlerende kleurstof volledig is opgelost. </li><li> Weeg coumarine 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) in een amberkleurige glazen flacon en bereiden een 12 mM voorraad oplossing in THF. Meng voorzichtig door pipetteren; visueel controleren of de kleurstof volledig is opgelost. </li><li> Bereid 700 ui werkoplossing voor elke microsfeer met de voorraadoplossingen en THF eindconcentratie in tabel 1 bereikt. </li><li> Zorg microsferen (10% w / v) goed gesuspendeerd door vortexen, en breng 60 pl suspensie tot een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 600 ul PBS om microsferensuspensie en meng door pipetteren 20x. Centrifugeer de buis bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant. Herhaal dit proces nog 2x om de microsferen te wassen. </li><li> Was de pellet van microsferen 3x THF met behulp van een soortgelijke werkwijze als stap 1.5. </li><li> Centrifugeer de microbolletjes / THF suspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 600 uiwerkoplossing vermeld in tabel 1. het mengsel in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Dicht de microcentrifugebuis met Parafilm en plaats deze op een shaker. Schudden bij 3.000 tpm en incubeer gedurende 24 uur, bescherming tegen licht door het bedekken van de setup met een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Centrifugeer de microsferensuspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een ​​pellet te vormen. </li><li> Verwijder de kleurstof bovenstaande oplossing, was de microsferen 6x met 600 ul methanol en daarna met 600 ul PBS die 0,01% Tween-20 andere 6x, zoals beschreven in stap 1.5. </li><li> Bewaar de gecodeerde microbolletjes in 600 ul PBS die 0,01% Tween-20 bij 4 ° C tot gebruik, te beschermen tegen licht. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Type Microsphere naam: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (MM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Concentraties van Eu-TTA en C30 werkende oplossingen. 2. Voorbereiding van de eiwit-capture microsferen <ol><li> Bereid MES buffer [2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, 0,01% SDS, pH 5,7] en PBS / SDS-buffer (0,01 M natriumfosfaat, NaCl 0,154 M, 0,01% SDS, pH 7.4) vooraf bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 200 ul gecodeerd microsferensuspensie (met ~ 2 mg microsferen) in een Safe-Lock 1,5 ml microcentrifugebuis. Het is belangrijk om dit soort microcentrifugebuis om morsen tijdens de incubatie in stap 2.6 voorkomen. </li> &lt;li&gt; Was de microsferen met 600 ul MES buffer 3x zoals beschreven in stap 1.5. Voeg 700 ul MES aan de microsferen pellet en meng goed door pipetteren. </li><li> Bereid 0.105 g / ml 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC, MW = 191,7 g / mol) en 0,163 g / ml sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) oplossingen MES buffer in afzonderlijke buisjes. </li><li> Voeg 150 ul vers EDC oplossing bereid druppel voor druppel in de microsferensuspensie. De EDC hydrolyseert snel, dus is het essentieel om verse oplossing om de immobilisatie efficiëntie. Onmiddellijk na de toevoeging van EDC, voeg 150 ul sulfo-NHS oplossing voor de microbolletjes, goed mengen door pipetteren en controleer de suspensie homogeen is. </li><li> De dop op de tube, verzegelen met Parafilm, en plaats deze op een shaker. Schudden bij 1500 rpm gedurende 4 uur, bescherming tegen licht met behulp van een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Centrifugeer de microbolletjes Suspension bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een ​​pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de microsferen met 500 ul PBS / SDS buffer 3x zoals beschreven in stap 1.5. </li><li> Voeg 200 ul PBS / SDS buffer om de pellet, meng de microsferen goed en breng de oplossing tot 300 ul PBS / SDS buffer die 60 ug invangantilichamen. Het is belangrijk om eerst de pellet van microsferen te schorten en voeg de microsferensuspensie in de antilichaamoplossing. </li><li> Incubeer de antilichaam-microsferen mengsel door schudden bij 1500 rpm gedurende 4 uur op een shaker, beschermen tegen licht met behulp van een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Centrifugeer de microsferensuspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een ​​pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de microsferen met 500 pi StartingBlock (TBS) blokkeringsbuffer 3x, zoals beschreven in stap 1.5. </li><li> Meng microsferen met 1 ml TBS blokkerende buffer en incubeer microsferen bij 1.500 rpm gedurende 1 uur op een shaker, beschermen tegen licht met behulp van een doos inhamrood met aluminiumfolie. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij microsfeer 7000 rpm gedurende 3 minuten om een ​​pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de pellet 3x met 500 ul TBS blokkerende buffer, zoals beschreven in stap 1.5. </li><li> Centrifugeer de microsfeer oplossing bij 7000 rpm gedurende 3 minuten om een ​​pellet te vormen en verwijder het supernatant. Voeg 500 ul TBS blokkerende buffer en meng door pipetteren. </li><li> Sla de gewijzigde microbolletje suspensie bij 4 ° C tot gebruik, te beschermen tegen licht. </li><li> Herhaal deze procedure om andere vormen van microsferen met overeenkomstige antilichamen. </li></ol> 3. Glasvezel-microarray Vergadering <ol><li> Meng 50 pi van elke soort eiwit-vangst microsferen in een autoclaaf nieuwe microcentrifugebuis. Centrifugeer de voorraad microsferen bundelen bij 7.000 rpm gedurende 3 minuten, en verwijder het supernatant zodat het resterende volume is ongeveer 100 pl. </li><li> Hand-cut vezeloptische bundels tot ongeveer 5 cm in lengte ensequentieel poetsen beide uiteinden op een polijstmachine met behulp 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 en 0,05 micrometer-grote diamant lappen films. Ultrasone trillingen de gepolijste bundel in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten om alle deeltjes te verwijderen. </li><li> Zet een klein magnetisch roerstaafje in een 0,5 ml microcentrifugebuis, voeg 400 ul van eiwitvrij PBS-buffer en roer op een magnetisch roeren plaat gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Etch ene uiteinde van de gepolijste vezelbundel in een 0,025 N HCl oplossing voor 150 sec 10,16. Onmiddellijk onderdompelen en ultrasone trillingen het geëtst einde in gedeïoniseerd water gedurende 1 minuut. Droog de vezelbundels met perslucht. </li><li> Monteer de vezel bundel op een vezelhouder en blokkeren de geëtst einde in de bubble-free, Proteïnevrije PBS-buffer gedurende 1 uur. </li><li> Borg 1 ui aliquot van de opgeslagen microsferensuspensie op de geëtste einde van de vezeloptische bundel. Bescherm de setup van licht met een doos met aluminiumfolie, en wacht 15 minuten. Het volume van de suspensie zalverlagen door verdamping en de microbolletjes ver in de geëtste microputjes. Herhaal deze belasting stap nog een keer. </li><li> Gebruik een wattenstaafje verzadigd met monster oplossing voor microsferen die niet gevangen zitten in de microwells verwijderen. Het eiwit microarray is nu klaar voor gebruik. Ga onmiddellijk naar stap 4.1 voor speeksel analyse. </li></ol> 4. Speekselsteekproef analyse met behulp van microsferen microarray <ol><li> Voeg 200 ul monster-oplossing (100 ul speeksel supernatant verdund met een gelijk volume van StartingBlock T20 (PBS) blokkeringsbuffer. De collectie protocol voor speeksel supernatant reeds eerder is gepubliceerd 10). in een 0,5 ml microcentrifugebuis geautoclaveerd. Dompel het eiwit microarray geladen op de vezel in de oplossing en incubeer op de schudinrichting bij 600 rpm gedurende 2 uur, bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Bereid 20 ml wasbuffer door toevoeging van 200 pl 10% BSA-oplossing en 200 pl 10% Tween-20 in 19,6 ml PBS, mix goed door zachtjes te schudden. </li><li> Dompel de proteïne microarray in een nieuwe autoclaaf microcentrifugebuis met 200 ul wasbuffer en schudden bij 600 rpm gedurende 2 minuten. Herhaal dit 3x wassen. </li><li> Incubeer de microarray in 100 pl oplossing van een detectie-antilichaam cocktail bevattende 5 pg / ml anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β gebiotinyleerde detectie antilichamen StartingBlock T20 (PBS) blokkeringsbuffer gedurende 30 min bij kamertemperatuur op de schudinrichting bij 600 rpm, bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Was de microarray 3x met wasbuffer zoals beschreven in stap 4.3. </li><li> Incubeer de microarray in 200 gl 20 ug / ml streptavidine R-fycoerythrine-conjugaat (SAPE) oplossing in PBS bij 600 rpm op de schudinrichting gedurende 10 minuten bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie. </li><li> Was de microarray 5x met wasbuffer zoals beschreven in stap 4.3. </li><li> Reinig het distale uiteinde van de vezel (dwz het einde weguit de microsferen) bundelen met een wattenstaafje verzadigd met absolute ethanol. </li><li> Droog beide uiteinden van de vezel met perslucht. Monteer de vezel op epifluorescerende microscoop en beeld door het distale uiteinde van de vezel. </li><li> Acquire microbolletjes beelden die overeenkomen met Eu-TTA, C30, en SAPE fluorescentie-emissie-intensiteiten. Optische filters instellen en belichtingstijden voor fluorescentie beeldvorming van Eu-TTA, C30, en SAPE zijn weergegeven in tabel 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Kanaal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Opwekker </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Beamsplitter </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emitter </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Belichtingstijd </td><td> 1 sec</td><td> 0.3 sec </td><td> 1 sec </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Parameters voor de drie fluorescerende beelden van de microarray.

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarray%22">Protein Microarray</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).</li>
<li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1%2FTh2+cytokines+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li>
<li>de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li>
<li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li>
<li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+drool+for%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li>
<li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies%2C+proteomics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li>
<li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics%3A+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dent.+Educ%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li>
<li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li>
<li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+nanowell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarrays%22">Protein Microarrays</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).</li>
<li>Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Onderzoekers moeten extra aandacht besteden aan de volgende stappen: voor betere nauwkeurigheid decoderen, is het noodzakelijk te controleren of de microsferen werden homogeen gesuspendeerd in alle incubatie en wassen stappen tijdens de microsferen coderingsprocedure. Bovendien moeten de gecodeerde microbolletjes worden beschermd tegen licht gedurende het gehele experiment. Na juiste codering en opslagprocedures, vonden we dat algehele nauwkeurigheid decoderen was boven 99%. De gecodeerde microsferen moet worden bewaard...

Sinds de eerste microarray gemeld door Mark Schena en collega&#39;s in het midden van de jaren 1990, heeft deze krachtige tool is gebruikt op vele terreinen van biologisch onderzoek 1. Antilichaam microarrays kan tegelijkertijd detecteren van meerdere eiwitten in diagnostische fluïda, zoals bloed, hebben belangrijke toepassingen in de klinische diagnostiek en biomarker screening 2-10. Speeksel, die veel van dezelfde analyten zoals bloed, wordt beschouwd als een beter alternatief voor bloed doordat speekselinzameling veilig, niet-invasieve, en kan door minimaal geschoold medisch personeel 11-13 worden uitgevoerd. Momenteel wordt gemultiplexte eiwitanalyse met speeksel door verscheidene belangrijke factoren, zoals de lage concentratie van doelanalyt 14 en breed concentratiegebied van verschillende biomarkers 15. . Hierin tonen we de analyse van zes eiwit: humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interferon-gamma geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukine-8 (IL-8), epidermale groeifactor (EGF), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) en interleukine-1 bèta (IL-1β) . De prestaties van de werkwijze werd aanvankelijk gecontroleerd met standaardoplossingen vormen analyt recombinante eiwitten en blokkeerbuffer. Real speeksel monsters verzameld van patiënten met verschillende chronische aandoeningen van de luchtwegen en gezonde controles werden ook getest met bevredigende prestaties. Het protocol moet van toepassing zijn op andere eiwit analyten en andere-microbolletjes gebaseerde testen zijn. Dit platform biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van analytische chemie zoals maakt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare gelijktijdige analyse van lage concentraties van verscheidene eiwitten met een breed dynamisch bereik, minimale niet-specifieke interacties, verminderd monster en lage kosten in vergelijking met een analoog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Eu-TTA kleurstof</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bernstein glazen vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>Coumarine 30 kleurstof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Microsferen</td><td>Bangslabs</td><td>PC05N/6698</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifugebuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES gebufferde zoutoplossing</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaOH-oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock microcentrifugebuis</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>Human IP-10 capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>Human MMP-9 capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB936</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-1&beta; capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 isotype control antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock (TBS) buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>HCl standaardoplossing 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifugebuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnevrij (PBS) buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human VEGF 165</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IP-10</td><td>R&amp;D Systems</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-8</td><td>R&amp;D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human MMP-9</td><td>R&amp;D Systems</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&beta;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA in PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren VEGF detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren IP-10 detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren IL-8 detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren EGF detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren MMP-9 detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF911</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren IL-1&beta; detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, R-fycoerytrine</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplexed fluorescent microarray voor menselijk speeksel bij eiwit analyse met behulp van polymer microsferen en glasvezel-bundles

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Hierin beschrijven we een protocol voor het gelijktijdig meten van zes eiwitten in het speeksel met een vezeloptische-microsfeer gebaseerde antilichaam array. De immuno-array-technologie die combineert de voordelen van op microsfeer gebaseerde suspensie matrix productie met gebruik van fluorescentiemicroscopie. Zoals beschreven in de video-protocol, werden commercieel verkrijgbaar 4,5 urn polymeermicrosferen gecodeerd in zeven verschillende soorten, onderscheiden door de concentratie van twee fluorescente kleurstoffen fysiek opgesloten in de microsferen. De gecodeerde microsferen die oppervlak carboxylgroepen werden gewijzigd met monoklonale antilichamen capture via EDC / NHS koppeling chemie. Om het eiwit microarray assembleren, de verschillende soorten van gecodeerde en gefunctionaliseerde microbolletjes werden gemengd en willekeurig gestort in 4,5 urn microputjes, die chemisch werden geëtst op het proximale einde van een vezeloptische bundel. De vezeloptische bundel werd gebruikt als zowel een drager en voor het afbeelden van de microspheres. Afgewerkt, werd de microarray gebruikt om eiwitten te vangen in het speeksel supernatant verzameld uit de kliniek. De detectie is gebaseerd op een sandwich immunoassay met een mengsel van gebiotinyleerde detectie antilichamen voor verschillende analyten met een streptavidine-geconjugeerde fluorescente probe, R-fycoerythrine. De microarray werd afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in drie verschillende kanalen, twee voor microsfeer registratie en een voor de test signalen. De fluorescentie microfoto&#39;s werden vervolgens gedecodeerd en met een zelfgemaakte algoritme in MATLAB geanalyseerd.

Fluorescentie beelden van drie kanalen toont een klein gedeelte van de vezel-optische bundel zijn weergegeven in figuren 2A-C. Deze beelden werden geanalyseerd met een algoritme geschreven in MATLAB (zoals in meer detail beschreven in het hoofdstuk discussie). De analyse maakt gebruik van beide informatie van de Eu-TTA afbeelding codering (figuur 2A) en het C30-codering afbeelding (Figuur 2B) aan de microsferen decoderen, en de fluorescentie-intensiteiten van verschille...

We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitten in menselijke speekselmonsters te analyseren met behulp van fluorescerende arrays op basis van microsferen. Codeer eerst de microsferen met verschillende hoeveelheden van twee fluorescerende kleurstoffen. Koppel de capturingsantilichamen voor verschillende eiwitten aan de gecodeerde microsferen.Assembleer vervolgens de gemultiplexte proteïnemicroarray op de glasvezelbundel met behulp van de sandwich-immunoassays op de geassembleerde microarrays voor de analyse van meerdere proteïnen in de testspeekselmonsters. Uiteindelijk kan analyse via fluorescentiemicroscopie de signaalresponsen van verschillende proteïnen in de speekselmonsters meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ELISA is dat het de simultane analyse van meerdere proteïnen in complexe biofluïda mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de analyse van menselijk speeksel, kan deze ook worden toegepast op andere biologische vloeistoffen zoals serum, urine en sputum. Weeg de opium TTA af in een bruin glazen flacon en bereid een 200 millimolaire stamoplossing in tetrahydrofuran. Meng voorzichtig door

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

This video demonstrates a bead-based multiplex immunoassay technique to simultaneously detect antibodies for multiple environmental pathogens in human saliva. Fluorescent beads were coupled to antigens from different pathogens, which were captured using antibodies in the human saliva sample. Upon labeling the antibodies using a fluorescent reporter, the beads were analyzed using flow cytometry to assess the presence of different pathogen-specific antibodies in the saliva.

A Bead-Based Multiplex Immunoassay to Identify Pathogen-Specific Antibodies in Saliva

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

In het huidige klimaat van schaarse middelen, ontstaan er nieuwe technologieën die het onderzoekers mogelijk maken om studies goedkoper, sneller en met meer precisie uit te voeren. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een kralen-gebaseerde speekselantilichaam multiplex immunoassay om de blootstelling van mensen aan meerdere omgevingspathogenen gelijktijdig te meten.

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Leer multiplex fluorescentie-microarray-analyse van speekseleiwitten met behulp van polymermicrosferen en glasvezelbundels. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers mogelijk.

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles (Video) | JoVE Journal

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Meer video's verkennen