Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie
26 november 2013
Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.
Deze procedure lokaliseert ruimtelijk meerdere endogene lipiden binnen een runderlens. Met behulp van de techniek van matrix-ondersteunde laser DESORPTIE ionisatie, massaspectrometrische beeldvorming. Eerst bereid een dunne runderlensweefselsectie voor en breng een multi matrixx aan, dan verwerf een maldi massaspectrale dataset.
Verwerk de dataset tot een visuele weergave van de gedetecteerde lipiden op de lensweefselsectie. Samen kunnen deze resultaten de locatie en relatieve abundantie van de lipiden binnen een runderlens bepalen en een visuele weergave van deze verdeling produceren In vergelijking met andere methoden zoals lipide-extractie gevolgd door LCMS-analyse, maakt maldi massaspectrometrie beeldvorming de visualisatie van meerdere lipiden tegelijkertijd mogelijk zonder hun ruimtelijke lokalisatie te verliezen. Verwijder de flash-bevroren weefselspecimens uit de opslag op min 80 graden Celsius.
Verwijder de capsule van het oppervlak van de lens om een hele runderlensweefselsectie te fixeren. Plaats een of twee druppels water op het snijoppervlak van een cryostaat. Plaats de lens snel in het water voordat het verstijft wanneer de cryostaat is geëquilibreerd naar de optimale temperatuur.
Snijd het weefsel equatoriaal in secties van 20 micron dikte. Gooi de eerste weefselsecties weg en gebruik alleen plakken die dicht bij of aan de equatoriale vlak zijn voor het beeldvormen van oculaire lensweefsel. Voeg 1,5 microliters azijnzuur toe om het oppervlak van een ITO-gecoate glazen plaat voor te bevochtigen.
Breng vervolgens de weefselsecties voorzichtig naar de plaat in de cryostaat. Lyofiliseer vervolgens de plaatjes gedurende 15 minuten Voor de toepassing van maldi-matrix. Gebruik een correctievloeistofpennetje om drie leermerken toe te voegen op het niet-geleidende oppervlak van de ITO-gecoate glazen plaat.
Neem nu een optische afbeelding van de weefselplaat met een flatbed-scanner en sla deze op in een geschikt formaat zoals TIFF of jpeg. Bedek eerst de randen op de voorkant van de ITO-gecoate glazen plaatjes met tape zodat de matrix de randen van de plaat niet bedekt. Bereid de matrix voor die in een geschikt oplosmiddel zal worden gebruikt.
Breng vervolgens matrixoplossingen aan op de oppervlakken van de weefselsecties. Bekleed de glazen plaat met behulp van 20 cycli van matrixcoating. Als alternatief kan een pneumatisch ondersteunde airbrush-sproeier worden gebruikt om de matrices aan te brengen als een oplosmiddel onverenigbaar is met de elektronische matrixsproeier.
Voor de massakalibratieoplossing, verdun de ES-afstemmingsmix standaardoplossing met een factor van één op 200 in 60% Isopropanol introduceer twee microliters per minuut van de verdunde ES-afstemmingsmix oplossing in de dual-modus elektrospray-ionisatie ionenbron op het instrument voor vier transform ion cyclotron resonance ms. Laat het F-T-I-C-R instrument werken in de positieve ion ESI-modus met breedbanddetectie en een gegevensverzamelinggrootte van 1024 kilobytes per seconde. Stel typisch de ESI-parameters van 3.900 volt capillaire elektrosprayspanning in.
Een sproeibeschermingsspanning van 3.600 volt, stikstofgasstroom bij de vernevelaar op twee liter per minuut. Droge stikstofgasstroom op vier liter per minuut en temperatuur van 200 graden Celsius. Stel ook de skimmer één spanning in op 15 volt.
Vluchttijd tot 0,01 seconden, botsingsargongasstroom tot 0,4 liter per seconde, bron ion accumulatietijd tot 0,1 seconde en botsingscel ion accumulatietijd tot 0,2 seconden. Stem nu de F-T-I-C-R bedieningsparameters af om de analytische gevoeligheid te maximaliseren over het massabereik van massa-ladingsverhouding 200 tot 1400 met behoud van goede tijdsdomein vrije inductie verval signalen. Verwerf vervolgens de ESI-massaspectra en kalibreer het instrument met behulp van de referentiemassa's van de standaardverbindingen in de E es-afstemmingsmix oplossing.
Om het instrument voor MALDI-werking af te stemmen, los verschillende een microliter-aliquotten van een gemengde turine en INE standaardoplossing op in de matrixoplossing met een concentratie van elk één micromolair en breng deze oplossingen direct aan op een van de monstersweefselsecties. Plaats de plaat in een weefselplaatadapter en laad de adapter vanaf de MALDI-zijde in de dual ESI maldi-ionenbron. Optimaliseer vervolgens de geschikte MALDI-bedrijfsparameters voor het laservermogen en het aantal laserschotten voor MALDI-signaalaccumulatie voor elke massascan.
Na het afstemmen, kalibreren en optimaliseren van het instrument voor maldi MSI-experimenten, lijnt u de fysieke locatie van een weefselsectie die moet worden afgebeeld, uit met zijn opgenomen optische afbeelding binnen de beeldvormingssoftware. Lijn de drie correctievloeistofpotten uit met behulp van een driepunts triangulatiemethode. Begin vervolgens met een gelijktijdige ESI MALDI-bewerking zodat elk massaspectrum de referentiemassa pieken van de E ES-afstemmingsmix oplossing bevat voor interne massakalibratie na verwerving.
Verzwak eerst het ESI-signaal door de capillaire spanning te verlagen totdat de MALDI-signalen de spectra domineren, terwijl de ESI-kalibersignalen nog steeds hoog genoeg zijn voor interne massakalibratie. Stel vervolgens een geautomatiseerde stijgmethode in voor laserstraling. Gebruik een willekeurige spotanalyse.
Definieer de weefselgebieden die moeten worden afgebeeld en stel de geschikte laser RA-stapgrootte in. Calibreer de MALDI-massaspectra met interne kalibratie voor de initiële vergelijking en selecteer pieken voor MSMS de-isotopering en selecteer de mono-isotopische pieken met behulp van een aangepaste VBA-script en exporteer de resulterende mono-isotopische pieklijsten. Voer de gemeten massa-ladingsverhoudingswaarden in in de Melin negen en/of de HMDB metabolome databases voor massa-matching met de bibliotheekvermeldingen.
Genereer vervolgens maldi-afbeeldingen voor alle lipide-entiteiten die zijn gedetecteerd over de hele weefselsectie met behulp van beeldvormingssoftware met een massafilterbreedte van één deel per miljoen bij de piekapex. Zodra afbeeldingen zijn gegenereerd voor alle massa-ladingsverhoudingen die overeenkomen met databasevermeldingen, genereer afbeeldingen voor
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het gebruik van dithranol (DT) als een MALDI-matrix voor het beeldvormen van endogene lipiden in runderlensweefsel. De methode maakt het mogelijk om meerdere lipiden ruimtelijk te lokaliseren zonder hun ruimtelijke context te verliezen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Dithranol is eerder gebruikt als een MALDI-matrix.
- MALDI-beeldvorming maakt de analyse van kleine moleculen in weefsel mogelijk.
- Endogene lipiden spelen cruciale rollen in biologische processen.
- Traditionele lipidenanalysemethoden kunnen ruimtelijke informatie verliezen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het gebruik van DT in MALDI-beeldvorming.
- Om de verdeling van lipiden in runderlensweefsel te visualiseren.
- Om MALDI-beeldvorming te vergelijken met conventionele lipidenextractiemethoden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van dunne runderlensweefselsneden.
- Toepassing van een multi-matrix voor MALDI-beeldvorming.
- Verkrijgen van MALDI-massaspectraalgegevenssets.
- Verwerking van datasetten tot visuele representaties van lipidenverdeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lokalisatie van meerdere endogene lipiden.
- Visuele weergave van lipidenovervloed en -verdeling.
- Demonstratie van ruimtelijke lokalisatievoordelen ten opzichte van LCMS.
- Inzichten in de rol van lipiden binnen de runderlens.
Conclusies
- MALDI-beeldvorming met DT is effectief voor lipidenanalyse.
- Deze methode behoudt ruimtelijke informatie van lipiden.
- Mogelijke toepassingen in verschillende biologische onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging (MALDI-IMS) enables spatial mapping of endogenous lipids in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The use of dithranol as a matrix on ultrahigh-resolution FTICR-MS improves detection of low-molecular-weight compounds while reducing chemical noise, enhancing predictive confidence in lipid biomarker identification. This approach supports assay development and screening readiness by providing reproducible, label-free molecular distributions directly from tissue, informing go/no-go decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-mediated therapeutic hypotheses by mapping endogenous lipid distributions in disease-relevant tissue models.
- Operational Value: Provides label-free, spatially resolved lipid profiles that support functional target validation and pathway de-risking.
- Predictive Value: Increases confidence in lipid target selection by reducing false positives from matrix interference through high-resolution FTICR-MS detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiplexed lipid readouts from single tissue sections, enabling parallel compound screening without spatial information loss.
- Operational Value: Delivers reproducible MALDI-IMS data through standardized matrix application (e.g., dithranol in solvent) and instrument calibration protocols.
- Assay Readiness: Supports scalable lipid screening workflows by producing stable, high-fidelity mass spectra suitable for database matching and image generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase lipid localization to preclinical validation by preserving spatial context lost in extraction-based methods like LCMS.
- Mechanistic De-risking: Clarifies lipid roles in tissue physiology (e.g., bovine lens) to inform biomarker relevance and pathway modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on spatially resolved lipid modulation patterns, reducing late-stage attrition due to unanticipated tissue-specific effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing spatially resolved lipid data that informs mechanistic understanding and assay design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing endogenous lipid dynamics in tissue sections.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible lipid profiling via standardized matrix application and FTICR-MS data acquisition.
- Analytics: Delivers high-resolution mass measurements (1 ppm mass filter width) and isotopic peak selection for confident lipid identification via HMDB or METLIN database matching.
- Translational Research: Maintains spatial continuity from discovery to preclinical work by avoiding analyte delocalization during tissue processing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable MALDI-IMS platform for lipid screening across tissue types, reducing reliance on destructive extraction methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing matrix background and resolving analyte signals via FTICR-MS.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, matrix coating (20 cycles), and internal calibration using ES tuning mix.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling parallel lipid detection in single experiments, reducing need for sequential LCMS runs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing tissue-specific lipid distributions that inform target safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue cryosectioning, matrix application, and FTICR-MS operation in dual ESI/MALDI mode.
- Depends on access to ultrahigh-resolution FTICR-MS instrumentation and optimized laser parameters for MALDI signal accumulation.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting (e.g., ITO slide pre-wetting with formic acid) to prevent delocalization.
- Involves adaptation considerations for solvent-matrix compatibility (e.g., avoiding solvents that cause tissue tearing during thaw mounting).
- Limited by tissue integrity challenges during preparation, which can be mitigated by pre-coating slides with ethanol or formic acid.
