Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Deze procedure lokaliseert ruimtelijk meerdere endogene lipiden binnen een runderlens. Hierbij wordt gebruikgemaakt van de techniek van matrix-ondersteunde laserdesorptie-ionisatie massaspectrometrische imaging. Bereid eerst een dunne weefselcoupe van een runderlens voor, breng een multimatrix aan en verkrijg vervolgens een MALDI-massaspectrale dataset.

Verwerk de dataset tot een visuele weergave van de gedetecteerde lipiden op de doorsnede van het lensweefsel. Samen kunnen deze resultaten de locatie en relatieve abundantie van de lipiden binnen een runderlens bepalen en een visuele weergave van deze distributie produceren. Vergeleken met andere methoden, zoals lipidenextractie gevolgd door LCMS-analyse, maakt MALDI-massaspectrometrie-imaging de visualisatie van meerdere lipiden gelijktijdig mogelijk zonder dat de ruimtelijke lokalisatie verloren gaat. Haal de flash-frozen weefselmonsters uit de opslag bij -80 °C.

Verwijder het kapsel van het lensoppervlak om een volledige sectie van een lens van een rundskalf te fixeren. Plaats één of twee druppels water op de snijtafel van een cryostaat. Plaats de lens snel in het water voordat het stolt, zodra de cryostaat is geëquilibreerd naar de optimale temperatuur.

Snijd het weefsel equatoriaal in secties met een dikte van 20 micron. Gooi de eerste weefselsecties weg en gebruik alleen coupes die dicht bij of op het equatoriale vlak liggen voor de beeldvorming van het weefsel van de ooglens. Voeg 1,5 µL mierenzuur toe om het oppervlak van een ITO-gecoate glazen objectglas voor te bevochtigen.

Breng vervolgens de weefselcoupes zorgvuldig over naar het objectglas in de cryostaat. Lyofiliseer daarna de objectglazen gedurende 15 minuten voorafgaand aan het aanbrengen van de MALDI-matrix. Zet met een correctiepen drie markeringen op het niet-geleidende oppervlak van het ITO-gecoate objectglas.

Maak nu een optische afbeelding van het weefselcoupe met een flatbedscanner en sla deze op in een geschikt formaat, zoals TIFF of jpeg. Plak eerst de randen aan de voorzijde van de met ITO gecoate glazen objectglaasjes af met tape, zodat de matrix de randen van het glaasje niet bedekt. Bereid de matrix voor gebruik in een geschikt oplosmiddel.

Breng vervolgens de matrixoplossingen aan op de oppervlakken van de weefselcoupes. Bedek het objectglas door 20 cycli van matrixcoating toe te passen. Alternatief kan een pneumatisch ondersteunde airbrushspuit worden gebruikt om de matrices aan te brengen als een oplosmiddel incompatibel is met de elektronische matrixspuit.

Verdun voor de massakalibratie-oplossing de ES tuning mix standaardoplossing met een factor van 1 op 200 in 60% isopropanol. Voer de verdunde ES tuning mix-oplossing met een snelheid van twee microliters per minuut toe aan de dual-mode electrospray-ionisatiebron van het instrument voor FT-ICR-MS. Bedien het FT-ICR-instrument in de positieve ionen ESI-modus met breedbanddetectie en een gegevensacquisitiesnelheid van 1024 kilobytes per seconde. Stel de ESI-parameters doorgaans in op een capillaire electrospray-spanning van 3.900 volt.

Een spray shield-spanning van 3 600 volt, een stikstofgasstroom voor de nebulisator van twee liter per minuut, een droge stikstofgasstroom van vier liter per minuut en een temperatuur van 200 °C. Stel daarnaast de skimmer one-spanning in op 15 volt.

Stel de vluchttijd in op 0.01 seconds, de flow van het argon-botsingsgas op 0.4 liters per second, de ionaccumulatietijd van de bron op 0.1 second en de ionaccumulatietijd van de botsingscel op 0.2 seconds. Optimaliseer nu de operationele parameters van de F-T-I-C-R om de analytische gevoeligheid te maximaliseren over het massa-bereik van een massa-ladingsverhouding van 200 tot 1400, terwijl goede time-domain free induction decay-signalen behouden blijven. Neem vervolgens de ESI-massaspectra op en kalibreer het instrument met de referentiemassa's van de standaardverbindingen in de E es tuning mix-oplossing.

Om het instrument af te stellen voor MALDI-operaties, lost u meerdere aliquots van één microliter van een gemengde turine- en INE-standaardoplossing op in de matrixoplossing bij een concentratie van één Micromolar per stof en brengt u deze oplossingen direct aan op een van de weefselcoupes. Plaats de objectglas in een adapter voor weefselcoupes en schuif de adapter vanaf de MALDI-zijde in de dual ESI maldi-ionenbron. Optimaliseer vervolgens de juiste MALDI-bedrijfsparameters voor het laservermogen en het aantal lasershots voor MALDI-signaalaccumulatie voor elke massascan.

Nadat het instrument is afgestemd, gekalibreerd en geoptimaliseerd voor MALDI MSI-experimenten, wordt de fysieke locatie van een weefselcoupe die geïmageerd moet worden, in de imaging-software uitgelijnd met de vastgelegde optische afbeelding. Lijn de drie markeringen van de correctievloeistof uit met behulp van een drie-punts triangulatiemethode. Start vervolgens een gelijktijdige ESI MALDI-operatie, zodat elk massaspectrum de referentiemassa-pieken van de E ES-tuningmixoplossing bevat voor interne massakalibratie na de acquisitie.

Verzwak eerst het ESI-signaal door de capillaire spanning te verlagen totdat de MALDI-signalen overheersen in de spectra, terwijl de ESI-kalibratiesignalen nog hoog genoeg zijn voor interne massakalibratie. Stel vervolgens een geautomatiseerde methode in voor het rasteren van de laserstraling, gebruikmakend van een random spot-analyse.

Definieer de weefselregio's die moeten worden afgebeeld en stel de juiste stapgrootte voor de laser-RA in. Kalibreer de MALDI-massaspectra met behulp van interne kalibratie voor de initiële vergelijking, en selecteer pieken voor MSMS-de-isotoping en selecteer de monoisotopische pieken met behulp van een aangepast VBA-script en exporteer de resulterende lijsten met monoisotopische pieken. Voer de gemeten massa-ladingsverhouding-waarden in de Melin nine en/of de HMDB-metaboloomdatabases in voor massa-matching met de bibliotheekvermeldingen.

Genereer vervolgens MALDI-afbeeldingen voor alle gedetecteerde lipide-entiteiten over de gehele weefselsectie met behulp van imaging-software met een massafilterbreedte van één deel per miljoen bij de piekapex. Zodra er afbeeldingen zijn gegenereerd voor alle massa-ladingsverhoudingen die overeenkomen met databasevermeldingen, worden er ook afbeeldingen voor alle andere pieken gegenereerd om te zoeken naar unieke distributiepatronen die later kunnen worden onderzocht voor specifieke weefsels, zoals de lens van runderen. Er wordt vaak uitgebreide scheuring van het weefsel waargenomen wanneer direct ontdooien en monteren wordt toegepast.

Voorbehandeling van de IT OAS-dia met ethanol of mierenzuur helpt om de integriteit van de weefselsneden tijdens het monteren van het weefsel te behouden. Zowel de keuze van de matrix als de selectie van het oplosmiddel zijn belangrijke factoren die de kwaliteit van de MALDI-spectra beïnvloeden. Deze voorbeelden vergelijken een spectrum dat is geproduceerd met een efficiënt matrixoplosmiddel met een slechte keuze van matrixoplosmiddel voor diol.

Zodra de set massaspectra van een MALDI-MSI-experiment is verkregen, kan het beeld voor elk van de gedetecteerde ionen worden gegenereerd, waarbij elke pixel een laserbestralingsplek op het oppervlak van een weefselcoupe vertegenwoordigt. De relatieve concentraties van de analyten kunnen in detail worden weergegeven in de verschillende delen van de weefselcoupe.

In de meeste experimenten worden de gegevens genormaliseerd ten opzichte van de totale ionenstroom binnen elk spectrum. Zonder deze normalisatie zouden gebieden met een betere analytenmatrix of COC-kristallisatie sterkere signalen voor de analyten kunnen veroorzaken, wat de gegevens zou vertekenen. De preparatie van het weefsel kan het gegenereerde beeld eveneens drastisch veranderen.

Als het monster te nat is, zullen de analyten delokaliseren in het weefsel en gaat een groot deel van de ruimtelijke informatie verloren. Deze demonstratie van een weefselbeeldvormingsexperiment op een ooglens maakte gebruik van diol als multi Matrixx om de ruimtelijke distributie van lipiden te bepalen via F-T-I-C-R-M-S. Beeldvorming van lipiden in verschillende soorten weefsel kan op een vergelijkbare manier worden uitgevoerd met behulp van diol of een andere matrix.