Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitten in menselijke speekselmonsters te analyseren met behulp van op microsferen gebaseerde fluorescentiearrays. Codeer eerst de microsferen met verschillende hoeveelheden van twee fluorescerende kleurstoffen. Koppel de opvangantilichamen voor verschillende eiwitten aan de gecodeerde microsferen.

Vervolgens assembleer je de multiplexed eiwitmicroarray op het glasvezelbundel met behulp van de gesandwichde immunoassays op de geassembleerde microarrays om meerdere eiwitten in de geteste speekselmonsters te meten. Uiteindelijk kan analyse door middel van fluorescentiemicroscopie de signaalresponsen van verschillende eiwitten in de speekselmonsters meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Eliza's is dat het de gelijktijdige analyse van meerdere eiwitten in complexe biovloeistoffen mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de analyse van menselijk speeksel, kan het ook worden toegepast op andere bioflus zoals serum, urine en sputum. Weeg het opium TTA in een amberkleurig glazen flesje en bereid een 200 millimolair stockoplossing in tetra hydro Furin. Meng voorzichtig door middel van pipetteren en controleer visueel of de kleurstof volledig is opgelost.

Bereid op dezelfde manier een 12 millimolair stockoplossing van Coumarine 30 voor, meng voorzichtig door middel van pipetteren. Visueel. Controleer of de D volledig is opgelost, vortex naar microsfeer suspensie, en breng vervolgens 60 microliter over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Om de microsferen te wassen, voeg 600 microliter PBS toe, meng door middel van pipetteren 20 keer en centrifugeer gedurende drie minuten bij 10.000 RPM.

Na drie wasbeurten met tetra hydro furin oplossing, verwijder het supernatant, resuspendeer de microsfeer in 600 microliter werkoplossing, en breng het mengsel over naar een nieuw 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Sluit de microcentrifugebuis met parafilm en plaats het op een schudder. Bescherm het tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie.

Voeg 200 microliter van de gecodeerde microsfeersuspensie toe aan een veilig slot, 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Voeg druppelsgewijs 150 microliter toe, een vers bereide EDC oplossing. Voeg onmiddellijk 150 microliter van de sulfa NHS oplossing toe. Meng goed door middel van pipetteren en controleer of de suspensie homogeen is.

Dek de buis af, sluit hem af met paraform en plaats hem op een schudder. Bescherm het tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie. Na drie wasbeurten met P-B-S-S-D-S buffer reus, schors de pellet in 200 microliter van P-B-S-S-D-S buffer mix s.

Breng vervolgens de oplossing over naar 300 microliter van P-B-S-S-D-S buffer bevattend 60 microgram opvangantilichamen. Meng 50 microliter van elk type eiwit opvangmicrosfeer in een nieuwe autoclaaf microcentrifugebuis. Centrifugeer de stock microsfeer pool bij 7.000 RPM gedurende drie minuten en verwijder alles behalve 100 microliter van het supernatant.

Snij nu handmatig glasvezelbundels tot ongeveer vijf centimeter lengte, polijst beide uiteinden sequentieel met behulp van diamantschuurfolies. Soniceer vervolgens het gepolijste bundeltje in gedeïoniseerd water gedurende twee minuten. Om eventuele deeltjes te verwijderen, plaats een kleine magnetische roerstaaf in een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje.

Voeg 400 microliter eiwitvrij PBS buffer toe en roer gedurende 30 minuten op een magnetische roerplaat. Om luchtbellen te verwijderen, tsj het ene uiteinde van het gepolijste glasvezelbundeltje in een 0,025 normaal waterstofchloride oplossing gedurende 150 seconden. Dompel onmiddellijk en soniceer het tsjde N in gedeïoniseerd water gedurende een minuut.

Droog vervolgens de glasvezelbundels met perslucht, monteer het glasvezelbundeltje op een glasvezelhouder en blokkeer het tsjde uiteinde in de luchtbellenvrije, eiwitvrije PBS buffer gedurende een uur. Deponeer een microliter ALI quad van de opgeslagen microsfeersuspensie op het tsjde uiteinde van het glasvezelbundeltje. Bescherm de opstelling tegen licht met een doos omwikkeld met aluminiumfolie. Na 15 minuten zal het volume van de suspensie afnemen door verdamping en de microsferen in de tsjde microputjes forceren.

Gebruik een doekje gedrenkt in monstersoplossing om microsferen te verwijderen die niet zijn opgesloten in de microputjes. Om de eiwitmicroarray klaar te maken voor gebruik, voeg 200 microliter monstersoplossing toe aan een 0,5 milliliter autoclaaf microcentrifugebuisje. Dompel het eiwitmicroarray, geladen op het glasvezel, in de oplossing en plaats het op een schudder.

Bescherm tegen licht door het te bedekken met aluminiumfolie. Dompel vervolgens het eiwitmicroarray in een nieuw autoclaaf microcentrifugebuisje met 200 microliter wasbuffer en schud gedurende twee minuten bij 600 RPM. Incubeer nu het microarray in een 100 microliter oplossing van een detectieantilichaamcocktail bevattende biotinyleerde detectieantilichamen en A PBS blokkerende buffer gedurende 30 minuten.

Reiniging van het distale uiteinde van het glasvezelbundeltje met een doekje gedrenkt in absolute ethanol bij kamertemperatuur in het donker. Droog vervolgens beide uiteinden van het glasvezel met perslucht, monteer het glasvezel op een epifluorescentiemicroscoop en neem een beeld op door het distale uiteinde van het glasvezel, verzamel de microsfeerbeelden corresponderend met opium TTAC 30 en SAP fluorescentie emissie intensiteiten. De coderingsbeelden van zeven microsfeertypen worden hier getoond.

Er worden twee intensiteitsniveaus waargenomen in de UTTA coderingsbeeld, die staan voor microsferen gecodeerd met verschillende hoeveelheden UTTA kleurstof. Vergelijkbare resultaten worden waargenomen in de C 30 coderingsbeeld. MATLAB beeldanalyse maakt berekening van de fluorescentie intensiteiten van verschillende microsferen in het signaalbeeld mogelijk. De decoderingsresultaten worden getoond in figuur 2D zeven.

Ver