Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles
October 10th, 2013
We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.
Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitten in menselijke speekselmonsters te analyseren met behulp van op microsferen gebaseerde fluorescentiearrays. Codeer eerst de microsferen met verschillende hoeveelheden van twee fluorescerende kleurstoffen. Koppel de opvangantilichamen voor verschillende eiwitten aan de gecodeerde microsferen.
Vervolgens assembleer je de multiplexed eiwitmicroarray op het glasvezelbundel met behulp van de gesandwichde immunoassays op de geassembleerde microarrays om meerdere eiwitten in de geteste speekselmonsters te meten. Uiteindelijk kan analyse door middel van fluorescentiemicroscopie de signaalresponsen van verschillende eiwitten in de speekselmonsters meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Eliza's is dat het de gelijktijdige analyse van meerdere eiwitten in complexe biovloeistoffen mogelijk maakt.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de analyse van menselijk speeksel, kan het ook worden toegepast op andere bioflus zoals serum, urine en sputum. Weeg het opium TTA in een amberkleurig glazen flesje en bereid een 200 millimolair stockoplossing in tetra hydro Furin. Meng voorzichtig door middel van pipetteren en controleer visueel of de kleurstof volledig is opgelost.
Bereid op dezelfde manier een 12 millimolair stockoplossing van Coumarine 30 voor, meng voorzichtig door middel van pipetteren. Visueel. Controleer of de D volledig is opgelost, vortex naar microsfeer suspensie, en breng vervolgens 60 microliter over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Om de microsferen te wassen, voeg 600 microliter PBS toe, meng door middel van pipetteren 20 keer en centrifugeer gedurende drie minuten bij 10.000 RPM.
Na drie wasbeurten met tetra hydro furin oplossing, verwijder het supernatant, resuspendeer de microsfeer in 600 microliter werkoplossing, en breng het mengsel over naar een nieuw 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Sluit de microcentrifugebuis met parafilm en plaats het op een schudder. Bescherm het tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie.
Voeg 200 microliter van de gecodeerde microsfeersuspensie toe aan een veilig slot, 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Voeg druppelsgewijs 150 microliter toe, een vers bereide EDC oplossing. Voeg onmiddellijk 150 microliter van de sulfa NHS oplossing toe. Meng goed door middel van pipetteren en controleer of de suspensie homogeen is.
Dek de buis af, sluit hem af met paraform en plaats hem op een schudder. Bescherm het tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie. Na drie wasbeurten met P-B-S-S-D-S buffer reus, schors de pellet in 200 microliter van P-B-S-S-D-S buffer mix s.
Breng vervolgens de oplossing over naar 300 microliter van P-B-S-S-D-S buffer bevattend 60 microgram opvangantilichamen. Meng 50 microliter van elk type eiwit opvangmicrosfeer in een nieuwe autoclaaf microcentrifugebuis. Centrifugeer de stock microsfeer pool bij 7.000 RPM gedurende drie minuten en verwijder alles behalve 100 microliter van het supernatant.
Snij nu handmatig glasvezelbundels tot ongeveer vijf centimeter lengte, polijst beide uiteinden sequentieel met behulp van diamantschuurfolies. Soniceer vervolgens het gepolijste bundeltje in gedeïoniseerd water gedurende twee minuten. Om eventuele deeltjes te verwijderen, plaats een kleine magnetische roerstaaf in een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje.
Voeg 400 microliter eiwitvrij PBS buffer toe en roer gedurende 30 minuten op een magnetische roerplaat. Om luchtbellen te verwijderen, tsj het ene uiteinde van het gepolijste glasvezelbundeltje in een 0,025 normaal waterstofchloride oplossing gedurende 150 seconden. Dompel onmiddellijk en soniceer het tsjde N in gedeïoniseerd water gedurende een minuut.
Droog vervolgens de glasvezelbundels met perslucht, monteer het glasvezelbundeltje op een glasvezelhouder en blokkeer het tsjde uiteinde in de luchtbellenvrije, eiwitvrije PBS buffer gedurende een uur. Deponeer een microliter ALI quad van de opgeslagen microsfeersuspensie op het tsjde uiteinde van het glasvezelbundeltje. Bescherm de opstelling tegen licht met een doos omwikkeld met aluminiumfolie. Na 15 minuten zal het volume van de suspensie afnemen door verdamping en de microsferen in de tsjde microputjes forceren.
Gebruik een doekje gedrenkt in monstersoplossing om microsferen te verwijderen die niet zijn opgesloten in de microputjes. Om de eiwitmicroarray klaar te maken voor gebruik, voeg 200 microliter monstersoplossing toe aan een 0,5 milliliter autoclaaf microcentrifugebuisje. Dompel het eiwitmicroarray, geladen op het glasvezel, in de oplossing en plaats het op een schudder.
Bescherm tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie. Dompel vervolgens het eiwitmicroarray in een nieuw autoclaaf microcentrifugebuisje met 200 microliter wasbuffer en schud gedurende twee minuten bij 600 RPM. Incubeer nu het microarray in een 100 microliter oplossing van een detectieantilichaamcocktail bevattende biotinyleerde detectieantilichamen en A PBS blokkerende buffer gedurende 30 minuten.
Reiniging van het distale uiteinde van het glasvezelbundeltje met een doekje gedrenkt in absolute ethanol bij kamertemperatuur in het donker. Droog vervolgens beide uiteinden van het glasvezel met perslucht, monteer het glasvezel op een epifluorescentiemicroscoop en neem een beeld op door het distale uiteinde van het glasvezel, verzamel de microsfeerbeelden corresponderend met opium TTAC 30 en SAP fluorescentie emissie intensiteiten. De coderingsbeelden van zeven microsfeertypen worden hier getoond.
Er worden twee intensiteitsniveaus waargenomen in de UTTA coderingsbeeld, die staan voor microsferen gecodeerd met verschillende hoeveelheden UTTA kleurstof. Vergelijkbare resultaten worden waargenomen in de C 30 coderingsbeeld. MATLAB beeldanalyse maakt berekening van de fluorescentie intensiteiten van verschillende microsferen in het signaalbeeld mogelijk. De decoderingsresultaten worden getoond in figuur 2D zeven.
Ver
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het profileren van speeksel-eiwitten met behulp van multiplexed microsphere-based antibody arrays. De methode maakt de simultane analyse van meerdere eiwitten in menselijke speekselmonsters mogelijk, waardoor de mogelijkheden van traditionele assays worden verbeterd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biotechnologie
- Proteomics
Achtergrond
- Speeksel bevat een verscheidenheid aan eiwitten die inzichten kunnen bieden in gezondheid en ziekte.
- Traditionele methoden zoals ELISA zijn beperkt tot het analyseren van één eiwit tegelijk.
- Multiplexed assays kunnen de efficiëntie en rijkdom van gegevens verbeteren.
- Fluorescente microsphere-technologie biedt een nieuwe aanpak voor eiwitdetectie.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het gelijktijdig analyseren van meerdere eiwitten in speeksel.
- Om de gevoeligheid en specificiteit van eiwitdetectie in complexe biovloeistoffen te verbeteren.
- Om een efficiënter alternatief te bieden voor bestaande single-analyt assays.
Gebruikte methoden
- Het coderen van microspheres met fluorescerende kleurstoffen.
- Covalente binding van capture-antilichamen aan de microspheres.
- Assembleren van multiplexed eiwitmicroarrays op glasvezelbundels.
- Gebruik van fluorescentie sandwich immunoassays om eiwitten in speekselmonsters te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- De methode detecteerde met succes meerdere eiwitten in speekselmonsters.
- Fluorescentiemicroscopie leverde duidelijke signaalresponsen op voor verschillende eiwitten.
- De techniek toonde voordelen ten opzichte van traditionele ELISA-methoden.
- Resultaten wijzen op mogelijke toepassingen in klinische diagnostiek.
Conclusies
- Deze multiplexed aanpak maakt een efficiënte analyse van speekseleiwitten mogelijk.
- De methode zou een beter begrip kunnen faciliteren van verschillende gezondheidstoestanden.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing van deze techniek in andere biovloeistoffen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
